植物的茎尖培养脱毒技术
植物脱毒技术
第一节 脱毒方法
一、茎尖培养脱毒 （一）茎尖培养脱毒原理 1、病毒在植物体内的分布
越靠近茎顶端区域的病毒，其感染深度越 低，生长点(约0.1～1.0mm区域)则几乎不含 或含病毒很少。离尖端越远病毒浓度越高。
无病毒苗的保存 隔离保存：种植于防虫网室 长期保存：
低温保存：茎尖或小植株培养基。19℃低温低光照，6-12月更换培养基。
冷冻保存：用液氮（-196℃）。
无病毒苗的繁殖 嫁接繁殖 扦插繁殖 压条繁殖 匍匐茎繁殖
本章小结
去除植物病毒的方法:热处理法、微茎尖培 养法、愈伤组织培养法和茎尖微体嫁接法。
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花药脱毒
1974年日本大泽胜次首次发现，草莓 花药培养可产生无病毒植株。
草莓花药培养脱毒率高于茎尖脱毒 率，一般可达80%以上。
三、理化方法脱毒
1、物理方法： 高温处理，又称温热疗法。35-40℃一些病
毒钝化失活。 低温处理，又称冷疗法。5℃处理4-7个月
2、化学处理 病毒抗血清预处理 RNA合成抑制剂处理 病毒唑处理
2、取茎尖与接种
取芽放在无菌的垫有滤纸的培养皿中，在 解剖镜下，用刀剥去幼叶，露出生长点。 带1-3个叶原基的茎尖作外植体（约0.30.5mm。使用培养容器以保湿性好的为宜。
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3、培养 25℃左右；10-16h/d， 1500—50001x，2-3个月长绿点
4、生根诱导 2-3cm高的无根苗——生根培养基， 1-2个月生根
法之一。
四、分子生物学鉴定法
双链RNA法（dsRNA） 互补DNA（cDNA）检测法
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（3）茎尖剥离 在双筒解剖镜下。切除叶片使芽体暴露，用解剖针剥掉 幼叶，直到只剩下2个最幼小的叶原基。
（4）茎尖培养 用小刀片切下茎尖放入培养基。培养条件为25℃，光照 16小时，光照强度为2000lx，平均两周进行一次转接，5～7周可获得单 个小植株。
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8Hale Waihona Puke 植物的茎尖培养脱毒技术优缺点：
• 茎尖生长点的培养成了去除植物病毒，使植物复 壮的重要方法。茎尖培养还可以去除其他病原体， 如细菌、真菌等。
• 茎尖越小，去病毒机会越大，脱毒效果就越好， 但同时因为其含营养及水量太低，故培养时对培 养基的要求就越高，对剥离技术要求也越高。
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植物的茎尖培养脱毒技术应用
• 茎尖脱毒培养对植物病毒的脱除效果好，后代遗 传性稳定，是目前生产上最常用的脱毒措施，已 在马铃薯、花卉、水果、蔬菜等作物脱毒快繁上 得到了广泛应用。
• （2）切取茎尖的大小虽然切取茎尖越小，带有病毒的可能性就越小， 但组织培养中，切取的茎尖太小，则不易成活。不同种类的植物和 不同病毒，切取的最适茎尖大小也不同。
• （3）组织培养常用基本培养基是MS培养基，它有较高浓度的无机 盐，对促进组织分化和愈伤组织生长有利；植物生长调节的种类和 配比依培养种类和生长时期来调整。
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酒精擦拭手
外植体消毒
浸泡5-7min
器械消毒 精选PPT课件
酒精灯灼烧
酒精擦拭培养皿 5
酒精擦拭
旋转灼烧
显微镜下 获取茎尖
接种
盖好瓶塞
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几种方法的配合使用是提高植物脱毒效果：
• (1) 高温热处理与微茎尖脱毒培养技术 • (2) 高温热处理与微（体）茎尖嫁接培养技术 • (3) 化学处理与茎尖脱毒培养技术
组培应用之茎尖脱毒
组培应用之茎尖脱毒日期：2010年4月1日来源：互联网作者：植物组培网点击：16261、理论依据（1）植物细胞全能性学说 1943年White提出了“植物细胞全能性”学说。
1958年，Steward和Reinert 对这一学说进行了验证，即一切植物都是由细胞构成的，植物的幼龄细胞含有全套遗传基因，具有形成完整植株的能力。
（2）植物病毒在寄主体内分布不均匀怀特（1943）和利马塞特.科钮特（1949）发现，植物根尖和茎尖部分病毒含量极低或不能发现病毒。
植物组织内的病毒含量随与茎尖相隔距离加大而增加。
究其原因可能有四个方面：其一，一般病毒顺着植物的微管系统移动，而分生组织中无此系统；病毒通过胞间连丝移动极慢，难以追上茎尖分生组织的活跃生长；其二，活跃生长的茎尖分生组织代谢水平很高，致使病毒无法复制；其三，植物体内可能存在“病毒钝化系统”，而在茎尖分生组织内活性应最高，钝化病毒，使茎尖分生组织不受病毒侵染；其四，茎尖分生组织的生长素含量很高，足以抑制病毒增殖。
2、脱毒方法（1）培育脱毒母株，获得外植体a.正确选择品种。
用于生产的品种选择很重要。
因不同品种产量、品质特性及对病毒侵染的反应不同，关系到去病毒的增产效果和脱毒种苗的应用年限。
因此，要选择品质好，产量高，抗、耐病毒病性好的品种。
b.确保品种纯度。
确保获取快繁外植体母株的品种纯度是生产高纯度、优质种苗的基础。
特别是栽培历史长的无性繁殖作物，用种量大、易造成品种混杂。
因此严格鉴定获取快繁外植体母株的品种纯度，可避免无效劳动，提高工作效率。
c.获得外植体。
外植体可直接取于大田，但最好取于室内培育的，选择生长健壮、无病虫害的母株，既不受季节影响，又易消毒。
（2）选择培养基。
研究确定的基本培养基有许多种，其中MS适合于大多数双子叶植物，培养基B5和培养基N6适合于许多单子叶植物，WHITE培养基适于根的培养，应先试用这些培养基再根据实际情况对其中的某些成分做小范围调整。
茎尖培养脱毒技术
植物脱毒技术
一、茎尖培养脱毒 3．剥取茎尖与接种 在超净工作台上，将已消毒的芽放在垫有无菌滤纸的培养 皿中（已灭菌）。在双筒解剖镜下，用解剖针或镊子将材料固 定于视野中，用解剖刀尖仔细剥去幼叶，至出现裸露的生长点。 用刀尖切下带1～2个叶原基的生长点（约0.3～0.5mm)。用解剖 针或解剖刀尖将切下的茎尖转至培养基上（顶部向上)，每管接 1～2个茎尖。 为防止茎尖失水，可用无菌水润湿滤纸。操作中注意随时 更换滤纸和接种工具，剥取茎尖时切勿损伤生长点。
植物脱毒技术
一、茎尖培养脱毒 5．生根诱导 一些植物茎尖培养形成绿芽后，基部很快发生不定根。而 另一些植物不产生不定根，必须将无根绿苗再诱导才能生根成 为完整植株。诱导生根的方法是将2～3cm高的无根苗转入生根 培养基，继续培养1～2个月即可形成根。一些植物茎尖离体培 养极难生根，即使转入生根培养基诱导也难奏效（如桃、苹 果），这类植物的无病毒绿芽可通过微体嫁接法获得完整植株。 如果取茎尖脱毒试管苗的茎尖（可大于第一次切取的茎尖）， 再培养，即二次茎尖培养脱毒率可达 100％。
植物脱毒技术
一、茎尖培养脱毒
植物脱毒技术
一、茎尖培养脱毒 2．茎尖大小与脱毒效果
用于脱毒的茎尖外植体可以是顶端分生组织即生长点，最 大 直 径 0.lmm ； 通 常 是 带 1 ～ 3 个 叶 原 基 的 茎 尖 （ 约 0.3 ～ 0.5mm）。 茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比。但不带叶原基的过 小，外植体离体培养存活困难，生长缓慢，操作难度大。茎尖 分生组织不能合成自身需要的生长素，而分生组织以下的1～3 个幼叶原基可合成并供给分生组织生长素、细胞分裂素。因而 带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。但茎尖外植体过大，脱毒 效果差。
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百合茎尖脱毒培养流程
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准备无菌培养器具，如培养皿、镊子、剪刀等。
第7章 茎尖培养和脱毒、快繁技术
7.3 快速繁殖技术（micropropagation ） 快速繁殖技术（
3. 快繁的一般步骤：
③ 试管苗的壮苗与生根：
• 一般要分成单苗 ， 转移到盐浓度较低 、 不含细 一般要分成单苗， 转移到盐浓度较低、 胞分裂素， 含低浓度生长素的生根壮苗培养基， 胞分裂素 ， 含低浓度生长素的生根壮苗培养基 ， 至根、茎长到合适的长度，即可锻炼出瓶。 至根、茎长到合适的长度，即可锻炼出瓶。 • 问题：不易生根 （ 延长时间、 继代 ） ；易生根： 问题：不易生根（ 延长时间 、 继代） 壮苗阶段不加生长素， 壮苗阶段不加生长素 ， 试管外生根可减少费用； • 特殊方法：如马铃薯的小球茎法。 特殊方法：如马铃薯的小球茎法。
7.3 快速繁殖技术（micropropagation ） 快速繁殖技术（
4. 提高试管苗繁殖速度的措施：
① 选择合适的繁殖途径 ② 改良培养基： 激素 （腋芽 、 不定芽 、 胚状体 ） 等； 激素（ 腋芽、 不定芽、 胚状体） ③ 改良培养条件 ： 温 、光 、 湿度、 气体（有利气体、 湿度 、 气体 （ 有利气体、
7.1 茎尖培养
3. 茎尖培养技术： • 培养方法：固体培养、液体纸 桥培养（易愈伤化时）
7.1 茎尖培养
3. 茎尖培养技术： • 对培养基和培养条件的要求： • 一般可用MS培养基，加少量的生长素（不 用2,4-D）和细胞分裂素；GA3有时对抑制 愈伤等有一定的效果。
7.2 脱毒技术： 脱毒技术：
3. 茎尖培养技术： • 材料消毒：在温室种植或田间种植的健康植 株上取枝条，必要时母株可用杀菌剂处理； 在实验室切取2-3cm长的芽，去掉较大的叶 片，进行常规的表面灭菌；
7.1 茎尖培养
3. 茎尖培养技术： • 茎尖分离：将灭菌的芽置放有湿滤纸的无菌 培养皿中，置体视显微镜下，依次用镊子或 解剖刀剥去叶片直至露出生长点，用锋利的 解剖刀片把带或不带叶原基的分生组织切下 来，直接接种到培养基上；
茎尖培养脱毒原理
茎尖培养脱毒原理
感染病毒植株的体内病毒的分布并不均匀，病毒的数量随植株部位及年龄而异，越靠近茎顶端区域的病毒的感染深度越低，生长点（约0.1-1MM区域）则几乎不含或含病毒很少。
这是因为分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞不断分裂和活跃的生长速度。
在切取茎尖时越小越好，但太小则不易成活，过大又不能保证完全出去病毒。
茎尖培养脱毒，由于其脱毒效果好，后代稳定，所以是目前培育无病毒苗最广泛和最重要的一个途径。
实验三-茎尖培养技术
4. 酒精灯、培养皿、灭菌滤纸、镊子、解剖刀等。
三、实验原理：
以茎尖为外植体经表面灭菌处理后，接种于诱导培养基 上，促进茎尖萌发成苗，获得无菌系，并可在适当浓度的 植物激素和生长调节剂的作用下进一步增殖和生根，获得 完整植株。 茎尖培养包括起始培养、增殖培养和生根培养及驯化移 栽等阶段，不同培养阶段要求不同的植物激素和生长调节 剂条件。 茎尖培养主要用于优质种苗和脱毒种苗的繁殖。
2.超净工作台使用前用75%的乙醇擦拭，打开鼓风机20分 钟左右； 3.接种前用品摆放合理； 4.接种过程中工具应充分灼烧，镊子、解剖刀及瓶口要在 酒精灯上灼烧； 5. 接种前用75%乙醇擦拭手和手臂，以减少污染。
六、思考题：
1. 以种苗快繁为目的的茎尖培养包括哪些阶段，各个 阶段对培养基条件有哪些要求，外植体选取要注意哪 些问题？ 2. 无菌操作过程中需注意哪些问题？
四、实验步骤：
1. 外植体的准备：去除老化叶片，保留1-2片幼叶，洗净 后在流水中冲洗10-20分钟； 注意选取幼嫩茎尖，大小要适当；选取生长旺盛的茎尖。
2. 表面灭菌：将茎尖材料放到灭国菌的罐头瓶内，加入 75%的乙醇处理30秒，然后倒出，加入1%的次氯酸钠 灭菌10分钟（大蒜处理20min），处理后用无菌水冲 洗4-5次；
以茎尖为外植体经表面灭菌处理后接种于诱导培养基上促进茎尖萌发成苗获得无菌系并可在适当浓度的植物激素和生长调节剂的作用下进一步增殖和生根获得完整植株
实验三 植物茎尖培养技术
一、实验目的：
1. 学习并掌握植物茎尖离体培养的原理和方法；
2. 学习并掌握无菌操作技术。
二、实验材料：
1.大蒜、小白菜；
2. 培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.05mg/L+蔗糖 3%+ 琼脂7.0g/L。 3. 75%的乙醇，1%次氯酸钠。
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E END！
香石竹脱毒的具体操作过和如下：
（1）热处理 将盆栽植株或离体瓶苗，在36～38℃下处理2周， 或每天在36℃16小时和38℃8小时处理共30天，光照为3000lx。
（2）表面消（毒1）热选处取理盆将栽盆香栽植石株竹或植离体株瓶叶苗腋，在间3生6～出38的℃下侧处芽理为外植体， 先用自来水冲2为周3洗，00或半0l每x小。天时在3，6℃用176小5时%和的38酒℃精8小消时毒处理3共0秒30，天，再光用照2.5%次氯 酸钙或次氯酸钠溶液处理15分钟,取出后用无菌蒸馏水清洗4次,用 无菌滤纸吸去多余水分备用。
（3）茎尖剥离 在双筒解剖镜下。切除叶片使芽体暴露，用解剖针 剥掉幼叶，直到只剩下2个最幼小的叶原基。
（4）茎尖培养 用小刀片切下茎尖放入培养基。培养条件为25℃， 光照16小时，光照强度为2000lx，平均两周进行一次转接，5～7
植物的茎尖培养脱毒技术优缺点：
• 茎尖生长点的培养成了去除植物病毒，使植物复 壮的重要方法。茎尖培养还可以去除其他病原体， 如细菌、真菌等。