沼泽红假单胞菌培养基的优化及降氨氮作用的研究

第12卷第3期集美大学学报(自然科学版)V o.l12N o.3 2007年7月Journa l o f Ji m e iU n i ve rsity(N atura l Sc i ence)Ju.l2007[文章编号]1007-7405(2007)03-0198-06沼泽红假单胞菌培养基的优化及降氨氮作用的研究蔡慧农1,2,倪辉1,2,苏文金1,2(1.集美大学生物工程学院,福建厦门361021;2.厦门市食品生物工程技术研究中心,福建厦门361021)[摘要]对沼泽红假单胞菌的培养基进行了优化,并对其降氨氮效果进行了研究.结果表明:沼泽红假单胞菌可以利用多种碳源和氮源,乳酸和草酸铵是实验室培养沼泽红假单胞菌的最适碳源和氮源,乳酸根的质量浓度及碳氮比对沼泽红假单胞菌生长具有显著影响,而磷酸根浓度对沼泽红假单胞菌生长没有显著影响;用正交试验获得最适于培养沼泽红假单胞菌的乳酸质量浓度为1%,碳氮比为115,磷酸二氢钾的质量浓度为115g/L;在自然光照、30e条件下,沼泽红假单胞菌的延滞期为2d,对数生长期为2~10d,稳定期为10~20d;沼泽红假单胞菌具有很强的综合降氨氮作用,但其降氨氮效果受水质的影响而不稳定.[关键词]沼泽红假单胞菌;培养基优化;降氨氮[中图分类号]S154139[文献标识码]A0引言光合细菌是自然界广泛存在的一类具有光能合成体系的原核生物,它不仅能进行光合作用,还能固定、同化和降解有机物及某些有毒物质[1-2].在养殖水域中添加光合细菌不仅可提高区域生态的生产力水平[1],还可降低COD、BOD、氨氮量,增加溶氧[3-4],降低硫化氢[5],改善水质.随着养殖业的快速发展及绿色养殖、健康养殖的推广,光合细菌作为一种养殖益生菌受到了越来越多的关注[5-8].沼泽红假单胞菌(Rhod op seudo m ona s palu stris)属非硫红螺菌科、红假单胞菌属,是近年水质净化领域应用和研究中常用的光合细菌[9-10].集美大学生物工程学院微生物与发酵研究室分离获得了一株沼泽红假单胞菌,为了开发该菌株在水产养殖中的应用技术,需要对该菌的培养及净化水质效果进行深入研究.前人对影响沼泽红假单胞菌生长的环境因子进行了全面的研究[11-12],但关于营养成分对沼泽红假单胞菌生长影响方面的研究报道却很少.因此,本文对沼泽红假单胞菌的碳源、氮源、培养基主要成分配比及降氨氮作用进行了研究,为该菌株的大规模培养及运用营养生态学的基本原理调节光合细菌的生长、提高其净化水质的效果提供了理论基础.1材料与方法111实验材料11111菌种沼泽红假单胞菌PSB-J030323:由集美大学生物工程学院微生物与发酵研究室从厦门集美附近的虾池中分离获得.[收稿日期]2006-03-31[作者简介]蔡慧农(1957-),男,教授,主要从事生物工程方面的研究.通讯作者:苏文金(1956-),男,教授,博士生导师,从事海洋微生物生物活性物质研究.第3期蔡慧农等:沼泽红假单胞菌培养基的优化及降氨氮作用的研究11112 培养基保种培养基(g /L ):C H 3COONa 310,N a H C O 3510,(NH 4)2SO 4110,蛋白胨5,酵母膏110,M gSO 4015,N a C l 110,KH 2PO 4110,K 2H P O 4015,Ca C l 20105,碳酸钙20,琼脂20,pH 713.基础培养基(g /L):C H 3COON a 310,Na H CO 3510,(NH 4)2SO 4110,蛋白胨5,酵母膏110,M gSO 4015,NaC l 110,KH 2PO 4110,K 2H PO 4015,CaC l 20105,碳酸钙20,pH 713.11113 试剂蛋白胨、酵母膏、牛肉膏等购买于上海生化试剂有限公司;其它试剂均为分析纯.11114 仪器S W -CJ-1型水平流净化工作台(吴江市净化设备总厂)、5410CC275TH Z H 恒温光照培养箱(杭州雪中碳科技有限公司)、TDL-40B 型普通台式离心机(上海安亭科学仪器厂)、F A 1004N 电子天平(上海精密科学仪器有限公司)、101-3B 型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器总厂).112 实验方法11211 沼泽红假单胞菌种制备用接种铲挑取少量保存在琼脂柱中的沼泽红假单胞菌PSB -J030323接入装有15mL 培养基的具塞试管(试管总体积约为20mL)中并密封,30e 、静置光照(光强2000lx)培养至微红色;吸取这种光合细菌培养液10mL 转接入装有250mL 培养基的磨口三角瓶(总体积为300mL )中并密封,30e 、2000lx 光照培养7d 后备用.11212 沼泽红假单胞菌培养基优化实验在500mL 的具塞试剂瓶中装入400m L 培养基,灭菌冷却后接入6mL 沼泽红假单胞菌PSB -J030323液体菌种,密封后在30e 、2000l x 的光照条件下静置培养,用单因素试验考察单种培养基成分对沼泽红假单胞菌生长的影响,用正交试验优化沼泽红假单胞菌的培养基成分配比.11213 沼泽红假单胞菌降氨氮实验在5L 的生物反应器中加入4L 培养基或养殖废水,接入1%的沼泽红假单胞菌PSB -J030323液体菌种,敞口、静置,30e 自然光照培养,定时取样并用纳氏试剂比色法测定氨氮质量分数.11214 沼泽红假单胞菌生物量测定方法用干重法测定沼泽红假单胞菌生物量.2 实验结果211 碳源对沼泽红假单胞菌生长的影响以1g /L 的硫酸铵为氮源,以011g /L 的酵母膏为生长因子,分别用乙酸钠、碳酸氢钠、乙醇、甘油、乳酸、苹果酸、丙酮、葡萄糖、乙酸乙酯、酒石酸、琥珀酸、柠檬酸、草酸钙等为碳源配制培养基(以含碳量计为5g /L),接种沼泽红假单胞菌进行培养试验.11d 后,以乳酸、柠檬酸、苹果酸、乙酸钠、琥珀酸、酒石酸为碳源的光合细菌培养液都变成红色,说明这些物质都可以作为碳源培养沼泽红假单胞菌.图1是培养11d 后沼泽红假单胞菌生物量的比较结果,生物量最大的4种培养基所采用的碳源分别是乳酸、柠檬酸、苹果酸和乙酸#199#集美大学学报(自然科学版)第12卷钠.以这4种物质为碳源,分别配制培养基,接种沼泽红假单胞菌进行培养试验,沼泽红假单胞菌在这4种培养基中的生长曲线如图2所示,以乳酸为碳源配制培养基培养沼泽红假单胞菌,在对数生长期内生长速率最大,所获得的生物量最大.212 氮源对沼泽红假单胞菌生长的影响以乳酸为碳源,控制培养基的含氮量与1g /L 的硫酸铵相当,分别用硝酸钾、亚硝酸钠、磷酸氢二铵、柠檬酸三铵、碳酸铵、尿素、乙二胺四乙酸、乙酸铵、草酸铵、柠檬酸铁铵、酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、氨水、硫酸铵为唯一氮源配制培养基,接种培养沼泽红假单胞菌.11d 后,以草酸铵、磷酸氢二铵、酵母膏、蛋白胨、柠檬酸三铵、牛肉膏、碳酸铵等为氮源的培养液变成了红色,说明这些物质可用作沼泽红假单胞菌培养的氮源.图3是11d 时沼泽红假单胞菌的生物量比较图,以草酸铵、牛肉膏、碳酸铵和酵母膏为碳源配制培养基,生物量明显大于其它氮源配制的培养基.分别以这4种物质为氮源,配制培养基培养沼泽红假单胞菌,培养结果如图4所示,在以草酸铵为氮源培养沼泽红假单胞菌所获得的生物量最大,在对数生长期内生物量增长最快.213 沼泽红假单胞菌培养基的优化以乳酸为碳源,草酸铵为氮源,磷酸二氢钾为磷源,用正交试验法优化沼泽红假单胞菌培养基的碳源质量浓度、碳氮比(培养基中碳与氮物质的量之比)及磷酸根浓度,按表1所示的实验设计配制培养基,接种沼泽红假单胞菌11d 后,实验结果如表1所示,用DPS 数理统计软件对实验结果进行方差分析,因素A 、B 、C 的显著水平分别为310%、416%和6910%,说明因素A 和B 对沼泽红假单胞菌的生长具有显著影响,而因素C 在试验的水平范围内对结果没有显著影响.由表1可知,因素A 对结果的影响大于因素B 所产生的影响;培养基的最适水平组合为A 2B 1C 2,即在培养沼泽红假单胞菌时,应控制乳酸的质量浓度为1%,碳氮比为115,磷酸二氢钾质量浓度为115g /L ,按此配比配制培养基,接种沼泽红假单胞菌,试验结果(见图5)表明,沼泽红假单胞菌的延滞期为0~2d ,对数生长期为2~10d ,过渡期和稳定期为10~20d,20d 后为衰亡期.#200#第3期蔡慧农等:沼泽红假单胞菌培养基的优化及降氨氮作用的研究表1 沼泽红假单胞菌培养基优化试验结果Tab 11 Results o fm ed iu m op tm i iza tion forcu lt u ring R ho do pse udom o na s pa l us tri s 试验号乳酸质量浓度(A )/%碳氮比(B )磷酸二氢钾质量浓度(C )/(g #L -1)生物量/(g #L -1)11(0.5)1(1.5)1(0.5)0.42221(0.5)2(8.5)2(1.5)0.36431(0.5)3(15.5)3(2.5)0.16242(1.0)1(1.5)2(1.5)0.51252(1.0)2(8.5)3(2.5)0.45662(1.0)3(15.5)1(1.5)0.34173(1.5)1(1.5)3(2.5)0.26883(1.5)2(8.5)1(0.5)0.18493(1.5)3(15.5)2(1.5)0.098K 10.3160.4010.316K 20.4360.3350.325K 30.1830.2000.295R 0.2530.2010.030214 沼泽红假单胞菌对人工合成废水氨氮的影响 控制乳酸质量浓度为1%,碳氮比为115,磷酸二氢钾质量浓度为115g /L ,配制培养基,灭菌后分别接入1%的自来水、1%的虾池底泥混合物、1%的枯草芽孢杆菌培养物、1%的沼泽红假单胞菌培养物,定时取样并测定样品中氨氮的变化,研究不同微生物群系对相同的人工合成废水氨氮的影响,实验结果如图6所示.接种底泥的培养液的氨氮上升最快,氨氮峰值最高,且持续时间最长,这表明底泥中的微生物群系分解代谢产生了大量的氨氮,且同化吸收氨氮的能力弱.而接种沼泽红假单胞菌的培养液的氨氮峰值最小,且持续的时间最短,这表明沼泽红假单胞菌分解代谢产生的氨氮少,吸收同化氨氮能力强.5~12d 内,接种沼泽红假单胞菌的培养液的氨氮量明显比接种自来水、底泥、枯草芽孢杆菌的培养液的低;13d 后,由于营养物的消耗各试验组氨氮的差别不大.结果表明,相对于枯草芽孢杆菌、虾池底泥混合物及自来水中的微生物,沼泽红假单胞菌分解产生氨氮的能力最弱,而同化吸收氨氮的能力最强,综合降氨氮的效果最好.215 沼泽红假单胞菌对养殖废水氨氮的影响取不同养殖区域的养虾废水,分别接入1%的沼泽红假单胞菌,测定氨氮随时间变化的情况,实验结果如表2所示.水样1、水样2和水样4接种沼泽红假单胞菌10d 后,氨氮质量浓度基本降到011m g /L 以下,用平均值的成对二样本分析的t 检验对这3种水样的试验结果进行检验,水样1、水样2和水样4的t 值分别为4184、10123和8161,实验组与对照组之间的显著水平分别为012400%、010077%和010017%,差异极显著,实验组的氨氮水平显著低于对照组;水样3和水样5接种沼泽红假单胞菌后,氨氮并没有呈现出明显的下降趋势,用平均值成对二样本分析的t 检验对这两种水样的实验结表2 沼泽红假单胞菌对养殖废水氨氮的降解效果Tab 12 E ff ects o f R ho do pse udom o na s pa l us tri s on ammon ia n itrogen o f fishe ry wastewa t e r 时间/d 水样1对照试验水样2对照试验水样3对照试验水样4对照试验水样5对照试验01.35a 1.28a 1.40c 1.39a 2.41c 2.39c 1.68a 1.64a 1.11cd 1.06d 51.20b 0.45b 1.45c 0.63b2.35c 2.37c 1.52b 0.71b 1.21c 1.28c 101.16b 0.05c 1.72b 0.09c 2.68b 2.71a 1.42c 0.15c 1.67a 1.76a 150.84c 0.04c 1.69b 0.08c 2.74ab 2.78a 1.15d 0.05d 1.42b 1.51b 200.56d 0.05c 1.78b 0.11c 2.81a 2.77a 0.84e 0.04d 1.23c 1.22c 250.41de 0.04c 1.80b 0.09c 2.41c 2.62ab 0.75e 0.03d 1.15c 1.12d 300.32e0.08c1.95a0.07c2.31c2.52b0.62f0.02d1.08d1.12d注:表中不同的英文字母表示5%显著水平上的不同数值.#201#集美大学学报(自然科学版)第12卷果进行检验,t值分别为1181和1198,对照组与实验组的显著水平分别为6146%和5123%,差异不显著.实验组与对照组的氨氮差异不明显,这说明对于不同区域的养殖废水,沼泽红假单胞菌的降氨氮效果是不一样的.这主要是因为不同养殖废水的水质条件差别很大,只有水样的水质条件适于沼泽红假单胞菌生长时,才会显示出降氨氮作用,而当水样的水质条件不适于沼泽红假单胞菌生长时,则不会显示降氨氮作用,该结果与目前其它光合细菌使用效果不稳定有一定的相似性.3结论311沼泽红假单胞菌的营养特性沼泽红假单胞菌能利用多种小分子有机醇和有机酸为碳源,并利用铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐和小分子有机氮等为氮源,这表明沼泽红假单胞菌可以同化吸收许多小分子有机碳源和铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、小分子有机氮等多种含氮物质,因而利用沼泽红假单胞菌降低环境的COD、BOD、氨氮和硝态氮从理论上分析是可行的.312沼泽红假单胞菌的培养基相对其它实验的碳源和氮源来说,用乳酸为碳源、草酸铵为氮源培养沼泽红假单胞菌所获得的生物量最大,对数生长期内菌体生长最快,因而,宜用乳酸作为培养沼泽红假单胞菌的碳源、草酸铵作为培养沼泽红假单胞菌的氮源,使其快速生长.碳源质量浓度及碳氮比是影响沼泽红假单胞菌生长的主要因素,而磷酸根的浓度对沼泽红假单胞菌生长的影响不大,优化的沼泽红假单胞菌的培养基中乳酸的质量分数是1%、碳氮比是115、磷酸二氢钾质量浓度是115g/L.在这种培养基中,沼泽红假单胞菌的延滞期为2d左右,而对数生长期为2~10d,过渡期和稳定期为10~20d,20d后为衰亡期.313沼泽红假单胞菌的降氨氮作用沼泽红假单胞菌培养液中的氨氮远低于其它微生物培养液中的氨氮,这主要是因为沼泽红假单胞菌分解代谢产生氨氮的能力较弱,而同化吸收氨氮的能力较强.因此,用培养沼泽红假单胞菌的方法来降低或去除氨氮,从理论上来说是可行的.由于不同养殖水样的水质不同,沼泽红假单胞菌对不同养殖水样中氨氮的影响差别非常大,只有当水质条件适于沼泽红假单胞菌生长时才具有降氨氮效果,因而在使用沼泽红假单胞菌降低养殖水域中的氨氮时,一定要注意水质条件对沼泽红假单胞菌生长的影响,应采取适当的措施调节水质条件促进沼泽红假单胞菌生长,才能取得良好的效果.此外,沼泽红假单胞菌的降氨氮所需的时间比较长,需要10d左右才能使氨氮趋于稳定.因此,在使用沼泽红假单胞菌稳定养殖水体中氨氮时,应在氨氮高峰期出现前10d左右提前投放光合细菌,这样才能产生良好的降氨氮作用.[参考文献][1]韩梅,陈锡时,张良,等.光合细菌研究概况及其应用进展[J].沈阳农业大学学报,2002,33(5):387-389.[2]吴向华,杨启银,刘五星,等.光合细菌的研究进展及其应用[J].中国农业科技导报,2004,6(2):35-38.[3]N agado m iH,T akahasiT,SasakiK,et a.l Si m ultaneous re m oval of chem ical ox ygen de m and and nitrate i n aerobic trea-tm ent o f sew age wastewa ter usi ng i m m ob ili zed pho tosynt hetic bacter i u m of po rous cera m i c plates[J].W or l d Jou rna l ofM-i crob i o logy and B i o techno l ogy,2000,16:57-62.[4]郭秒,慕跃林,黄遵锡.复合光合细菌对热带鱼养殖水质净化作用的研究[J].水产科学,2004,23(2):30-32.[5]N ag ado m iH,K ita m ura T,W atanabe M,et a.l S i m u ltaneous re m ova l of che m ica l oxygen de m and(COD),phosphate,nitrate andH2S i n the syntheti c se w ag e w aste w ater us i ng porous cera m ici m mob ilized pho t o syn t hetic bacter i a[J].B iotech-# 202 #第3期蔡慧农等:沼泽红假单胞菌培养基的优化及降氨氮作用的研究no l ogy Le tters ,2000,22:1369-1374.[6]沈锦玉,尹文林,刘问,等.光合细菌HZPSB 对水产养殖水质的改良和对鱼类促生长作用[J].科技通报,2004,20(6):481-484.[7]王兰,廖丽华.光合细菌的分离鉴定及对养殖水的净化作用[J].微生物学杂志,2004,24(2):7-10.[8]徐良梅,滕小华.光合细菌的基本特性及在水产养殖上的应用[J].东北农业大学学报,2005,36(2):230-234.[9]N ag ado m iH,K ita m ura T,W atanabe M,e t a.l S i m u ltaneous re m ova l of chem i ca l oxygen demand (COD ),phosphate ,nitrate and H 2S i n t he syn t hetic se w age w astew ater usi ng porous cera m i c i m m ob ilized pho tosynt hetic bacter i a [J].B iotech -no l ogy Le tter ,2000,22:1369-1374.[10]K i m M yung K yu m,Cho i K yung -M i n ,Y i n Cheng-R ,i et a.l O dorous s w i ne w astew ater treat m ent by purple non -sulfurbacter i a ,R hodopseudo m onas pa l ustris ,iso l a ted fro m eutrophicated ponds [J].B iotechnology Le tters ,2004,26:819-822.[11]孙德军,张恩禄,赵春燕,等.沼泽红假单胞菌培养条件研究[J].沈阳农业大学学报,2003,34(1):28-30.[12]张玲华,邝哲师,陈薇,等.高活性光合细菌沼泽红假单胞菌培养特性初探[J].华南师范大学学报:自然科学版,2001(4):37-39.Opti m ization for Culturi ng Rhodopseudo monas palustris and Studies on Its Capability of Re movi ng Amm onia N itrogen fro m W ater Syste mCA IH u-i nong 1,2,N IH ui 1,2,SU W en -ji n1,2(1.School o f B i o techno l ogy Eng i neering ,J i m e iU n i ve rsity ,X ia m en 361021,Ch i na ;2.Food B i o -eng i neeri ng R esearch Cente r o f X i amen ,X ia m en 361021,China)Abst ract :The m ed i u m for cult u ring R hodop seudo m onas pal u stris is opti m ized and its capab ility of re m o -ving a mm on ia n itrogen fro m w ater syste m is studied.The results sho w t h at R hodopseudo m onas palustris has the ab ility to u tilize m any kinds of carbon sources and n itr ogen sources and it is best to culture Rhodop seudo m onas palustris i n laborato ri a l experi m entsw ith lactic ac i d as carbon source and oxa mm ite as n itrogen source ,respec -ti v e l y .R esults a lso i n dicate that concentration of carbon source and rati o of carbon source to n itrogen source are m ain facto rs that influence the gro w th o f Rhodop seudo m onas palustris ,w hereas concentration o f potassium di h ydrogen phosphate has not re m arkable effects on the g r ow th of t h is pho tosyn t h etic bacterium .Fro m t h e re -su lt o f orthogona l experi m en,tit is suggested that keeping concentration o f lactic ac i d at 1%,rati o o f carbonsource to nitrogen source at 115and concen trati o n o f potassum d i h ydrogen phosphate at 115g /L is suitable to cu lture this photosynthetic bacteri u m.It is seen fro m batch cu lture experi m ents w ith opti m ized m ediu m and under 30e and nature li g hting conditi o n that lag phase o f this photosynthetic bacteria is bet w een 0to 2d ,exponentia l phase is bet w een 2d to 10d ,stati o nary phase is be t w een 10d to 20d .Rhodop seudo m onas palus -tris is superi o r to other i n vesti g ated m icrob i a l co mm unity w it h regar d to the capab ility of re m oving a mmonia n-i trogen,but its capab ility of re m ov i n g a mm on ia n itrogen str ong ly depends on the w ater quality of the sa m ple and is not stab le .K ey w ords :Rhodop seudo m onas palustris ;m ed i u m opti m izati o n ;a mm on ia nitrogen re m ova l(责任编辑 马建华)#203#。