酶工程实验doc
酶工程实验
实验一淀粉酶的提取及活力测定一、实验目的淀粉酶几乎存在于所有植物中，其中以禾谷类种子的淀粉酶活性较强。
水稻萌发时淀粉酶活性最强。
水稻萌发时淀粉活性的大小与种子萌发力有关。
本实验通过对水稻萌发期淀粉酶活性测定，学习和掌握淀粉酶的测定方法，了解水稻生长与之代谢的关系。
二、原理淀粉酶能将淀粉水解成麦芽糖，由于麦芽糖能将3，5-二硝基水杨酸试剂还原成3-氨基-5-硝基水杨酸的橙红色化合物，且在一定范围内还原糖的浓度与反应液的颜色成正比，故利用比色法可求出麦芽糖的含量。
以5分钟内每克样品水解产生麦芽糖的毫克数表示酶活性的大小。
植物淀粉酶可分为α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中β-淀粉酶不耐热，在温度70℃以上易钝化：而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下则发生钝化。
根据以上特性，可分别测定这两种淀粉酶的活性。
如测定α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性，即为淀粉酶总活性。
三、实验材料、仪器及试剂1．仪器：20ml具塞试管移液管 100ml容量瓶石英砂研钵721型分光光度计离心机恒温水箱离心管2．试剂：（1）1%淀粉溶液：称1.0克可溶性淀粉，加入100ml蒸馏水煮沸。
（临用时配制）（2）pH5.6柠檬酸缓冲液：A、称取柠檬酸21.0克，溶解后定容至1000ml；B、称取柠檬酸钠29.4克，溶解后定容至1000ml；量取A液55ml与B液145ml混匀，即为pH5.6的缓冲液。
（3）0.4mol/L氢氧化钠溶液。
（4）3,5-二硝基水杨酸试剂：取1.0克3,5-二硝基水杨酸，溶于20ml 2mol/L氢氧化钠中，加入50ml蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100ml，盖紧瓶盖，勿使二氧化碳进入。
（5）麦芽糖标准溶液：称取0.1000克麦芽糖，溶于少量蒸馏水中，然后定容至100ml，取为1mg/ml麦芽糖标准液。
实验材料：萌发水稻种子。
四、实验方法1．酶液的制备：称取去根萌发水稻种子2克（含外壳），置研钵中，加1克石英沙研磨成匀浆。
酶工程实验报告三(纤维素酶最适反应pH值的测定)
本科学生实验报告学号104120440 姓名孙永升学院—生命科学学院专业、班级10生物技术实验课程名称酶工程< 实验>教师及职称_______ 李俊俊< 讲师>开课学期2012 至2013 学年第二学期填报时间2013 年 4 月24 日云南师范大学教务处编印1、实验目的掌握酶最适pH值的测定方法及原理2、实验仪器、试剂和溶液:A 2仪器：紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅（4台）、试管架（1个）、1ml移液管（1 根）、10ml移液管（1根）、玻璃棒（1根）、1000ml烧杯（1个）、500ml烧杯（2个）、1000ml容量瓶（1个）、洗耳球（1个）、标签（若干）等。
B2试剂和溶液①DNS试剂（CMCA-DNS ）:称取3,5 一二硝基水杨酸（10士0.1） g,置于约600mL水中,逐渐加入氢氧化钠log,在50C水浴中（磁力）搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚（重蒸）2g和无水亚硫酸钠5g,待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL,过滤。
贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。
②乙酸-乙酸钠缓冲液，0.01mol/L③CMC-Na溶液（底物溶液）④纤维素酶液（pH4 .8和pH6 .0）。
3、实验原理及实验流程或装置示意图：A 3原理：pH值对酶反应速度有显著影响。
每一种酶都有一个特定的最适反应pH值，在此pH值下酶反应速度最快，而在此pH值两侧酶反应速度都会受到影响而放缓。
因为酶蛋白是两性电解质，具有许多可解离基团，在不同的酸碱环境中这些基团的解离状态不同，所带电荷不同，而他们的解离状态对保持酶的结构，底物与酶的结合能力以及催化能力都有重要作用。
表现酶最大活性的pH值即为该酶的最适pH值。
不同的酶其最适pH 值不同。
pH与酶活性关系的测定是在其它条件（如底物浓度、酶浓度、反应温度等）恒定的最适情况下，选用一系列变化的pH环境中进行初速度测定，其图形一般为钟形曲线。
酶工程实验
实验一考马斯亮蓝G-250测蛋白含量一、实验目的：学习常用的测定蛋白质含量的方法。
二、原理考马斯亮蓝G250（R250）具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质中碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族的氨基酸残基通过疏水作用结合后变为蓝色，染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm。
它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。
反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。
在0.01 ～1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595值成正比。
所以常用来测定蛋白质含量。
三、试剂与仪器①标准蛋白溶液（牛血清蛋白1.0mg/ml）②考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G-250 100ｍg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混匀，配成原液。
临用前取原液15mL，加蒸馏水至100mL，用粗滤纸过滤后，最终浓度为0.01%③仪器：分光光度计，旋涡混合器四、实验步骤1、配制标准蛋白溶液（牛血清清蛋白BSA：2.0mg/ml），每组10ml，2、考马斯亮蓝G-250溶液（终浓度0.01%），3、取12支试管，分为三组平行，按表中顺序加入标准蛋白溶液，水和试剂：即分别向各管中加入标准蛋白溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml；然后补充去离子水到0.1ml；最后各管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250。
每加完一管立刻在旋涡混合器上混匀（注意不要太剧烈）。
4、放置5min后，在分光光度计上测定样品的光吸收值A595（1号管为空白对照）。
5、用标准蛋白的量为横坐标，用A595为纵坐标，作标准曲线图，由此曲线，根据后续试验测出的未知样品的A595值，可查出未知样品的蛋白质含量。
6、实验结果分析：误差分析，为什么出现这样的结果，什么原因导致的？实验二3,5－二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活力一、实验目的：学习DNS测定还原糖的方法二、实验原理：还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
酶工程实验报告册
酶工程实验报告册实验目的本次实验旨在通过酶工程技术，利用已知的酶催化反应，研究酶的可控性和催化效率，以此为基础进一步探讨酶工程在生物技术领域中的应用。
实验材料* 酶底物：葡萄糖溶液* 酶：葡萄糖酶* 实验器材：试管、显微镜、荧光分析仪实验步骤1. 准备实验器材和试剂，保证实验环境的洁净。
2. 将葡萄糖底物溶液放入试管中，分为十组，每组添加不同浓度的葡萄糖底物。
3. 将葡萄糖酶加入到每个试管中，调整酶的浓度。
4. 将试管放入恒温水浴中，使反应温度稳定在适宜的酶活性温度。
5. 设置实验时间，每隔一定时间取出一组试管进行荧光分析，记录反应速率。
实验结果根据实验数据得到以下结果：* 反应速率与底物浓度呈正相关关系，随着底物浓度的增加，反应速率也增加。
* 酶活性随着温度的增加呈增加趋势，但超过酶的适宜温度范围后，酶活性会急剧下降。
结果分析本实验结果表明葡萄糖酶催化反应具有高度的可控性和催化效率。
随着底物浓度的增加，酶催化反应速率增加，这可以为工业生产中的底物转化提供重要参考。
而温度对酶活性的影响也表明了酶工程中合适的条件选取的重要性，过高或过低的温度都会影响酶的活性，从而降低反应效率。
实验结论通过本次实验，我们验证了酶工程技术在酶催化反应中的重要作用。
酶工程技术不仅可以提高反应效率，还可以调控酶的活性和特异性，从而对底物进行选择性催化。
这对于工业生产和医药研发有着重要的意义。
实验心得通过本次实验，我深刻认识到酶工程技术在生物技术领域的重要性。
酶工程技术可以帮助我们解决传统催化反应过程中的瓶颈问题，提高反应的效率和选择性。
同时，酶工程技术还为制定合适的反应条件提供了理论依据，进一步推动了生物技术的发展。
总之，酶工程技术的应用前景广阔，未来可以在医药、食品、环境等多个领域中发挥重要作用。
酶工程实验指导
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
酶工程实习报告
实习报告实习单位：XX生物科技有限公司实习时间：2021年6月1日至2021年8月31日实习内容：酶工程一、实习背景及目的作为一名生物技术专业的学生，我一直对酶工程领域充满兴趣。
酶工程是一门应用生物化学、微生物学和分子生物学等知识，通过现代生物技术手段对酶进行改造和应用的学科。
本次实习旨在让我深入了解酶工程的基本原理、技术方法和实际应用，提高我的实践能力和创新能力。
二、实习内容及心得1. 酶的筛选与改造在实习过程中，我参与了酶的筛选与改造项目。
首先，我们通过文献调研和实验室现有资源，选择了适合目标反应的酶。
然后，利用PCR技术对酶的基因进行克隆，并通过基因编辑技术对酶的氨基酸序列进行改造，以提高其催化活性和稳定性。
此外，我还学会了使用各种生物信息学工具对酶的三维结构进行预测和分析，为酶的改造提供理论依据。
2. 酶的表达与纯化在酶的筛选与改造过程中，我了解了酶的表达与纯化技术。
我们选用大肠杆菌作为宿主细胞，通过优化表达载体和培养条件，实现了酶的高效表达。
然后，采用凝胶过滤层析、离子交换层析和亲和层析等方法对酶进行纯化，以获得高纯度的酶制剂。
在此过程中，我掌握了各种层析技术的原理和操作技巧，并学会了使用相关设备进行实验操作。
3. 酶的应用与评价在酶的应用与评价方面，我参与了多个实际项目的研发。
例如，我们将筛选到的酶应用于生物制药、食品加工和环境保护等领域，评估其催化效果和实用性。
此外，我还参与了酶的动力学实验，通过测定酶的米氏常数（Km）和最大催化速率（Vmax），评估酶的催化性能。
这些实验让我深刻认识到酶在实际应用中的重要性和潜力。
4. 实习收获通过本次实习，我不仅掌握了酶工程的基本原理和技术方法，还提高了自己的实践能力和创新能力。
在实习过程中，我学会了查阅文献、分析实验数据和撰写实验报告。
同时，与导师和同事们的交流与合作，使我更加熟悉了实验室的运作方式和团队协作的重要性。
总之，本次实习让我在酶工程领域取得了丰硕的成果，为今后的学术研究和职业生涯奠定了基础。
关于酶工程实验报告
一、实验目的1. 理解酶工程的基本原理和实验方法。
2. 学习酶的制备、纯化和活性测定等实验技术。
3. 掌握酶的催化特性和应用。
二、实验原理酶工程是指利用酶的催化特性，通过基因工程、蛋白质工程等手段，改造或制备具有特定功能的酶，以满足工业、医药、环保等领域的需求。
本实验通过制备、纯化和活性测定等方法，研究酶的催化特性和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酶源（如淀粉酶、蛋白酶等）、底物（如淀粉、蛋白质等）、缓冲液、指示剂等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、紫外分光光度计、酶标仪等。
四、实验步骤1. 酶的制备（1）酶源培养：将酶源接种于培养基中，在适宜条件下培养，使其大量繁殖。
（2）酶提取：将培养好的酶源进行离心分离，收集上清液。
（3）酶浓缩：采用透析、超滤等方法，去除酶液中的杂质，提高酶的浓度。
2. 酶的纯化（1）离子交换层析：根据酶的等电点，选择合适的离子交换树脂，进行酶的吸附和洗脱。
（2）凝胶过滤层析：根据酶的分子量，选择合适的凝胶过滤柱，对酶进行分离和纯化。
3. 酶的活性测定（1）酶活力单位：采用紫外分光光度法测定酶的活性。
（2）酶催化反应速率：测定酶催化底物反应的速率，计算酶的活力。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在不同温度下测定酶的活性，研究温度对酶活性的影响。
（2）pH对酶活性的影响：在不同pH值下测定酶的活性，研究pH对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶的制备通过酶源培养、酶提取和酶浓缩等步骤，成功制备了酶液，酶浓度达到实验要求。
2. 酶的纯化通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了酶，纯度达到95%以上。
3. 酶的活性测定酶活力单位为：X U/mL；酶催化反应速率为：Y mol/min。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在30℃时，酶活性最高，随着温度升高，酶活性逐渐降低。
（2）pH对酶活性的影响：在pH 7.0时，酶活性最高，随着pH值的变化，酶活性逐渐降低。
酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)
精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5实验处理
A 5实验现象、数据及观察结果
A 5.1标准曲线的测量结果：如表四：
试管编号
0
1
2
3
4
5
OD（540nm）值
—
0.0595
0.2135
0.345
0.493
B 4.2滤纸条的准备：
①将待用滤纸放入(硅胶)干燥器中平衡24h:
②将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为(50士05)mg的滤纸条，折成M型备用。
B4.3操作步骤:
①取三支25mL刻度具塞试管(一支空白管，二支样品管)。实验中分为两组：pH
4.8与pH6.0。pH 4.8酶液稀释到1000倍，pH 6.0酶液稀释到5000倍。
步骤7
加入0.5mL待测酶液，
沸水浴煮沸10min
沸水浴煮沸10min9
加蒸馏水定容至25mL，混匀
步骤10
OD540nm比色
（注意：OD =（A+B）/ 2，比色前根据具体情况稀释相应的倍数。）
表二
D4.4羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定操作流程:如表三所示：
XX
XX
1、实验目的
1.1学习并了解纤维素酶的基本特性；
1.2学习酶活力的测定方法；
1.3学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法；
1.4学会对实验数据的处理及实验报告的撰写；
2、实验仪器、试剂和溶液：
A2仪器：
A2.1滤纸酶活力(FPA)的测定中仪器：除普通实验室仪器外，还应有:分光光度计、酸度计精度士0.01 pH、恒温水浴(50士0.l)0C、分析天平感量0.1mg、磁力搅拌器、秒表或定时钟、沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)、具塞刻度试管25mL。
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酶工程实验指导实验一从植物材料中提取制备过氧化物酶一．实验目的学习从植物材料中制备过氧化物酶的方法，了解纯化酶的一些基本步骤。
比较不同植物材料过氧化物酶的含量与活性，掌握酶纯化的相关计算方法。
二．实验原理过氧化物酶（EC 1. 11. 1. 7）是一类以铁卟啉为辅基的氧化酶，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，在工业上也广泛被应用。
过氧化物酶可溶于水，溶解度约为5%（W/V），溶液呈棕红色，透明。
此酶可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液，而在0.62饱和度以上则不溶。
该酶能催化愈创木酚反应产生有色物质：以此可进行酶活性的测定。
许多植物如辣根、柑桔叶子、白萝卜等含有较多的过氧化物酶，在这些植物材料的溶出物中，加入不同浓度的硫酸铵进行分段盐析，对过氧化物酶进行粗提，然后用有机溶剂沉淀、结晶等方法可对该酶进行纯化，得出较纯的制品。
三．主要仪器与试剂仪器：组织捣碎机，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，紫外-可见分光光度计等。
试剂：愈创木酚，丙酮，过氧化氢，硫酸铵等。
四．实验步骤（尽量在冰浴中进行）鲜植物样品约70克，剪碎或捣烂，加少许水研磨成浆（可用捣碎机），转移到500ml的烧杯中，加水至约200ml，于冰箱中浸提约2小时（中间多次搅动）。
多层纱布挤压过滤后离心（4000rpm），10ml上清液用来测酶活力，其余上清液按226克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置1小时以上，离心(4000rpm)去沉淀。
上清液再按258克/升加硫酸铵盐析，冰箱中静置4小时以上。
离心收集沉淀，用水溶解至约10ml，用水透析去盐，离心去沉淀，取部分酶液稀释后测酶活。
其余酶液用作精制样品。
在搅动下沿着杯壁加入一倍体积预冷(-15℃)的丙酮于酶液中，混匀，静置10分钟，低温离心(8000rpm, 4℃) 去沉淀。
按上清液与丙酮之比为1比0.8再次加入预冷丙酮，静置10分钟后离心(8000rpm, 4℃) 收集沉淀，溶于少量水中，透析去丙酮。
测酶液的酶活，冷冻干燥酶液得较纯的酶制品。
五．过氧化物酶活力测定按下表于试管中加入试剂（ml）管号0.2M磷酸缓冲液pH6.00.05%愈创木酚酶液0.04%过氧化氢水1 2 3 11111111在37℃保温10分钟。
管1 作为对照在时间扫描470nm调好零点，混合管2与管3，即倒入比色杯中进行470nm的时间扫描，读取30或60秒时（直线部分）的O.D.值。
测定O.D.280和O.D.260，计算出蛋白质含量。
以O.D.470/mg蛋白质×分表示酶比活和以O.D.470/克鲜重×分表示酶活性。
注意酶液一定要稀释到合适的浓度才能准确测定酶活。
测定前要摸索出较好的酶液稀释度。
计算酶活时要特别注意稀释倍数的计算。
六．思考题：1. 纯化前后酶比活的变化说明什么？2．纯化前后酶活性（O.D.470/克鲜重×分）的变化又说明什么？实验二溶菌酶制剂的制备及其活力测定一．实验目的通过实践学习制备溶菌酶制剂的方法，了解酶制剂制备中常用的技术和方法的多样性。
掌握溶菌酶活力测定的基本原理和方法。
二．实验原理溶菌酶用途广泛。
鸡蛋清中存在有多种蛋白质，溶菌酶为其中含量较丰富的蛋白之一。
在接近中性条件下，溶菌酶容易被阳离子交换树脂吸附从而可与多种蛋白分离。
经过盐析和自结晶可进一步纯化溶菌酶。
溶菌酶能水解和破坏细胞壁，使细菌溶解，利用单位时间内菌体的溶解速度可以测定溶菌酶的活力。
三．主要仪器、材料与试剂仪器：研钵，布氏漏斗，冰箱，真空冷冻干燥机，离心机，搅拌机，水浴锅，紫外-可见分光光度计等。
材料与试剂：鸡蛋要蛋清，溶壁微球菌冻干粉，“724”树脂，硫酸铵，配制磷酸缓冲液的试剂，盐酸，NaOH，EDTA等。
四．操作步骤1. 树脂处理市售“724”树脂用水漂洗去掉细微杂质，用1mol/L NaOH浸泡3小时以上并间歇搅拌，去碱液，用水洗至pH7.5左右。
用1mol/L盐酸浸泡3小时以上并间歇搅拌，去酸液，用水洗至pH5.5左右。
水浸泡12小时以上pH不低于5.0时可去掉水，用2 mol/L NaOH快速浸泡搅拌即去掉碱液，调树脂pH至约6.5（泡树脂的水），若pH高于6.5，则需用盐酸洗树脂至pH6.5附近。
用pH6.5、0.15 mol/L 磷酸缓冲液浸泡树脂过夜，如pH下降，则用碱液调回pH为6.5，冷藏备用。
2. 树脂吸附鸡蛋清预冷至0℃左右，取约50ml，记录确切体积置于烧杯中。
将树脂于布氏漏斗上用pH6.5、0.15 mol/L磷酸缓冲液淋洗一遍抽干，取12g在不断搅拌下加入冷的蛋清中，继续以搅拌器搅拌1h以上，4℃静置过夜。
3. 洗脱与盐析倾去上层蛋清，用水二、三次和用pH6.5、0.15 mol/L磷酸缓冲液洗涤树脂，将树脂置于布氏漏斗上继续用pH6.5、0.15 mol/L磷酸缓冲液淋洗，后抽干移入小烧杯中。
用6ml 10%硫酸铵浸泡树脂并轻搅10min，收集硫酸铵溶液，重复一次。
将树脂置于布氏漏斗上（收集瓶一定不能有水），用6ml 10%硫酸铵滴淋树脂，收集滤液与前面硫酸铵液合并，量体积。
抽干的树脂可再生重复使用。
按33%（W/V）在搅拌下慢慢加硫酸铵粉末于洗脱液中，待硫酸铵溶解后静置15min，以3500rpm离心10min，收集沉淀。
4. 去杂与结晶析出用0.8ml水溶解沉淀，对水进行透析（只能轻搅，不能快速搅动水）至无硫酸铵。
将透析液移至小烧杯中，用0.1mol/L NaOH调pH至8.0―8.5（精密试纸测试），如有沉淀，离心去除。
量酶液体积，按5%（W/V）在搅拌下慢慢加NaCl 固体（防止局部过浓），待盐溶解后用0.1mol/L NaOH慢调pH至9.5―10.0，室温下静置过夜。
至沉淀（结晶）出现稳定后置4℃保存。
离心收集沉淀，为溶菌酶。
真空干燥后称重，计算得率。
5. 酶活力测定与计算用含1mmol/L EDTA的pH6.2、0.1 mol/L磷酸缓冲液配制含量约为50μg/ml 的溶菌酶液。
将溶壁微球菌冻干粉与少许含1mmol/L EDTA的pH6.2、0.1 mol/L 磷酸缓冲液混合，在研钵中研磨（不需用力）1min充分乳化，用同样缓冲液稀释，使菌液在450nm处的吸光值在0.5附近，为底物。
酶液和底物置25℃水浴10min，准备好分光光度计的时间扫描（磷酸缓冲液为对照），摇匀吸取3ml底物置于比色杯中，放进比色槽，用移液枪加0.2ml酶液于底物中，即进行时间扫描120秒。
以在25℃、pH6.2下每分钟使吸光值下降0.001为一个活力单位计算酶活力，即：每1mg酶的活力单位数= 1分钟吸光值下降数÷0.001/测试酶量(mg)酶得率（mg/ml蛋清）= 酶重/蛋清体积酶活力回收率（活力单位/ml蛋清）= 酶重×活力单位数/蛋清体积五．思考题1. 计算酶活力回收率有什么意义？2. 要测定溶菌酶的纯度应怎样做？实验三模拟过氧化物酶的制备、固定与应用一．实验目的学习一种人工合成模拟过氧化物酶的方法，了解柱子型固定酶的原理以及感性认识酶分析法的一些应用。
二．实验原理过氧化物酶的辅基是血红素。
在体外将血红素与牛血清白蛋白结合制备成含血红素的蛋白质分子作为模拟过氧化物酶。
在确定血红素与牛血清白蛋白结合后，检测其的过氧化物酶活性。
然后将此人工模拟酶固定在载体琼脂糖凝胶（Sepharose 4B）上并装柱，应用于检测样品中痕量过氧化氢的含量，因为过氧化氢的测定不论是在临床生物化学还是在环境化学和食品工业中都具有重要意义。
血红素是一活性分子，而血清白蛋白具有极强吸附能力，所以两者能结合。
由于含有血红素，该结合物就具有过氧化物酶的特性。
琼脂糖凝胶在激活后能很好的吸附蛋白质分子从而把蛋白质分子（模拟过氧化物酶）固定。
过氧化物酶能极敏感的催化过氧化氢分解从而使邻苯二胺变成有色物质2，3-二氨基吩嗪，反应如下：产物2，3-二氨基吩嗪在428nm处有光吸收峰，所以能以此反应来测定过氧化物酶的活性和检测过氧化氢的含量。
三．主要仪器与试剂仪器：紫外-可见分光光度计，摇床，水浴锅，天平，布氏漏斗，恒流泵等。
试剂：氯化血红素、牛血清白蛋白，过氧化氢，邻苯二胺，氨水，环氧氯丙烷，Sepharose 4B，1，4-二氧六环等。
四．操作步骤1．以等摩尔数将牛血清白蛋白与氯化血红素结合称取3.216g 牛血清白蛋白于少量水中溶解，后加水至约30ml。
先用几滴氨水使0.0312g氯化血红素溶解，加少量水搅匀，然后在搅拌中缓慢滴至30℃的牛血清白蛋白溶液中，最后用水使混合液最终总体积为80ml。
其中所含氯化血红素和牛血清白蛋白的最终浓度均为0.6mmol/L。
在30℃水浴中20分钟（以上全班只做两份）。
该混合液经吸收光谱测定确认牛血清白蛋白与血红素结合后，稀释4倍，以稀NaOH或稀HCl调pH约为9.5。
每组取16ml备用。
2．载体Sepharose 4B的活化将适量的Sepharose 4B于烧结漏斗中（抽气过滤）抽干，称取8g（湿重），以100ml 1mol/L NaCl和100ml蒸馏水先后在漏斗上洗涤，抽干后移至小三角瓶内，加入6.5ml 2mol/L NaOH、1.5ml环氧氯丙烷、15ml 56% 1，4－二氧六环，于40℃的恒温摇床中振摇活化2h后取出，在烧结漏斗中以蒸馏水和0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3缓冲液洗涤、抽干。
3．模拟过氧化物酶与载体的连接将10ml牛血清白蛋白-氯化血红素复合物（其余6ml用作酶活力和偶联率的测定）与活化的载体Sepharose 4B混合，在40℃摇床上振荡偶联24h左右，在烧结漏斗中收集滤液，并用少许蒸馏水淋洗一并收集，量体积，用作未结合模拟酶的量的测定，算出偶联率。
将偶联复合物用0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3缓冲液浸泡后装柱。
用相同缓冲液平衡。
4．模拟酶固定前活力的测定及固定后的应用固定前酶活力的测定：将2ml 20mmol/L邻苯二胺与定量模拟酶（如可以是5、10、15μl等）混合后，再与1ml 20%过氧化氢混合，即用时间扫描测定反应0.5或1min时428nm处的吸光度，以O.D值/分.m g酶来表达酶的活力。
固定装柱后对过氧化氢检出值的测定：将柱子柱面上平衡液放至界面，把3ml20mmol/L邻苯二胺与含微量过氧化氢（如2μl）的水样品1ml混合，用恒流泵以0.5ml/min的流速使样品经过柱子（洗脱液用0.2mol/L，pH9.5 Na2CO3-NaHCO3缓冲液），收集有色过柱液3ml并测428nm的吸光值，以水代替过氧化氢与邻苯二胺混合过柱作为对照。
改变过氧化氢含量重复以上操作，测定出过氧化氢的最低检出值。
以过氧化氢含量与OD值的关系作出标准曲线，也可测定污水或雨水中过氧化氢的含量（注意相同条件才能比较）。