实验二十一 可溶性总糖的测定(蒽酮比色法)
蒽酮比色法测定可溶性糖
蒽酮比色法测定可溶性糖一、原理：糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糖醛，生成的糖醛或羟甲基糖醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糖醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比。
糖类与蒽酮反应生成的有色物质，在可见光区的吸收峰为630nm，可在此波长下进行比色，故可用于糖的定量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料阴干野扁桃果实（二）仪器设备分光光度计、水浴锅、具塞刻度试管、移液管、容量瓶、定性滤纸等（三）试剂浓硫酸（比重1.84）、分析纯蔗糖、分析纯蒽酮、乙酸乙酯蒽酮乙酸乙酯试剂：取分析纯蒽酮1g，溶于50ml乙酸乙酯中，贮于棕色瓶中，在黑暗中可保存数周，用时微热溶解结晶。
三、实验步骤（一）标准曲线1、1%蔗糖标准液将分析纯蔗糖在80℃下（2h）烘至恒重，精确称取1.000g，加少量水溶解，转入100ml容量瓶中，加入0.5ml浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
2、100μg/L蔗糖标准液精确吸收1%蔗糖标准液1ml转入100ml容量瓶中，加水至刻度。
3、标准曲线取20ml刻度试管11支，从0-10分别编号，按下表加入溶液和水。
然后按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其吸光度，的数据如下：（二）可溶性糖的提取1、提取取野扁桃样品，擦净表面污物，称取果肉、果仁各5份（共10组）（详重见下表）分别放入10支刻度试管中，加5ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min，提取液滤入25ml容量瓶，反复漂洗试管残渣，定容至刻度。
2、显色测定吸取样品提取液0.5ml于20ml刻度试管中，加蒸馏水1.5ml。
按顺序向试管中加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm 波长下测其吸光度，结果见下表：四、结果计算从回归方程求得糖量（y ） ×提取液量（5）×稀释倍数（5）可溶性糖含量＝吸取样品液的体积（0.5）×100％样品干重（0.05）×106实验结果：野扁桃果仁可溶性糖含量＝5.74％ 野扁桃果肉可溶性糖含量＝3.54％新疆野扁桃果实糖酸含量的测定——蒽酮比色法测可溶性糖指导老师：曾斌实验指导老师：帕提曼实验学生：苏瑞（063231240）实验时间：2008年10月。
学习指南2-1 植物组织中可溶性总糖的提取及蒽酮比色定糖法
植物组织中可溶性总糖的提取及蒽酮比色定糖法——学习指南
l 学习重点 1. 学习植物样本中可溶性总糖的提取方法。
2. 掌握蒽酮比色法定糖的原理和操作。
l 知识要点
蒽酮比色定糖法：糖在浓硫酸作用下，脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在620nm 处有最大吸收，可通过比色法进行糖的定量。
蒽酮比色法快速、简便，几乎可以测定所有的糖类物质，包括单糖、寡糖和多糖。
比色法和标准曲线制作参考《面粉中总糖和还原糖的提取及3,5-二硝基水杨酸定糖法》。
l 试剂 1. 0.1mg/ml 标准葡萄糖溶液。
2. 蒽酮试剂。
l 材料
新鲜植物叶片
l 仪器
电子天平、研钵、电磁炉、旋涡混合仪、循环水泵、抽滤瓶、紫外可见分光光度计 l 操作
l 注意事项
1. 蒽酮试剂中硫酸的浓度为80%，由于蒽酮不溶于水，因此测定样品中含水量不能多，试管应干燥无水，否则蒽酮会在测定液中析出而影响测定。
2. 蒽酮试剂
中有浓硫酸，操作时要小心，注意安全。
实验二十一可溶性总糖的测定(蒽酮比色法)
实验二十一可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）一、目的掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。
二、原理强酸可使糖类脱水生成糠醛，生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在620 nm 处有最大吸收. 在10 -100ug 范围内其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
这一方法有很高的灵敏度，糖含量在30ug 左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。
一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
三、仪器、试剂和材料1 . 仪器（1）分光光度计（2 ）电子顶载天平（3 ）三角瓶：50m1 X 1（4 ）大试管：9 支（5）试管架，试管夹（6 ）漏斗，漏斗架（7 ）容量瓶：50rnl X 2（8 ）刻度吸管：1m1X3 ，2m1X1 ，5mlX1（9 ）水浴锅2 . 试剂（1）葡萄糖标准液：l00ug/ml（2 ）浓硫酸（3）蒽酮试剂:0.2g 蒽酮溶于100 ml 浓H2SO4 中当日配制使用。
3 . 材料小麦分蘖节。
四、操作步骤1. 葡萄糖标准曲线的制作取7支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液:在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0m1 ，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。
自水浴重新煮沸起，准确煮沸lOmin 取出，用流水冷却，室温放置10min ，在620 nm波长下比色。
以标准葡萄糖含量（ug）作横坐标，以吸光值作纵坐标，作岀标准曲线。
2. 植物样品中可溶性糖的提取将小麦分蘖节剪碎至2mm以下，准确称取lg,放入50m1三角瓶中，加沸水25m1，在水浴中加盖煮沸10min，冷却后过滤，滤液收集在50m1容量瓶中，定容至刻度。
吸取提取液2m1，置另一50m1容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀测定。
3 .测定吸取lml已稀释的提取液于大试管中，加入 4.0ml蒽酮试剂，以下操作同标准曲线制作。
比色波长620nm，记录吸光度，在标准曲线上查出葡萄糖的含量（ug ）。
可溶性糖的测定（蒽酮比色法）
可溶性糖的测定——蒽酮比色法原理：可溶性糖与浓硫酸反应生成羟甲基糠醛，其与蒽酮生黄绿或蓝绿的糠醛衍生物，该物质在630nm(620)处有最大吸收峰，其浓度与可溶性糖的含量成正比。
试验用品：电子天平、分光光度计、恒温水浴锅、1mL，2mL，5mL 移液管各一支、容量瓶（根据需稀释倍数选择25或50mL）、10mL 刻度试管或离心管、试管架（别用胶的）、指型管（大一点的便于震荡混匀液体）、漏斗、滤纸、洗瓶试验药品：蒽酮、乙酸乙酯、分析纯蔗糖、浓硫酸（优级纯或分析纯）、蒸馏水试验样品：玉米叶（干样）标液及标曲配制：蒽酮-乙酸乙酯试剂：称取分析纯蒽酮1g溶于50mL乙酸乙酯中，贮于棕色瓶，至于黑暗中保存，如有结晶析出可加热溶解。
1%蔗糖标准液：精确称取1.000g分析纯蔗糖加少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，加0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度线；100mg/L蔗糖标准液：精确吸取1%蔗糖标准液1mL，加入100mL容量瓶，加水至刻度线。
标曲：项目管号0 1 2 3 4 5各管中蔗糖含量（ug) 0 20 40 60 80 100 100mg/L蔗糖液（ml）0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 蒽酮乙酸乙酯试剂（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸（ml） 5 5 5 5 5 5 吸光度A630样品测定：称取0.05g样品于干燥的10mL刻度试管中，加蒸馏水10mL后放入水浴锅内沸水浴30min，再过滤到50mL容量瓶内混匀。
取干燥的指型管分别加入1.5mL蒸馏水、0.5mL蒽酮乙酸乙酯试剂、0.5mL样品溶液和5mL浓硫酸快速震荡摇匀后冷至室温比色（摇匀后反应10min左右可放入冷水中冷却）。
结果计算：可溶性糖含量=Mx×V×D×100V1×W×103Mx：标准溶液查得的糖含量（ug）V ：样品总体积（mL）V1：测定时的取用体积（mL）D ：稀释倍数（mg）103：样品重量单位由mg换算成ug的倍数。
总糖的测定蒽酮比色方法
总糖测定——蒽酮比色法一、原理：单糖类遇浓硫酸时，脱水生成糠醛衍生物，后者可与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物，当含糖量在20～200mg/L范围内时，其呈色强度与溶液中糖的含量成正比，故可比色定量。
二、试剂：1、10～100ppm葡萄糖系列标准溶液：称取1.0000g葡萄糖，用水定容至1000ml，从中吸取1、2、4、6、8、10ml分别移入100ml容量瓶中，用水定容，即得浓度为10、20、40、60、80、100ppm（ug/ml）葡萄糖系列标准溶液。
2、0.1%蒽酮溶液：称取0.1g蒽酮，溶于100ml72%硫酸中，贮存于棕色瓶中，于0～4℃下存放。
3、72%硫酸溶液。
三、测定方法：（一）样品处理：称取适量样品，用100ml水转移至250ml容量瓶，慢慢加入5ml乙酸锌和5ml亚铁氰化钾，沸水浴5～10min，定容，静置至上清，过滤。
根据估计含糖量，去滤液进行稀释，使糖含量在20～80mg/L范围内。
（二）测定吸取系列标准溶液、样品溶液（含糖20～80ppm）、蒸馏水（空白）各2ml，分别加入具塞比色管中，沿管壁各加入蒽酮试剂10ml，立即摇匀，放入沸水浴中准确加热10min，取出，迅速冷却至室温，在暗处放置10min，用1cm比色杯，以零管调仪器零点，在620nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
根据样品溶液的吸光度查标准曲线，得糖含量。
四、结果计算：总糖（以葡萄糖计，%）=c×稀释倍数×10-4式中：c：从标准曲线查得的糖浓度，ppm（ug/ml）；10-4：将ppm换算为%的系数五、说明与讨论1、该法是微量法，适合于含微量碳水化合物的样品，具有灵敏度高，试剂用量少等优点。
2、该法按操作的不同可分为几种，主要差别于蒽酮试剂中硫酸的浓度（66～95%），取样量（1～5ml）、蒽酮试剂用量（5～20ml）、沸水浴中反应时间（6～15min）和显色时间（10～30min）。
这几个操作条件之间是有联系的，不能随意改变其中任何一个，否则将影响分析结果。
实验 植物可溶性糖测定
～注意事项～
蒽酮试剂含有浓硫酸，使用时应该小心
离心时要平衡 在蒽酮反应前稀释样品10-20倍
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四、操作步骤
1.可溶性糖的提取 称取0.5g的新鲜植物叶片，于研钵中加 80%酒精4ml，仔细研磨成匀浆，倒入离心管 内，置于80℃水浴中不断搅拌30min，离心 10分钟(5000转/min)，收集上清液于10ml的 刻度试管中，其残渣加2ml80%酒精重复提1次， 合 并 上 清 液 。 在 上 清 液 中 加 0.5g 活 性 炭 ， 80℃水浴脱色30min，定容至10ml，过滤后 取滤液(稀释10倍或20倍后)测定。
植物组织中可溶性糖含量的测定
பைடு நூலகம்
一、实验目的
学习可溶性糖测定的蒽酮比色法
二、实验原理
植物在个体发育的各个时期，代谢活动也发
生相应的变化，碳水化合物的代谢也不例外， 其含量也随之发生变化。了解可溶性糖含量 的变化，在生理上和实践上都有重要的意义。 本实验采用蒽酮比色法测定可溶性糖的含量。 糖在硫酸的作用下生成糠醛，糠醛再与蒽酮 作用，形成一种绿色的络合物。在低浓度时， 625nm的OD值与糖含量成正相关。该实验方法 简便，但没有专一性，对于绝大部分的碳水 化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。
试剂（ml) 1
葡萄糖标准液 80%酒精 蒽酮-硫酸试剂
管号 2 3 4 5 6 7
0
0.15 0.3 0.45 0.6 0.75 0.9
1.0 0.85 0.7 0.55 0.4 0.25 0.1 5 5
30
5
60
5
90
5
120
5
150
5
180
葡萄糖浓度（ul/ml)0
蒽酮硫酸法测定总糖
苯酚硫酸法和蒽酮硫酸法测总糖的方法及步骤2011-07-15 11:45:19| 分类：默认分类|字号订阅植物体内的碳素营养状况以及农产品的品质性状，常以可溶性糖和淀粉的含量作为重要指标，本实验学习几种定量测定可溶性糖和淀粉的方法。
（一）苯酚法测定可溶性糖【实验原理】植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。
苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10－100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。
苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。
【实验仪器及试剂】1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。
2．试剂：（1）90％苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。
（2）9％苯酚溶液：取3mL 90％苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。
（3）浓硫酸（比重1.84）。
（4）1％蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。
加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。
（5）100ug/L蔗糖标准液：精确吸取1％蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。
【实验步骤】1．标准曲线的制作：取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表27－1加入溶液和水，然后按顺序向试管内加入1mL 9％苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以5－20s。
加入5 mL浓硫酸，摇匀。
比色液总体积为8 mL，在恒温下放置30min。
显色。
然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。
2．可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取0.10－0.30g，共3份，分别放入3支刻度试管中，加入5-10mL 蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min （提取2次），提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。
实验二十一 可溶性总糖的测定(地衣酚 硫酸法)
植物样品可溶性糖（%）=（查曲线所得糖量（ｕｇ）*稀释倍数）*100/（样重 （g）*106）
注意事项 1.该法操作简便，可广泛用于测定糖蛋白中总糖含量。 2.氨基酸存在可导致颜色降低。大量的色氨酸存在也可导致一些误差，但对中性糖的测 定结果是可靠的。 3.如果样品中含有较多葡萄糖，加热时间应延长至 45 分钟，因为葡萄糖显色较慢。
操作步骤 1.制作甘露糖标准曲线：取 7 支试管，编号，分别加 100ｕｇ/ml 甘露糖标准液 0、0.5、 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml，再各加蒸馏水 3.0、2.5、2.0、1.5、1.0、0.5、0ml 补足至 3.0ml，各管加 8.5ml 冷却到 4℃的地衣酚—硫酸试剂，管口各加一玻璃球，将试管放入 80℃水浴中加热 15 分钟。取出后流动水冷却，505nm 比色（以 0 管调零）。 2.可溶性糖样品液显色：将实验三十四制备（或其他材料提取）的可溶性糖样品适量（约 含糖 50~200ｕｇ）加入试管，加蒸馏水补至 3.0ml，再加 8.5ml 冷的地衣酚—硫酸试剂， 同标准曲线制作一样处理。冷却后 505nm 比色。
实验二十一 可溶性总糖的测定（地衣酚—硫酸法）
目的要求 学习另一种测定可溶性总糖的方法—地衣酚—硫酸色法。
实验原理 可溶性糖经无机酸处理脱水产生糠醛（戊糖）或糠醛衍生物（如羟甲基糠醛）（己糖）， 生成物能与酚类化合物缩合成有色物质。通常使用硫酸，常用的酚有地衣酚（又名苔黑 酚）、间—苯二酚、ａ-萘酚等。
思考题 样品显色过程中，试管口为何加盖玻璃球？
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实验二十一可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）
一、目的
掌握蒽酮法测定可溶性糖含量的原理和方法。
二、原理
强酸可使糖类脱水生成糠醛，生成的糠醛或羟甲基糖醛与蒽酮脱水缩合，形成糠醛的衍生物，呈蓝绿色，该物质在 620 nm 处有最大吸收 . 在 10 -100ug 范围内其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比。
这一方法有很高的灵敏度，糖含量在 30ug 左右就能进行测定，所以可做为微量测糖之用。
一般样品少的情况下，采用这一方法比较合适。
三、仪器、试剂和材料
1 .仪器
（ 1) 分光光度计
(2 ）电子顶载天平
(3 ）三角瓶： 50m1 X 1
（ 4 ）大试管： 9 支
（ 5) 试管架，试管夹
（ 6 ）漏斗，漏斗架
（ 7 ）容量瓶： 50rnl X 2
（ 8 ）刻度吸管： 1m1X3 ， 2m1X1 ， 5mlX1
（ 9 ）水浴锅
2 .试剂
（ 1) 葡萄糖标准液： l00ug/ml
(2 ）浓硫酸
(3) 蒽酮试剂 :0.2g 蒽酮溶于 100 ml 浓 H2SO4 中当日配制使用。
3 .材料
小麦分蘖节。
四、操作步骤
1 .葡萄糖标准曲线的制作
取 7 支大试管，按下表数据配制一系列不同浓度的葡萄糖溶液：
管号 1 2 3 4 5 6 7
葡萄糖标准液（ ml ） 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8
蒸馏水（ ml ） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2
葡萄糖含量（ ug ）0 10 20 30 40 60 80
在每支试管中立即加入蒽酮试剂 4.0m1 ，迅速浸于冰水浴中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。
自水浴重新煮沸起，准确煮沸 l0min 取出，用流水冷却，室温放置 10min ，在 620 nm 波长下比色。
以标准葡萄糖含量（ ug) 作横坐标，以吸光值作纵坐标，作出标准曲线。
2 .植物样品中可溶性糖的提取
将小麦分蘖节剪碎至 2mm 以下，准确称取 Ig, 放入 50m1 三角瓶中，加沸水 25m1 ，在水浴中加盖煮沸10min ，冷却后过滤，滤液收集在 50m1 容量瓶中，定容至刻度。
吸取提取液 2m1 ，置另一 50m1 容量瓶中，以蒸馏水稀释定容，摇匀测定。
3 .测定
吸取 lml 已稀释的提取液于大试管中，加入 4.Oml 蒽酮试剂，以下操作同标准曲线制作。
比色波长
620nm ，记录吸光度，在标准曲线上查出葡萄糖的含量（ ug ）。
查表所得糖含量（ ug ）×稀释倍数
五、结果处理
六、注意事项
1 .该显色反应非常灵敏，溶液中切勿混入纸屑及尘埃。
2 . H 2 SO 4 要用高纯度的。
3. 不同糖类与蒽酮的显色有差异，稳定性也不同。
加热、比色时间应严格掌握。
七、思考题
1 .用水提取的糖类有哪些？
2 .制作标准曲线时应注意哪些问题？。