免疫组化及特殊染色 ppt课件
合集下载
免疫组化 ppt课件
荧光显微镜或电子显微镜观察。
抗体的标记
为了使抗原-抗体可见，必须将抗体标记， 利用标记物与其他物质的反应将阳性结果放大， 并转换成可见的荧光或呈现出颜色。
免疫组化常用标记物
① 荧光素：最常用的是异硫一氰酸荧光素（FITC）呈绿色荧光；四乙基罗达明（rho—damine RB200） -橙红色荧光。
1.取材：从动物或者患者取下组织材料。 2.固定：将所需要的材料进行固定，使得组织内蛋白质迅速凝 固液（甲醛），细胞内结构和成分不再发生改变。 3.脱水：固定后的组织内进行脱水，以便石蜡的浸入。脱水用 梯度酒精进行脱水。（自动脱水机） 4.浸蜡与包埋：组织放置刚过熔点的石蜡中，然后进行包埋， 将透明后浸了蜡的组织块放到盛有熔化石蜡的模块中，并使之 凝固成蜡块。（包埋机） 5.切片与贴片：（ 组织切片机） （1）切片 （2）展片 （3）贴片
② 酶：辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）。 ③ 生物素：（Biotin） ④铁蛋白金等：主要应用于免疫电镜。 其他：如同位素（因涉及污染和防护难一般不用）
染色方法
1.直接法
用标记物（荧光素，酶等）直接标记在一抗上，标记抗体与抗原 结合。在通过显色或者荧光激发后在显微镜下观察；
2.间接法
免疫组化染色（石蜡切片）
1.烤片 65℃ 1-2h 2.常规二甲苯脱蜡，和梯度酒精水化 3.灭活内源性过氧化物酶 4.抗原修复 5.封闭 6.一抗过夜 7.加入有标记的二抗 8.显色 9.苏木素复染 10.常规梯度酒精脱水，透明，干燥 ，封片。
免疫组化应用
➢在临床上的应用 ➢在科研中的应用
在临床上的应用：
荧光素，酶标记在二抗上（二抗：抗产生一抗动物的 IgG抗体）。
3.非标记Ab桥法
免疫组化理论课 ppt课件
医学资源 9
多抗和单抗的比较
均一性，单抗的均一性很强 稳定性，单抗的稳定性较差 特异性，单抗的特异性强 重复性，单抗的重复性好
医学资源
10
主要有两大类： 1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异
24
加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅 度地提高，其机理推测可能是加热打开 了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗 原决定簇的交联，但机理目前仍然还不 是十分清楚。
医学资源
25
医学资源
26
医学资源
27
4.抗原修复液的选择
加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液 （pH6.0）, Tris (pH7-8) , EDTA(pH8.0)等, 目前 首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背 景清晰，适合于大多数抗体,Tris和 EDTA两种修 复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同 时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。
医学资源
16
1、微波修复
本实验室微波修复应用最多，特点是简单、有效， 主要根据微波发射高频能量，组织经微波幅射后， 会加速组织内部分子高速运动，抗原可完全被暴 露出来，用于浆或部分核抗原，膜抗原不用或短 时间应用。在 0.01M PH6.0 柠檬酸缓冲液 微波 修复时，温度控制在95-100℃之间维持10分钟， 不足或超过100℃达不到抗原修复最佳效果。
医学资源 20
胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓
度 及 消 化 时 间 易 控 制 ， 常 用 0.05%~0.1%, PH7.8, 37℃消化20~30′ 或更长，微波37℃ 可短时消化。 胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2% PH2.5 左右，消化 20~30′ 或更长，消化后切片应充 分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化， 破坏组织结构
多抗和单抗的比较
均一性，单抗的均一性很强 稳定性，单抗的稳定性较差 特异性，单抗的特异性强 重复性，单抗的重复性好
医学资源
10
主要有两大类： 1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产 生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异
24
加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅 度地提高，其机理推测可能是加热打开 了组织抗原因福尔马林固定所引起的抗 原决定簇的交联，但机理目前仍然还不 是十分清楚。
医学资源
25
医学资源
26
医学资源
27
4.抗原修复液的选择
加热抗原修复缓冲液有多种，如柠檬酸盐缓冲液 （pH6.0）, Tris (pH7-8) , EDTA(pH8.0)等, 目前 首选柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），优点是染色背 景清晰，适合于大多数抗体,Tris和 EDTA两种修 复液对部分抗原修复效果较强，但其染色背景同 时加深，如使用不当易造成假阳性结果的判断。
医学资源
16
1、微波修复
本实验室微波修复应用最多，特点是简单、有效， 主要根据微波发射高频能量，组织经微波幅射后， 会加速组织内部分子高速运动，抗原可完全被暴 露出来，用于浆或部分核抗原，膜抗原不用或短 时间应用。在 0.01M PH6.0 柠檬酸缓冲液 微波 修复时，温度控制在95-100℃之间维持10分钟， 不足或超过100℃达不到抗原修复最佳效果。
医学资源 20
胰蛋白酶，用于胞浆抗原，此酶较温和，浓
度 及 消 化 时 间 易 控 制 ， 常 用 0.05%~0.1%, PH7.8, 37℃消化20~30′ 或更长，微波37℃ 可短时消化。 胃蛋白酶，用于间质抗原，常用0.2% PH2.5 左右，消化 20~30′ 或更长，消化后切片应充 分洗涤，否则对组织中抗原会进行缓慢消化， 破坏组织结构
免疫组化及特殊染色ppt课件
免疫组化及特殊染色
6
与人类有关的抗原
病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。
嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。
肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。
免疫组化及特殊染色
20
IHC技术的基本操作流程
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES）
H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出
抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
免疫组化及特殊染色
5
抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。
免疫组化及特殊染色
3
2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
免疫组化技术ppt课件
免疫组化实验中常用的抗体为单克隆抗 体和多克隆抗体。单克隆抗体是一个B淋 巴细胞克隆分泌的抗体，应用细胞融合 杂交瘤技术免疫动物制备。多克隆抗体 是将纯化后的抗原直接免疫动物后，从 动物血中所获得的免疫血清，是多个B淋 巴细胞克隆所产生的抗体混合物。
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；
免疫组化的作用
组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原， 如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、 受体、酶、激素、核酸及病原体等都可 用相应的特异性抗体进检测。
7、SP反应 • 加入SP后放入37度烤箱中30 min。 • 用PBS洗5次×5 min； 8、显色 • 加入DAB（快速滴入，观察染色情况，倒掉染 液），显色时间控制在约5 min（3～10 min）， 由镜下观察颜色控制时间。0.05％DAB（避光） （1:20储备液）：5 ul 20×DAB＋0.1 ul 30% H2O2＋95 ul PBS。1%DAB储备液的配制:50mg DAB+5ml 0.05 mol/L PBS充分溶解，-20 ℃保 存。
2、细胞通透、封闭内源性过氧化物酶 • 用封闭通透液浸润切片30 min（RT避 光）。配法是用预热40 ml PBS加120ul TritonX-100（曲拉通X-100又称清洁剂） 加热几分钟后，临用前加400 ul 30％ H2O2。 • PBS溶液洗3次×3 min。 3、抗原修复暴露抗原决定族 • 切片放入0.01 M柠檬酸钠缓冲溶液 （pH6.0）后，在微波炉里高火4 min至 沸腾后，再加热约6 min×4次，每次间 隔补足液体，防止干片
4、封闭非特异性蛋白 • PBS溶液洗3次×3 min； • 将切片取出,周围水分用滤纸吸干,用组化笔在组织周 围画上圈,在圆圈内组织滴入5%羊血清（与二抗来源 一致）后放入湿盒中,室温30（10～30）min； 5、一抗孵育 • 甩去切片上的羊血清,用滤纸擦干组织周围残留血清， 直接加入已稀释的一抗（1：250、500、1000）后， 放入湿盒中室温1小时，然后4度过夜，从冰箱中取出 需37 ℃复温45 min。 6、二抗孵育 • 将一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次； • 用滤纸将圆圈周围的水吸去，加入已稀释的二抗后放 入37 ℃恒温烤箱中30 min（回收）。 • 用PBS洗5次×5 min；
免疫组化PPT课件
1.细胞膜阳性
E-cad + in membrane
Esophageal carcinoma
18
免疫细胞化学阳性结果定位分布
2. 细胞浆阳性：
GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell.
19
免疫细胞化学阳性结果定位分布
3.细胞核阳性
C-fos+ in nucleus
特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。
14
。
15
16
免疫组化阳性结果色度
弱阳性： 淡黄色 中等阳性： 棕黄色 强阳性： 棕黑色 取决于：抗原量 分布密度 方法灵敏度
17
免疫细胞化学阳性结果定位分布
肌上皮瘤。
⑴ 结蛋白（Desmin），最常用，肌细胞分化最早的标记； ⑵ 肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，６种亚型分别存在于不同
的肌细胞、肌上皮细胞 ⑶ 肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型
（快）收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白 和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。 ⑷ 肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白， 存在于分化成熟的横纹肌中。
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗 ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结 构（PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高；
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
E-cad + in membrane
Esophageal carcinoma
18
免疫细胞化学阳性结果定位分布
2. 细胞浆阳性：
GFAP+ in cytoplasm of neuroglia cell.
19
免疫细胞化学阳性结果定位分布
3.细胞核阳性
C-fos+ in nucleus
特点: ⑴ 敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）； ⑵ 背景淡，链霉亲和素更好； ⑶ 方法较简便，时间较短； ⑷ 应用范围广，也可用于原位杂交和免疫电镜。
14
。
15
16
免疫组化阳性结果色度
弱阳性： 淡黄色 中等阳性： 棕黄色 强阳性： 棕黑色 取决于：抗原量 分布密度 方法灵敏度
17
免疫细胞化学阳性结果定位分布
肌上皮瘤。
⑴ 结蛋白（Desmin），最常用，肌细胞分化最早的标记； ⑵ 肌动蛋白（Actin），属肌丝蛋白，６种亚型分别存在于不同
的肌细胞、肌上皮细胞 ⑶ 肌球蛋白（Myosin），属肌丝蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型
（快）收缩纤维，存在于心肌、横纹肌及平滑肌中，肌动蛋白 和肌球蛋白均出现在肌细胞发育分化中期。 ⑷ 肌红蛋白（Myoglobin），是心肌和横纹肌结合氧的肌红蛋白， 存在于分化成熟的横纹肌中。
既 过 氧 化 物 酶 抗 过 氧 化 物 酶 复 合 物 法 (Perixidase Antiperoxidase Complex Method,PAP) 先将过氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗 ＨＲＰ；然后再与ＨＲＰ结合，形成一个稳定的多角形结 构（PAP）。 特点：⑴ 敏感性较高；
⑵ 背景染色低（相对）； ⑶ 双PAP敏感性更高，但背景相对较重。
免疫组化课件PPT课件
李
三 华
特点
优点
特异性强，定位准；
结果直观；
形态学改变与功能和代谢相结合；
组织标本可用石蜡保存进性回顾性研究。
缺点
步骤多，影响实验成败的因素多；
以定位、定性和半定量研究为主，绝对定量
分析尚需标准化。
第四页，共28页。
中
心
实
验
室 李 三 华
二 免疫组化技术的基本步骤
1.制片
组织切片(石蜡切片、冰冻切片)
IHC,WB,FC,ELISA,IP； 石蜡切片(IHC－P),冰冻切片(IHC－Fr),
甲醛固定冰冻切片（IHC-FoFr）。 (5)与抗原结合的部位
亚型， C-或N-，胞外区域或胞内区域。 （6）公司，价格。
第十七页，共28页。
中
心
实
验 室 李 三
国外主要抗体试剂公司
华
用途
公司
用途
最全 离子通道
李
三
华
常用酶
辣根过氧化物酶（ Horseradise peroaidase，HRP)
底物：DAB(四盐酸二氨基联苯胺)，产物为棕褐色。
碱性磷酸酶（Alkatine phasphotase, AP）
底物：NBT（四氮唑蓝），产物为紫蓝色。
葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase,GOD）
底物：葡萄糖，产物为蓝色。
第二页，共28页。
中
心 实 验 室
李
应用
三
华
凡是组织细胞内具有抗原性的物质
（肽类、蛋白质、细胞因子、受体、激素
、神经递质、核酸、表面抗原）或抗体均
可用免疫组织化学方法显示而进行定性、
定位分析或定量研究，进而深入研究其
免疫组化 ppt课件
（2）细胞固定 离心→涂片→固定5到10分钟→漂洗→组化
（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此步骤。
1、包埋
定义：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变 硬（利于切片）的过程。石蜡包埋适于 绝大多数组织学和组化技术。
2、常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
(二) 内源性酶的消除方法
1、内源性过氧化物酶的消除方法 1） 0.3～3% H2O2甲醇溶液浸泡20min 2） 3％ H2O2溶液浸泡20min
2、内源性碱性磷酸酶的消除方法
左旋咪唑 （24mg/ml）加入底物液 中,并保持pH7.6-8.2。
（三）抗原修复
1、目的 暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期 formalin固定的标本、石蜡包埋标本。
2、修复液 10mM，pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液
3、常用的修复方法有
1） 微波加热 2） 高压锅处理 3） 酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶(含0.1%
CaCl2，pH7.8)，37℃ 10min(细胞内抗原)或 0.4%胃 蛋白酶，37℃ 30min以上(细胞间抗原)。
（四）封闭
采用正常二抗来源的动物血清封闭，以 减少一抗非特异性结合。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
直接法特点：1、此法特异性高，但敏感性低； 2、每种抗体均需单独标记，使用不便。
间接法特点： 1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异 性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动 物的二抗。
常用的免疫组化方法
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 （avidin-biotin-peroxidase complex technique， 简称ABC法）。
（三）组织的脱水、浸蜡、包埋和切片
前三步只用于石蜡切片，冰冻切片不需此步骤。
1、包埋
定义：脱水透明后，用石蜡、火棉胶、 环氧树脂等支持剂透入组织内部使之变 硬（利于切片）的过程。石蜡包埋适于 绝大多数组织学和组化技术。
2、常规石蜡包埋过程
(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ
(二) 内源性酶的消除方法
1、内源性过氧化物酶的消除方法 1） 0.3～3% H2O2甲醇溶液浸泡20min 2） 3％ H2O2溶液浸泡20min
2、内源性碱性磷酸酶的消除方法
左旋咪唑 （24mg/ml）加入底物液 中,并保持pH7.6-8.2。
（三）抗原修复
1、目的 暴露被交联封闭的Ag。主要适用于经长期 formalin固定的标本、石蜡包埋标本。
2、修复液 10mM，pH 6.0的枸橼酸钠缓冲液
3、常用的修复方法有
1） 微波加热 2） 高压锅处理 3） 酶消化处理 ：常用0.1%的胰蛋白酶(含0.1%
CaCl2，pH7.8)，37℃ 10min(细胞内抗原)或 0.4%胃 蛋白酶，37℃ 30min以上(细胞间抗原)。
（四）封闭
采用正常二抗来源的动物血清封闭，以 减少一抗非特异性结合。
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
直接法特点：1、此法特异性高，但敏感性低； 2、每种抗体均需单独标记，使用不便。
间接法特点： 1、敏感性较直接法高3-4倍，但特异 性较低；2、不必标记每种一抗，只需标记某一种动 物的二抗。
常用的免疫组化方法
（一）亲和素-生物素-过氧化物酶复合物技术 （avidin-biotin-peroxidase complex technique， 简称ABC法）。
免疫组化PPT精选课件
20
2. B 细胞
● 静止B细胞 SIg(G、M、D), CD19-22、CD24、 Ia（HLA-D）
● 活化B细胞 CD23（Blast-2, BCGF) CD25(IL-2R)
● 其他标志 CD80、CD86
21
3.NK细胞
CD11b、CD11c、CD16、CD35、CD57、CDw122等
38
四. 肿瘤的病理诊断
39
㈠ 组织相ed marker)
又称组织特异性标志物 ( specific tissue marker) 用于区分肿瘤的组织来源
40
表1. 上皮细胞常用标志物
------------------------------------------------------------------------------
45
2.间叶组织类抗原
间叶细胞性: 波形蛋白（Vm）－ 间叶性肿瘤
Vm ( 结肠间质 )
Vm ( 恶性纤维组织细胞瘤 ) 46
肌源性: 结蛋白( Dm ) － 肌源性肿瘤 肌动蛋白( actin ) － 肌源性肿瘤 肌凝蛋白( myosin )－ 骨骼肌 肌红蛋白( myoglobin，MGB )－ 横纹肌肿瘤
29
● 移植物排异反应 血管壁 － IgG、C3沉积 肾小球 － 复发性肾炎
● 其他自身免疫性疾病 混合性结缔组织病：血管、 肾小球内IgG、C3沉积 硬皮病：结缔组织、 血管壁IgG沉积
硬皮病 30
三. 修复、纤维化机制的研究
肉芽组织是不完全性修复的物质基础
31
常见疾病
A粥样硬化 － 冠心病 肝硬化 － 肝昏迷、上消化道大出血 肾小球硬化 － 肾功能衰竭 肺纤维化 － 肺心病、肺性脑病
2. B 细胞
● 静止B细胞 SIg(G、M、D), CD19-22、CD24、 Ia（HLA-D）
● 活化B细胞 CD23（Blast-2, BCGF) CD25(IL-2R)
● 其他标志 CD80、CD86
21
3.NK细胞
CD11b、CD11c、CD16、CD35、CD57、CDw122等
38
四. 肿瘤的病理诊断
39
㈠ 组织相ed marker)
又称组织特异性标志物 ( specific tissue marker) 用于区分肿瘤的组织来源
40
表1. 上皮细胞常用标志物
------------------------------------------------------------------------------
45
2.间叶组织类抗原
间叶细胞性: 波形蛋白（Vm）－ 间叶性肿瘤
Vm ( 结肠间质 )
Vm ( 恶性纤维组织细胞瘤 ) 46
肌源性: 结蛋白( Dm ) － 肌源性肿瘤 肌动蛋白( actin ) － 肌源性肿瘤 肌凝蛋白( myosin )－ 骨骼肌 肌红蛋白( myoglobin，MGB )－ 横纹肌肿瘤
29
● 移植物排异反应 血管壁 － IgG、C3沉积 肾小球 － 复发性肾炎
● 其他自身免疫性疾病 混合性结缔组织病：血管、 肾小球内IgG、C3沉积 硬皮病：结缔组织、 血管壁IgG沉积
硬皮病 30
三. 修复、纤维化机制的研究
肉芽组织是不完全性修复的物质基础
31
常见疾病
A粥样硬化 － 冠心病 肝硬化 － 肝昏迷、上消化道大出血 肾小球硬化 － 肾功能衰竭 肺纤维化 － 肺心病、肺性脑病
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Cell Signaling Technology（CST）、 罗氏公司（Roche）
2020/11/29
11
标记物
它借助于荧光素、酶等标记抗体 与组织切片或细胞涂片中相关抗原相 结合，由于荧光素所发荧光可用荧光 显微镜检出，而酶可经一定的显色处 理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准 确定位欲测定的抗原物质。
2020/11/29
5
2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
2020/11/29
6
（二）免疫组织化学的原理
定义:是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体 特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光 素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多 肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫 组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技 术(immunocytochemistry)。
2020/11/29
19
特点： 特异性强 灵敏度高 定位准确和简便快速等优点 又能够将形态、功能及代谢的研 究有机结合起来。
2020/11/29
20
IHC方法
1 过去用过的方法——ABC法，SP法。——三步 法，使用生物素
2 目前最常用的方法——二步法： EnliVision 显色系统（即用型非生物素免疫组化 EnliVisionTM plus检测试剂盒 ）
一抗孵育，TBS漂洗
二抗孵育，TBS漂洗
DAB显色，蒸馏水中止反应
苏木素复染及封片 2020/11/29
23
切片
烤片
脱蜡水化
H2O2处理
热修复
二抗 E2n0l2i0v/1i1s/2i9on试剂
DAB显色
一抗 苏木素复染
24
IHC染色结果的判读原则
2020/11/29
25
I. 注意影响IHC结果判读Байду номын сангаас因素
2020/11/29
12
荧光素、酶
标 记
抗体
组织抗原 抗体 酶 荧光素
抗原
荧 光
阳性色彩
显微镜观察
2020/11/29
13
No Image
2020/11/29
14
三大系统 本技术是应用免疫学原理 来识别待测抗原，再通过酶和底物 的作用外加显色剂，将上述反应显 示出来。
2020/11/29
15
免疫组 织化学
同种异体抗原 动物免疫血清
2020/11/29
9
抗体（antibody）指机体的免疫系统在 抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应 抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
2020/11/29
10
世界著名抗体公司
Santa公司、Abcam公司、 Abgent公司、Proteintech Group、
免疫组织化学技术 Immunohistochemistry
techniques
2020/11/29
1
第一节 免疫组织化学 技术概述
2020/11/29
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
2020/11/29
识别系统
联结系统
显示系统
16
识别系统是指特异性抗体识别组织 或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特 异性结合是本技术的基本依据。
2020/11/29
17
联结系统由联结抗体构成。它的作 用是联接识别系统和显示系统。
2020/11/29
18
显示系统的目的是使抗原抗体间的 特异性结合变为肉眼可见。因此显 示系统由标记酶，底物和显色剂组 成，以在靶抗原存在位点上形成有 色沉淀。
将多个抗鼠和抗兔的IgG分子二抗与辣根过氧 化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大 分子多聚体（polymer），直接放大信号40-50 倍。
敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生 物素干扰）。
2020/11/29
21
IHC方法
3 最新一代的免疫组化 Novolink Polymer法： 使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍 ，比传统中的大分子聚合物染色更显著），信 号放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗 原。
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
4
（一）发展简史
1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术运用铁 蛋白标记Ab技术
70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
2020/11/29
7
抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
2020/11/29
22
IHC技术的基本操作流程
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES）
H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出
抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断
2020/11/29
8
与人类有关的抗原
病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。
嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。
肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。
2020/11/29
11
标记物
它借助于荧光素、酶等标记抗体 与组织切片或细胞涂片中相关抗原相 结合，由于荧光素所发荧光可用荧光 显微镜检出，而酶可经一定的显色处 理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准 确定位欲测定的抗原物质。
2020/11/29
5
2000年以后各种免疫组化技术更加成熟, 使免疫组化技术成为当今生物医学中形 态、功能代谢综合研究的一项有力工具。 其应用范围深达医学各个学科，是目前 生命科学工作者应该掌握的基本技术之 一。
2020/11/29
6
（二）免疫组织化学的原理
定义:是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体 特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光 素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多 肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫 组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技 术(immunocytochemistry)。
2020/11/29
19
特点： 特异性强 灵敏度高 定位准确和简便快速等优点 又能够将形态、功能及代谢的研 究有机结合起来。
2020/11/29
20
IHC方法
1 过去用过的方法——ABC法，SP法。——三步 法，使用生物素
2 目前最常用的方法——二步法： EnliVision 显色系统（即用型非生物素免疫组化 EnliVisionTM plus检测试剂盒 ）
一抗孵育，TBS漂洗
二抗孵育，TBS漂洗
DAB显色，蒸馏水中止反应
苏木素复染及封片 2020/11/29
23
切片
烤片
脱蜡水化
H2O2处理
热修复
二抗 E2n0l2i0v/1i1s/2i9on试剂
DAB显色
一抗 苏木素复染
24
IHC染色结果的判读原则
2020/11/29
25
I. 注意影响IHC结果判读Байду номын сангаас因素
2020/11/29
12
荧光素、酶
标 记
抗体
组织抗原 抗体 酶 荧光素
抗原
荧 光
阳性色彩
显微镜观察
2020/11/29
13
No Image
2020/11/29
14
三大系统 本技术是应用免疫学原理 来识别待测抗原，再通过酶和底物 的作用外加显色剂，将上述反应显 示出来。
2020/11/29
15
免疫组 织化学
同种异体抗原 动物免疫血清
2020/11/29
9
抗体（antibody）指机体的免疫系统在 抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增 殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应 抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。
2020/11/29
10
世界著名抗体公司
Santa公司、Abcam公司、 Abgent公司、Proteintech Group、
免疫组织化学技术 Immunohistochemistry
techniques
2020/11/29
1
第一节 免疫组织化学 技术概述
2020/11/29
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
2020/11/29
识别系统
联结系统
显示系统
16
识别系统是指特异性抗体识别组织 或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特 异性结合是本技术的基本依据。
2020/11/29
17
联结系统由联结抗体构成。它的作 用是联接识别系统和显示系统。
2020/11/29
18
显示系统的目的是使抗原抗体间的 特异性结合变为肉眼可见。因此显 示系统由标记酶，底物和显色剂组 成，以在靶抗原存在位点上形成有 色沉淀。
将多个抗鼠和抗兔的IgG分子二抗与辣根过氧 化物酶通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个大 分子多聚体（polymer），直接放大信号40-50 倍。
敏感、省时、方便、背景低（避免了内源性生 物素干扰）。
2020/11/29
21
IHC方法
3 最新一代的免疫组化 Novolink Polymer法： 使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍 ，比传统中的大分子聚合物染色更显著），信 号放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗 原。
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
4
（一）发展简史
1941年Coons首先用荧光素标记抗体检测 肺组织内的肺炎双球菌获得成功。
60年代Nakane建立酶标抗体技术运用铁 蛋白标记Ab技术
70 、80年代多位科学家改良上述技术， 建立辣根过氧化物酶--抗过氧化物酶 （PAP）技术,抗生物素—生物素（ABC） 法使免疫组织化学进入了应用阶段。
将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记， 在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体 复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作 用，进一步提高了免疫技术的敏感性。
2020/11/29
7
抗原是指能够刺激机体产生（特异性） 免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和 致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫 效应（特异性反应）的物质。抗原的基 本特性有两种，一是诱导免疫应答的能 力，也就是免疫原性，二是与免疫应答 的产物发生反应，也就是抗原性
2020/11/29
22
IHC技术的基本操作流程
EnliVision法的工作程序：
切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸， APES）
H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出
抗原决定簇），TBS漂洗
内源性过氧化物酶的阻断
2020/11/29
8
与人类有关的抗原
病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行 预防接种，可以提高人的免疫力。
嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人 以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。
肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发 的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性 抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤 中心存在着与病毒密切相关的抗原。