_甘露聚糖酶产生菌的分离_鉴定及产_甘露聚糖酶最适条件的研究

enzyme ac tiv ity of 50. 37 U /m lwas obta ined a fter the enzyme activ ity assay . T he stra in was identified as P seudo m onas sp. by m orpho log ica l and physio log ica l character istics ana lysis and 16S r DNA BLAST. T he opti m a l conditions fo r producing the ac tiv ity of h ighest acid ic m annanase w as up to 185. 37 U /m , l 3. 68 ti m es as before . The stra in which rapid ly produced stra in we re deter m ined 1 g / l00 m lm a izena , 2 g /100 m l kon jak powder , pH 6 . 0 and the opti m a l temperature w as 32 mannanase activ ity after cu lturing fo r 12 h. T he study of the enzyma tic character of the
收稿日期 : 2008 12 26 基金项目 : 重庆市科技计划项目 ( 2007AC 1060 ), 重庆大学重点实验室对本科生开放创新基金 作者简介 : 黄俊丽 ( 1974 ) , 女 , 副教授 , 主要从事微生物分子学研究 ; E m ai: l huang_ jun l@ i 126 . com, Te: l 023 65120497
m annanase show ed the mannanase w as sta
mannanase revea led that it w as the
mannanase , and the opti m al condition o f the enzym e w as pH 4. 0 and 60 , respective ly . The activ ity o f m annanase Pseudomonas sp. Iso lation Identification A ctiv ity
1 材料与方法
1 1 样品来源 土壤样品从四川、 重庆等地采集。 1 2 主要试剂 NT P溶液、 PCR 缓 冲液和 M gC l 2 溶液 ( 天为时 代科技有限公司 ) , 琼脂糖 (北京 鼑国生物技术有限 责任公司 ), 1 . 5 kb DNA Ladder( 北京博大泰克生物 基因 技 术 有 限 公 司 ) , DNA 凝 胶 回 收 试 剂 盒、 p MD18 T Vector 克隆试剂盒及 T aq DNA 聚合酶及 其缓冲液 (大连宝生物工程有限公司 T aKaRa) 。 魔芋粉 ( 重庆农产品市场 ) , 甘露糖 ( 北京 鼑国 生物技术有限责任公司 ), 胰蛋白胨、 酵母 膏 ( 北京 奥博星生物技术责任有限公司 ) , 琼脂粉 ( 青岛水产 品加工厂 ), 3 , 5 二硝基水杨酸 ( DNS) ( 上海化学试 剂公司 ) , 其他试剂均为国产分析纯。 1 3 主要仪器 Apectrum lab 752S 紫外可 见光分光 光度计 ( 上 海市棱光技术有限公司 ), J 20XP 高速冷冻离心机 ( 美国 BECKMAN 公司 ) , 恒温摇床 ( 上海福玛实验 设备有 限公司 ), PCR 热循 环仪 ( Ther m o H ybaid) , V ersa Doc 1000 凝胶成像系统 ( B io Rad labo ratories Co . LTD) , 70 型离子交换纯水器 ( 上海南华医疗器 械厂 ) , A IR TECH 超净 工作 台 ( 苏 净集 团安 泰公 司 )。 1 4 培养基 富集培养基 : 魔芋粉 2 g, 酵母膏 0. 5 g, 蛋白胨 0 . 3g , N aC l 0 . 5 g, 蒸馏水 100 m 。 l 选择性分 离培养 基: 蛋 白胨 1 g, 牛肉 膏 3 g, N ac l 5 g , 魔芋粉 10 g , 琼脂 20 g, 蒸馏水 1 000 m , l p H7 . 0~ 7 . 2 。 发酵产酶培养基 : 魔芋粉 2 g , 蛋白胨 1 g, 酵母
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin
2009 年第 7 期
2009年第 7 期
黄俊丽等 :
甘露聚糖酶产生菌的分离、 鉴定及产
甘露聚糖酶最适条件的研究
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纤维素的降解, 能有效去除纺织品所粘附的多余染 料 ; 在饲料工业中用作酶添加剂 , 起到消除抗营养因 子的作用
[ 1~ 3]
粉 1 g, pH 7 . 0~ 7 . 2 , 加水至 100 m ,l 32 , 150 r/m in 振荡培养 12 h。如无特殊说明, 甘露聚糖酶的制备 均采用此培养基。 基本培 养基: N a2H PO4 12 H 2O 0 . 4 g , KH 2 PO 4 0 . 03 g, M gC l2 6 H 2O 0 . 06 g , CaC l2 2 H 2O 0 . 3 g, F e SO4 7 H 2O 0 . 001 g , Na2 CO3 0 . 25 g , 加水至 100 m l 。 1 5 方法 1 5 1 富集培养 称取 10 g 土壤样品于 250 m l锥
养分别测定其酶活力 , 其中 1 株菌株酶活力较高 , 酶活力达 50. 36 U /m 。 l 生 理生化 性质鉴 定及 16S r DNA 序列 相似性 结果பைடு நூலகம் 明该菌为假单孢菌 ( P seudo m onas sp. ) 。 产酶的最适条件研究发现 , 1 g /100 m l玉米粉 , 2 g /100 m l魔芋粉 , pH 6 . 0 , 32 为最优 产酶条件 , 酶活力达 185. 37 U /m , l 是优化前的 3. 68 倍 。 该菌产酶迅速 , 培养 12 h 后已达产酶高峰 。 粗酶的性质研究发 现 , 该 酶是一种酸性的甘露 聚糖酶 , 作用的最适 pH 为 4. 0, 最适反 应温度为 55 ; 该 酶的稳 定性较 好 , 在 pH4. 0~ 6 . 0 、 温度 为 40 ~ 55 保持较好的稳定性 。 关键词 : 甘露聚 糖酶 假单孢菌 分离 鉴定 酶活性
b le a t p H 4. 0~ 6. 0 and 40~ 55
K ey w ords :
1, 4 D 甘露聚糖酶 ( 3 . 2 . 1 . 78) , 简称
1 , 4 D m annanase, EC
本低、 活性好、 来源稳定、 作用温度和 p H 范围广及 容易提取等优点, 因此微生物来源的 甘露聚糖酶 已成为国内外研究的重要方向。该酶用途广泛, 能 分解魔芋葡甘露聚糖, 生产能促进双歧杆菌生长、 改 善肠道菌群结构的魔芋低聚糖; 可作为工具酶用于 天然多糖类结构的分析; 在造纸工业 中, 与 木聚 糖酶等半纤维素降解酶类协同使用 , 能除去纸浆中 的半纤维素, 改善纸质; 在纺织工业中用于纤维中半
。但目前低产和高成本限制了其应用
范围和规模 , 能改变这种状况的最重要的途径之一 是筛选和培育高活力 甘露聚糖酶的高产菌株。 本研究从土壤中分离出产 甘露聚糖酶的优 良菌株 , 并进行了鉴定 , 同时通过优化产酶条件提高 甘露聚糖酶的产量, 为生产应用和后续研究提供 理论依据。
形瓶中, 加入 100 m l蒸馏水 , 振荡混匀, 取 1 m l土壤 悬液接种到富集培养基中, 32 , 150 r /m in 振荡培 养 24 h 。 1 5 2 菌株的分离纯化与保藏 取 1 m l富集培养 液, 进行梯度稀释后均匀地涂布在 LB 培养基平板 上, 32 倒置培养过夜, 根据菌落的颜色和形态挑 取单菌落进行纯化培养。斜面 4 1 5 3 菌株的初筛 保存备用。 将筛选得到的单菌落点接于
Studies of the Isolation and Identification of Strain w ith and Its Enzym ology Properties
Hu ang Jun li Bao L ingxia W ang Gu ixue
( College of B iological Engineer ing, Chongq ing University, Chongq ing 400030 ) Abstrac:t
m annanase
Two strains w hich produced
mannanase w ere iso lated fro m so il by enr iching and iso lating . A stra in w ith the h igher m annanase by the , under wh ich
选择性分离培养基上, 倒置培养 24 h 后, 用 1 . 0 g /L 刚果红溶液染色 30 m in , 产 甘露聚糖酶的菌落周 围形成透明的空斑 , 背景是红色, 空斑的大小可以初 步检测酶活的高低。 1 5 4 菌株的复筛 挑取平板上透明圈明显的单 菌落 , 连续划线分 离。挑取纯 化的单菌 落接入 LB 液体培养基中 , 32 、 220 r /m in摇床培养 12 h后用 DNS法测定酶活 , 作为进一步筛选的依据。 1 5 5 培养方法和粗酶液的制备 将斜面保藏的 菌种活化 , 接入 到 LB 液体培养 基中, 32 、 150 r / m in 培养 12 h , 按 1 !100 的比例接种到发酵培养基 中, 32 、220 r /m in 培养 过 夜收 集 发 酵液 , 4 下 5 000 r /m in 离心 10 m in , 收集上清液为粗酶液。 1 5 6 甘露聚糖酶活力测定 ( 1) 甘露糖标准曲 线的绘制 : 分别取 0 . 1 , 0 . 2 , 0 . 3 , 0 . 4 , 0 . 5 , 0 . 6 , 0 . 7 , 0 . 8 , 0 . 9 , 1 . 0 m l甘露糖标准溶液于试管中 , 加水补 足至 1 . 0 m。 l 加入 3 . 0 m l DNS 试剂 , 沸水中显色 5 m in , 冷却至室温后, 加水定容 至 25 m ,l 充 分混匀。 于 550 nm 处 测 定吸 光 值 ( OD550 ), 以 甘 露 糖质 量 ( mg) 为横坐标 X, 吸光值 ( OD550 )为纵坐标 Y, 绘制标 准曲线。 ( 2)甘露聚糖酶活力测定: 将发酵液于 5 000 r/m in 离心 10 m in , 去除菌体和杂质, 上清夜为粗酶 液。取 0 . 1 m l适当稀释的粗酶液, 加入 0 . 9m l0 . 5 % (w /v)甘露聚糖溶液 ( 用 p H值 4 . 0 Na2HPO4 柠檬酸