卵巢癌中的表观遗传修饰

辽宁大学学报 自然科学版第33卷　第4期　2006年JOURNAL O F L I AON I N G UN I V ERS ITY N atural Sciences Edition Vol.33　No.4　2006卵巢癌中的表观遗传修饰代　葳3(中国医科大学生物化学系,辽宁沈阳110001)摘　要:介绍了在卵巢癌的发展和治疗中表观遗传学的重要性,特别强调了在卵巢癌中内源性和获得性耐药性遗传途径中异常的DNA甲基化和组蛋白去乙酰化的重要性.通过表观遗传治疗反转肿瘤抑制基因沉寂和其他参与药物级联反应的基因沉寂为出现耐药性的卵巢癌患者带来了新的希望.关键词:卵巢癌;表观遗传学;基因芯片;DNA甲基化;组蛋白乙酰化.中图分类号:R730 文献标识码:A 文章编号:100025846(2006)0420353205 卵巢癌是女性常见的生殖器官肿瘤之一,据统计每年全世界死于卵巢癌的妇女多达114000人[1].由于卵巢癌早期无明显病症,大多数病例(>80%)在肿瘤超出卵巢后才得到确诊.虽然卵巢癌患者的五年存活率已经由1973年的37%上升到1997年的43%[2],该统计数据同妇女癌症存活率(61.5%)相比仍有很大差距(htt p:∥).晚期卵巢癌的标准治疗方法是肿瘤外科手术摘除后进行化疗,术后肿瘤的大小十分重要,大于2c m的肿瘤,病人存活时间只有12～16个月,而小于2c m的肿瘤,病人存活时间达到40～45个月[3].自20世纪90年代早期,术后卵巢癌一线化疗的黄金标准是使用植物碱类/紫杉烷类(p lati2 mum/taxane)混合药物,该混合物每3周一个疗程,共使用6个疗程,有效率高达80%[4].紫杉烷类药物能够结合细胞内β微管蛋白,从而导致微管稳定,生长阻滞和细胞凋亡[5].植物碱类药物形成DNA双链内和双链间加合物[6],抑制转录和翻译,导致细胞凋亡.上述过程可能是由DNA 错配修复酶p53和细胞凋亡前蛋白Bax介导.近来一些新兴药物,如拓扑替康(t opotecan)、吉西他汀(ge mcitabine)、脂质体多柔比星(li pos omal dox orubicin)和表皮生长因子受体抑制剂Z D-1839在临床试验中显示出了很大的前景[5].研究表明使用新药和传统药物的混合疗法有显著疗效[7].尽管标准的植物碱类/紫杉烷类治疗方案在40%～60%卵巢癌后期病人中发挥作用,但是由于出现了肿瘤耐药性,大多数病人在治疗18个月后复发[4].内源性和获得性耐药性的共有现象就是耐药肿瘤存在基因表达上的改变.卵巢癌中上调的基因包括Bcl-2,c-myc,Cycl ooxygenase-2,F ANCF,H-ras,Heparanse,HER2/neu,Hypoxia -inducible fact or1,K-ras,Kallikrein gene5,Kal2 likrein gene15,MUC1,MDR1和Synuclein ga mm.这些基因涉及细胞增殖、DNA修复、血管生成和细胞转移,其中有一些基因可能在耐药性产生过程中发挥作用.与卵巢肿瘤有关的下调基因包括APC,Apaf-1,ARH I,BRCA1,DAPK,DCC,Estr o2 gen recep t orβ,h MLH1,I CAM-1,MCJ,MUC2, LOT1,OPC ML,p21,p53,P ACE4,PTE N, RASSF1A.这些基因的下调可能是由基因缺失,编码序列突变或者表观遗传修饰改变引起的.表观遗传学(ep igenetics)是近年来遗传学中兴起的一个前沿领域,由W addingt on CH在19423作者简介:代　葳(19792),女,沈阳人,硕士,从事表观遗传学和生物信息学研究.　收稿日期:2006205217年首次提出,1987年Holiday R 针对表观遗传学作出了更加系统性的论断,即没有DNA 序列变化的、可遗传的基因表达变化.其分子基础有两个方面:针对DNA 本身的修饰和对组蛋白的修饰.肿瘤中表观遗传修饰的改变常常导致许多重要的肿瘤抑制基因沉寂,而通过小分子抑制剂可以逆转表观遗传修饰的改变,所以人们认为可以利用表观遗传治疗的方法使肿瘤抑制基因再表达,从而恢复耐药卵巢癌对传统化疗药物的敏感性[8].1　DNA 甲基化表观遗传修饰中最常见的就是通过DNA 甲基转移酶(DNA methyltransferase,DNMT )催化,以S -腺苷甲硫氨酸(S AM )作为甲基供体,将CpG 二核苷酸[9]胞嘧啶5位碳原子甲基化.在人体内有此作用的DNA 甲基转移酶分为3种:DN 2MT1,DNMT3a 和DNMT3b [10].基本上DNMT1参与维持DNA 甲基化状态,而DNMT3a 和3b 同DNA 从头甲基化有关,DNMT2因缺少有活性的功能域所以不具有DNA 甲基转移酶的作用.通过对DNA 甲基化模式的研究,人们发现肿瘤细胞中存在异常DNA 甲基化状态:整个基因组甲基化水平降低,导致遗传不稳定性增加;组织特异性基因的启动子区域出现从头甲基化;癌基因多为不充分甲基化,导致重新开放或者异常表达.目前,有大量研究表明肿瘤抑制基因的失活同CpG 过度甲基化有关,而肿瘤中出现的全基因组低甲基化和局部(CpG 岛)过甲基化可能是由于DNMT 活性失调所致[11].在卵巢癌中CpG 岛甲基化同许多基因沉寂有关,如BRCA1,RASSF1A ,LOT1和h MLH1,这些基因的沉寂在肿瘤的始动以及发展过程中起重要作用[12].2　组蛋白去乙酰化组蛋白的表观遗传修饰非常复杂,包括乙酰化、甲基化、磷酸化、核糖基化和泛素化等,其中研究最多的是组蛋白去乙酰化.通过组蛋白乙酰转移酶(hist one acetyltransferase,HAT )乙酰基团被加到组蛋白赖氨酸上,并可以通过组蛋白去乙酰化酶(hist one deacetylase,HDAC )去除.正常情况下转录基因的组蛋白核心(H2A,H2B ,H3,和H4)氮端赖氨酸的ε氨基被乙酰化[13],碱性组蛋白的正电荷被消除,DNA 本身所带的负电荷有利于构象展开,核小体结构变得松弛,使转录因子和聚合酶可以接近编码DNA 序列(图1,允许状态).组蛋白去乙酰化时,带正电的赖氨酸残基与DNA 分子电性相反,增加了DNA 和组蛋白之间的吸引力,启动子难以接近转录控制元件,从而处于转录抑制状态(图1,抑制状态).因此高度乙酰化的组蛋白同转录活性序列有关,而去乙酰化的组蛋白同基因沉寂密切相关.因为组蛋白去乙酰化和DNA 甲基化都同基因沉寂有关,有人提出这两个过程可能存在交互作用(cr osstalk )[14].研究表明甲基胞嘧啶结合蛋白(Methylcyt osine -binding p r otein,MBD ),能够结合甲基化序列,HDAC 和其他组蛋白甲基化酶.组蛋白甲基化是另一种转录沉寂机制,特别是组蛋白H3的第9位赖氨酸高度甲基化同基因沉寂高度相关,这种特殊的组蛋白甲基化过程也可以被DNA 甲基化抑制剂反转.研究表明DNMT 能够直接同HDAC 结合,进而连接DNA 甲基化和组蛋白去乙酰化过程[15].图1　组蛋白乙酰化与去乙酰化引起DNA 结构发生改变导致转录状态改变453辽宁大学学报 自然科学版 2006年 未甲基化的DNA和HAT导致的组蛋白乙酰化使得DNA结构疏松进入转录允许状态.相反, DNMT导致DNA甲基化和HDAC导致组蛋白去乙酰化使得染色质结构紧缩进入转录抑制状态.如图1所示,通常MBP同DNMT和HDAC结合成复合物,HAT同转录共激活剂(CoA s)结合成转录激活复合物.RNAP是RNA聚合酶,TF是转录因子.3　耐药性卵巢癌表观遗传修饰的改变 在卵巢癌中有一些基因通过表观遗传修饰进行调节,这些基因包括肿瘤抑制基因和参与细胞凋亡途径的基因.例如DNA错配修复基因h M2 LH1,该基因的沉寂同植物碱导致的耐药性有关[16].有些药物如卡铂和顺铂通过在DNA链内和链间形成加合物造成DNA损伤,错配修复系统检测到这种加合物的存在引起p53磷酸化,MAPK 途径激活,诱导促细胞凋亡蛋白BAX,最终导致细胞凋亡[6].表观遗传修饰改变使h MLH1基因沉寂,并导致细胞凋亡途径对植物碱-DNA加合物敏感性下降,产生耐药性.RASSF1A是另一个被甲基化并发生沉寂的基因,该基因能够结合微管蛋白发挥稳定微管的作用,临床研究显示干预表观遗传修饰的药物可以使RASSF1A再表达恢复耐药性卵巢癌对紫杉烷的敏感性.近来Yan等人[17]绘制出乳腺癌RASSF1A基因上游CpG岛到启动子之间完整的CpG岛谱.在耐药的卵巢癌中,干预表观遗传修饰的药物可能在药物反应途径中的几个位点发挥作用(图2).Apaf-1,h MLH1, RASSF1A,p16和p73可能通过表观遗传修饰机制下调,而ANCF和MDR-1通过表观遗传修饰机制上调导致肿瘤耐药性产生.虽然p53基因并不是通过表观遗传修饰调节的,但通过组蛋白去乙酰化抑制剂使p53的转录因子乙酰化增加,继而激活其活性可能是削弱耐药性的另一个机制.卵巢癌表观遗传修饰的改变能够引起一些涉及细胞增殖和细胞存活的基因上调.Taniguchi等人[18]研究发现F ANCF在卵巢癌细胞获得耐药性的同时去甲基化再表达.另外一个通过表观遗传修饰上调的基因是synuclien-γ,也叫做BCSG(乳腺癌特异性基因),该基因同卵巢癌恶化有关.图2　表观遗传修饰在具有耐药性的卵巢癌中作用位点4　检测癌症表观遗传学改变的技术和方法 DNA甲基化谱:在卵巢癌中,人们已经鉴别出了几个异常的甲基化位点,由此出现了一种新的诊断方法,该方法利用这些位点作为生物标记,可以检测肿瘤发展过程中和/或化疗过程中特定基因甲基化方式改变.例如Giff or等人[19]近来发现在卵巢癌病人的血浆中h MLH1甲基化同使用卡铂/紫杉烷治疗后肿瘤复发高度相关.因此,h M2 LH1甲基化状态可能预测了同卵巢肿瘤耐药性相关的不良结果.虽然目前使用的应答检测方法(如使用肿瘤抗原CA125)仍能提供大量信息,但是新的表观遗传标记对于改善目前使用的方法具有十分重要的作用.近几年来,科学研究者研发了一些检测癌症全基因组甲基化改变的有效方法.单道DNA甲基化杂交方法(DMH)在CpG岛阵列上对不同标记的肿瘤和非肿瘤DNA进行杂交[20,21].通过不同的荧光剂可以发现正常组织和肿瘤组织样本甲基化方式的差异.另一种新技术是甲基特异性寡核苷酸芯片(MS O),该技术已经成功地应用于区分两类Hodgkin淋巴瘤和两类B细胞白血病的研究中.第三种检测特定基因中甲基化差异的方法是非阵列的基于多聚酶链反应的方法,叫做甲基化特异性PCR,这个方法利用引物对特定等位基因553 第4期 代　葳:卵巢癌中的表观遗传修饰的甲基化和非甲基化方式是唯一的原理,实现了等位基因甲基化的定量研究[22].目前该方法已经成功建立了直肠癌、乳腺癌、食道癌和胰腺肿瘤甲基化基因芯片.第四种方法是限制性标记基因组扫描(restricti on land mark genome scanning, RLGS),这种方法也用来作为一种在特定肿瘤中评价多个甲基化位点异常的高通量方法[23].RLGS 依赖于甲基化敏感性限制酶NotI,该酶识别序列GC^GGCCGC.在CpG剪切位点的甲基化阻止NotI 剪切,从而基因组DNA的双向电泳可以区别正常和肿瘤DNA[24].目前RLGS成功地发现了星细胞瘤、鳞状细胞癌和肝癌中异常的甲基化位点.修饰组蛋白谱:虽然研究揭示了卵巢癌中几种异常乙酰化的基因,但是这种高通量分析方法比简单的甲基化分析更为复杂.染色质免疫沉淀(CHLP)用于检测特定位点的表观遗传修饰改变.特定的染色质修饰蛋白抗体免疫沉淀出与其结合的DNA,然后利用PCR检测该DNA序列[25]. CHLP利用了组蛋白4位上乙酰化的赖氨酸抗体检测在该位有乙酰化现象的特定基因.最近出现了一种新的技术叫做Ch I P-on-chi p,该技术是一种高通量方法,利用免疫沉淀方法得到DNA序列,将扩增后的DNA序列进行荧光标记,用于同克隆矩阵(arrayed library)杂交[26].B r own等人[27]开发了一种将DNA甲基化、基因表达和染色体修饰结合在同一个芯片上的新技术.在这个三通道芯片上,整个c DNA和扩增的DNA按顺序杂交,杂交点表明该位点有表达,并且存在表观遗传修饰的改变.最初的三通道芯片技术发现了卵巢癌异常的甲基化和乙酰化位点,并且可能应用于检测其他肿瘤中表观遗传修饰的变化.5　展望卵巢癌CpG岛甲基化和组蛋白低乙酰化同许多基因沉寂有关.这些基因的沉寂,在肿瘤的始动以及发展过程中发挥重要作用.在体外试验的基础上,通过反转由表观遗传修饰改变导致的基因沉寂,使药物敏感基因再表达,从而恢复肿瘤化疗敏感性的方法可能为卵巢癌和其他临床疾病的治疗带来希望.同时,先进的实验技术为卵巢癌的表观遗传修饰研究提供了有力支持.但是在卵巢癌的表观遗传治疗当中,我们也面对着很多的问题,其中人们最为关注的就是表观遗传治疗导致的全身低甲基化和过度乙酰化作用.全身低甲基化是癌症的标志,可以导致基因组不稳定.DNA甲基转移减少90%的转基因鼠出现全身大范围的肿瘤和生长缺陷.同样,由于错误调节有丝分裂控制点过乙酰化会造成染色体不稳定,因此如何制定合理的用药方案,减少干预表观遗传修饰药物的副作用将逐渐成为研究的重点.参考文献:[1]　D M Parkin,F B ray,J Ferlay,et al.Esti m ating theworld cancer burden:Gl obocan2000[J].I nt J Canc2er,2001,94(2):153-156.[2]　J S Barnholtz-Sl oan,A G Sch wartz,F Qureshi,et al.Ovarian cancer:changes in patterns at diagnosis andrelative survival over the last three decades[J].Am JObstet Gynecol,2003,189:1120-1127.[3]　D G 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s tra c t:　This paper highlights a p r o m inent r ole f or ep igenetics,particularly aberrant DNA methylati onand hist one acetylati on,in both intrinsic and acquired drug -resistant genetic pathways in ovarian cancer .I n this revie w,we su mmarize recent advances in the study of ep igenetics .Moreover,when combined with con 2venti onal che motherapeutic agents,ep igenetic -based therap ies may p r ovide a way t o resensitize ovarian tumors t o the p r oven cyt ot oxic activities of conventi onal che motherapeutics .Ke y wo rd s:　ovarian cancer;ep igenetics;m icr oarray;DNA methylati on;hist one acetylati on(责任编辑　崔久满　李　超)753 第4期 代　葳:卵巢癌中的表观遗传修饰。