抗肿瘤肝微粒体代谢种属比较研究报告
(仅供参考)药物在肝微粒体酶的体外代谢研究
P450酶
• 肝微粒体酶中最主要的是细胞色素P450(Cytochrome P450)氧化酶， 简称P450酶，酶蛋白中所含血红素与一氧化碳（CO）的结合体P450CO在450 nm处有特征性强吸收峰而得名。它存在于肝细胞内质网中， 是一个酶系统。可催化数百种药物的氧化过程。
P450酶氧化药物的过程谢源自大家或由还原辅酶Ⅰ供给，NADH-细胞色素b5还原酶传递，激活分子氧成 两个离子氧。 • 氧化：一个离子氧使药物氧化，另一个与氢结合成水。同时，P450Fe2+失去一个电子，而氧化再生成P450- Fe3+ 。因此可被反复利用用而 起催化作用。
药物与P450酶的关系
• 酶的底物（substrates ）：由P450酶代谢 • 酶的抑制剂（inhibitors）：药酶活性减弱，使其他药物或
抑制率 %
90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00
0.00
CYP1A2 CYP2A6 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP2E1 CYP3A4 表型
代谢产物的鉴定
• 采用代谢稳定性一致的孵育体系，通过加一定浓度的药物孵育一定时 间，没有加药物的孵育体系作为空白对照进液质分析，分析鉴定代谢 产物。
不同种属的代谢稳定性实验
• 采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系，一致的实验过程，分别加不
同种属的肝微粒体酶孵育，通过不同种属中药物剩余量的百分比的对
数与反应时间做曲线，求斜率，计算不同种属的代谢半衰期和清除率，
比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接
近程度，最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考。
结果计算
补骨脂酚的体外肝微粒体代谢及代谢减毒作用的种属比较
补骨脂酚的体外肝微粒体代谢及代谢减毒作用的种属比较焦士勇;艾常虹;李艾芳;李桦;王旗【摘要】目的研究补骨脂酚在人、比格犬和大鼠肝微粒体的体外代谢动力学及种属差异,评价不同种属肝微粒体对补骨脂酚人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)的减毒作用.方法应用MTT法检测HK-2细胞的存活率来评价补骨脂酚对HK-2细胞的毒性作用以及不同种属肝微粒体对其毒性的影响.应用HPLC法分析补骨脂酚在3个种属肝微粒体孵育液中的剩余浓度,研究其在肝微粒体中的代谢稳定性和代谢动力学.结果在3个种属肝微粒体分别作用下,补骨脂酚的HK-2细胞毒性明显降低.补骨脂酚在人肝微粒体中的代谢最慢,在大鼠肝微粒体中的代谢最快,人、犬和大鼠的代谢动力学参数Km、Vmax、T12)和CLint分别为:(81.66±3.41),(89.35±4.32)和(31.89±2.60)μmol·L-1;(0.47±0.01),(0.57±0.01)和(1.88±0.09) μmol·L-1·min-1;(44.14±1.13),(53.31±0.29)和(6.79±0.39)min;(39.38±1.04),(65.16±0.35)和(365.92±20.01)ml·min-1·kg-1.结论肝微粒体降低补骨脂酚的HK-2细胞毒性,这一减毒作用与补骨脂酚经肝微粒体酶的代谢相关.补骨脂酚的体外肝代谢动力学性质存在着一定的种属差异;犬肝微粒体对高浓度补骨脂酚所致的HK-2细胞毒性的降低作用要弱于人和大鼠肝微粒体.%Aim To investigate the inter-species differences of bakuchiol metabolism in human, beagle dog and rat liver microsomes by comparing enzyme kinetic parameters, and to evaluate metabolic detoxification of bakuchiol by liver microsomes from three species.Methods The cytotoxicity of bakuchiol was investigated using human kidney-2( HK-2 ),in presence or absence of liver mirosomes. The cell viabilities were examined by MTT assay. The residual concentrations of bakuchiol in microsomal incubates were determined by a HPLC method toinvestigate its metabolic stability and enzyme kinetics. Results The cytotoxicity of bakuchiol was significantly attenuated in the presence of the liver microspores of all three species. The metabolic elimination of bakuchiol by human liver microsomes was the slowest among the three species,while it was rapidest in rat liver. The Km, Vmax, T1/2 and CLint of bakuchiol obtained from human, dog and rat liver microsomes were( 81.66 ± 3.41 ),( 89.35 ± 4. 32 ) and ( 31.89 ±2.60 ) μmol · L-1 ,( 0.47 ±0. 014 ),( 0.57±0. 011 ) and ( 1.88 ±0. 087 ) μmol · L-1 · min-1,( 44. 14 ±1.13 ),( 53.31 ±0.29 ) and ( 6.79 ±0. 39 )min,( 39.38 ± 1.04 ), ( 65.16 ± 0.35 ) and ( 365.92 ± 20.01 ) ml · min- 1 . kg-1, respectively. Conclusions The cytotoxicity of bakuchiol on HK-2 cells was attenuated by the liver microsomes from each of the three species,respectively. The detoxification was associated with the biotransformation of bakuchiol by enzymes in liver microsomes. The inter-species differences were observed in hepatic metabolic characteristics of bakuchiol. A relative weaker effect of beagle dog liver microsomes on HK-2 cytotoxicity of bakuchiol at the high concentration level was also noted in comparison to that of human and rat.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2011(027)002【总页数】5页(P216-220)【关键词】补骨脂酚;HK-2细胞;细胞毒性;肝微粒体;代谢;种属差异;HPLC【作者】焦士勇;艾常虹;李艾芳;李桦;王旗【作者单位】北京大学公共卫生学院毒理学系,北京,100191;军事医学科学院毒物药物研究所,北京,100850;北京大学公共卫生学院毒理学系,北京,100191;军事医学科学院毒物药物研究所,北京,100850;北京大学公共卫生学院毒理学系,北京,100191【正文语种】中文【中图分类】R-332;R282.71;R322.47;R969.1中药补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果实，具有温肾助阳，纳气平喘，温脾止泻的功效［1］。
实验六.肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定
院系：理学院专业：农药学学号：0931******* 姓名：王熠肝微粒体的制备及细胞色素P-450含量测定1 实验目的本实验通过超速离心法制备肝微粒体，利用Bradford法，学习并掌握了细胞色素P-450含量的测定。
2 实验原理研究体外药物代谢常用的方法是制备肝微粒体或线粒体后部分，将肝组织制备成20％匀浆，按1g肝组织加0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液3mL ，磨成匀浆，用低温高速离心制备线粒体后上清液和超速离心法制备微粒体（内质网部分）-差速离心法。
细胞色素P-450是微粒体混合功能氧化酶中最主要的功能成分，其含量的高低基本可以反映混合功能氧化酶的活力大小。
细胞色素P-450是一种血红蛋白，当铁蛋白的铁离子被还原并与一氧化碳形成复合物时出现一种特异吸收峰，在波长450nm处呈现最大吸收峰，在490nm处为最低吸收。
根据两者的差值和吸收系数，可定量细胞色素P-450含量。
3 实验材料3.1实验动物大鼠：健康，体重200～250g，禁食过夜（24h）3.2实验器材与试剂器材：低温高速离心机、洁净工作台、匀浆器、注射器、手术剪、低温冰箱、液氮罐等试剂：1.17% KCl 溶液Tris-HCl缓冲液： Tris 6.05 g ；蔗糖 68.4 g；水 500 ml；浓盐酸调 pH 7.4；补水至 1000 ml4.实验方法4.1动物处理与匀浆制备断头处死，放尽血液，迅速剖开胸、腹腔，取出肝脏，用冰冷1.17% KCl 溶液洗净血污，并用滤纸吸干表面水分。
肝脏称重，置烧杯中剪碎，按每克肝脏3ml的比例加入0.25mol/L蔗糖溶液或pH7.4 Tris-HCl缓冲液，匀浆，将匀浆倒入离心管中，用缓冲液洗涤匀浆管，使最后的缓冲液体积加至约20％（W/V）的匀浆。
4.2制备线粒体后上清液将肝匀浆置低温高速离心，以沉淀未破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液即为线粒体后上清液。
药物代谢中的肝细胞色素P450
药物代谢中的肝细胞⾊素P450D evelop m en t i n the I mm unomagnetic PreparationXu M in J iang L iliZ hej iang H osp ita l of T rad itiona l Ch inese M ed icine,H ang z hou 310006Abstract I mm unom agnetic p reparati on is one of the novel targeting p reparati ons,w h ich is developed since1990’s.T he article deals w ith i m m unom agnetic m icro spheres and i m m unom agnetic beads,including their p reparati on,effective p rinci p le and app licati ons.Key words T argeting p reparati on I mm unom agnetic m icro sphere I mm unom agnetic bead(收稿:1998207220,修回:1998210207)药物代谢中的肝细胞⾊素P450骆⽂⾹ 张银娣(南京医科⼤学临床药理研究所 南京 210029)摘 要 肝细胞⾊素P450参与许多外源性物质(包括药物)的⽣物转化。
本⽂从肝细胞⾊素P450在体内的分布及命名,被诱导和抑制的机制,对映体代谢的选择性与代谢差异遗传多态性以及国内外关于P450的研究⽅法等⽅⾯介绍了该领域研究的新进展。
关键词 细胞⾊素P450 药物代谢 ⽴体选择性 遗传多态性许多外源性脂溶性的⾮营养物质在体内需经过⽣物转化过程,肝脏是⼈体进⾏⽣物转化I相反应的主要场所。
参与⽣物转化的酶类是由⼀个庞⼤的基因家族编码调控的依赖细胞⾊素P450的混合功能氧化酶系统,其中主要成分是细胞⾊素P450。
代谢稳定性研究中肝微粒体与肝细胞的差异
代谢稳定性作为化合物重要的ADME性质，其影响着化合物在机体内的清除率、半衰期和口服生物利用度。
由此，代谢稳定性研究常作为早期化合物筛选的重要环节，其对于优势化合物的筛选、指导结构修饰、预测体内清除率、构建IVIVC和预估剂量等具有重要意义。
目前常用于代谢稳定性研究的高通量方法主要包括肝微粒体、肝细胞和肝S9，其中肝微粒体代谢稳定性（LMS）和肝细胞代谢稳定性（HMS）最为常见。
而化合物在LMS和HMS中结果存在差异的现象时有发生，那么针对这种情况，我们难免会产生一些疑问，导致差异存在的内在因素是什么？找到差异的原因是否可以对化合物结构改造有利？选择哪个数据作为评价化合物的标准值？该采用哪个数据去预测人体清除率？下文将带着这些疑问进行阐述。
1 肝微粒体与肝细胞的差别要想弄清楚化合物LMS和HMS的差异，首先我们必须要了解肝微粒体和肝细胞本身。
肝脏组织匀浆后高速离心上清液即为S9，再经超高速离心后底部沉淀重悬即为微粒体，肝微粒体酶主要源于肝细胞内质网，包含CYP、水解酶和UGT。
由肝微粒体的制备过程可知肝微粒体失去了细胞完整结构，药物可直接暴露于代谢酶中。
另外肝细胞胞质中还存在部分肝微粒体缺失的代谢酶，如醛氧化酶（AO）、黄嘌呤氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等，下表附有各类药物代谢酶在肝细胞中的定位。
此外，由于肝细胞完整的细胞结构，其细胞膜表面表达有各类药物相关转运体蛋白，如OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、BCRP、BSEP等摄入或外排转运体，下图附有肝细胞中转运体表达情况。
(摘至《Donglu Zhang,Sekhar Surapaneni - ADME-Enabling Technologies inDrug Design and Development》一书)（参考Membrane transporters in drug development一文）2 LMS和HMS结果存在差异的原因此处将LMS和HMS的差异的原因分为机制性的原因和经验性的原因。
第二次理论课 特殊毒性试验
4 ℃，9000g，离心10min
（3）S9混合液： 平衡盐系统，其中含S9 5～30％（v/v）
试验方法
（标准平皿掺入法）：
顶层琼脂＋测试菌株、 受试物、S9混合液 底层琼脂培养基平皿 固化 （点试法）： 37 ℃，培养48h 菌落计数
结果评价：
Rt/Rc≥2，并有量效关系，判为阳性；
滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落。
阴性（－） 可疑（±） 弱阳性（＋） 中度阳性（＋＋） 强阳性（＋＋＋）
•注意：遇阳性或可疑阳性时，可选啮齿动物显性致死试验或精原细胞染色体畸变试验
正常染色体
畸变染色体
3.啮齿类动物体内微核试验
微核 （Micronucleus）：染色单体或染色体的无着丝点断片，或
因纺锤体受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期，仍然遗留在细胞 质中。末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的 胞质内，因比主核小，故称为微核。
药物特殊毒性研究
内容：
遗传毒性 致癌作用 生殖和发育毒性 药物依赖性
致癌试验
致癌试验的目的
是考察药物在动物体内的潜在致癌作用，从而评价和预测其可能对人 造成的危害。
任何体外实验、动物毒性试验和人体应用中出现的潜在致癌性因素均可提示 是否需要进行致癌试验。
由于致癌试验耗费大量时间和动物资源，只有当确实需要通过动物长期给药研 究评价人体中药物暴露所致的潜在致癌性时，才应进行致癌试验。
不适用受试物
用于晚期全身肿瘤的抗肿瘤药物，通常不需要进行致癌试验。 对于替代治疗的内源性物质（浓度在生理水平），尤其是 当同类产品（如动物胰岛素、垂体来源的生长激素和降钙素） 已有临床使用经验时，通常不需要进行致癌试验 系统暴露量非常小的局部用药不需要以经口给药途径来评价 其对内脏器官的潜在致癌作用，若有潜在光致癌性担忧， 可能需要进行皮肤给药致癌试验。 除非有明显的全身暴露或相关担忧，经眼给予的药物通常 不需要进行致癌试验 有致癌潜在，但是短期接触或非经常使用药物（麻醉/放射） 经化学合成、从动物或人体组织中提取纯化或生物技术方法 （如重组DNA技术）生产的内源性肽类或蛋白质及其类似物， 可能需要特殊考虑。
体外肝代谢系统
体外肝代谢系统【摘要】肝药酶在药物代谢中具有十分重要的作用。
对肝药酶的研究方法中，以动物肝脏或肝细胞为基础，构建体外肝代谢系统是体外代谢研究中最重要的环节之一。
对体外肝代谢的研究，主要是利用肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞培养、肝组织切片及离体肝灌流系统等方法。
本文综述近年国内外所应用的不同体外肝代谢系统，并对各体外代谢研究方法进行比较，指出根据各系统的特性、不同的实验要求和目的，选择适当的研究方法的重要性。
【关键词】细胞色素P450酶；肝微粒体；肝细胞培养；肝组织切片；离体肝灌流药物代谢一般是指药物的生物转化。
药物经生物转化后，可引起药物的药理活性或∕和毒理活性的改变。
因此，研究药物的生物转化，明确其代谢过程，对新药开发、新剂型设计及制定合理的临床用药方案等方面都具有重要的指导意义。
肝脏是药物生物转化的重要器官，含有参与药物代谢重要的酶系组成，主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族［1］。
本文所介绍的各种体外代谢系统均含有一种或多种CYP450酶的同工酶，为研究药物体外代谢提供了研究的对象和基础。
动物肝体外代谢研究可以较好地排除体内因素干扰，直接观察酶对底物代谢的选择性，为整体试验提供可靠的科学依据。
以肝脏为基础的体外代谢系统主要包括肝微粒体、基因重组CYP450酶系、肝细胞、肝组织切片及离体肝灌流。
1肝微粒体肝微粒体的制备多数采用差速离心法［2］，通过高速离心使微粒体与其他成分分离，操作简单，无需其他试剂辅助。
但较耗时，设备要求高，使该法的普及和深入研究受到一定的限制。
针对这些情况，可采用试剂辅助分离的方法［3］，在离心前额外加入一定比例的PEG6000或CaCl2，促进微粒体沉降。
此法对设备要求降低，并缩短了实验周期。
肝微粒体的制备过程均应在4℃下进行。
正确、合理地选择缓冲液，能起到良好介质的作用，按比例加入后进行肝组织的破碎和匀浆，才可有效分离肝微粒体和避免细胞器受损。
肝微粒体的主要应用测定CYP450酶活性测定原理是在特定酶催化下，底物在辅助因子以及适合的温度、时间作用下反应，借助仪器测定生成的特定产物量。
药物在肝微粒体酶的体外代谢研究
供依据？（即体外人和动物代谢特征研究, In vitro metabolism profiling in animals and humans）
药物相互作用实验过程
• 采用与代谢稳定性一致孵育体系，冰浴上加入1 µL的一系列浓度的待 测化合物（1、10、100、1000、10000 µM）和1 µL的各特异性探针 底物（空白对照样品不加待测化合物，只加等量溶剂），在37 ℃水 浴中预热5 min，然后冰浴上加入5 µL的肝微粒体酶，轻轻混匀，根据 不同的探针底物在37 ℃水浴中孵育10~30 min，加入有机溶剂混匀终 止反应，每个浓度组设3个平行样品。其中待测化合物浓度为0.01、 0.1、1、10、100 µM。反应结束后，采用LC-MS/MS方法测定各特异 性底物对应的代谢产物的生成量，考察不同浓度的药物对各个特异性 探针底物代谢速率的影响。
不同种属的代谢稳定性实验
• 采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系，一致的实验过程，分别加不
同种属的肝微粒体酶孵育，通过不同种属中药物剩余量的百分比的对
数与反应时间做曲线，求斜率，计算不同种属的代谢半衰期和清除率，
比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接
近程度，最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考。
常见P450抑制剂和诱导剂
代谢稳定性评价
• 代谢稳定性考察的是化合物被代谢的难易程度和体外清除率的大小， 常用体外代谢半衰期（T1/2）和固有清除率（CLint）表示。一般通过定 量测定目标化合物在酶孵育体系中的清除情况来计算。
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抗肿瘤肝微粒体代谢种属比较研究报告目录1研究目的 (3)2 材料与方法 (3)2.1药品 (3)2.2样品及预处理方法 (3)2.3仪器和条件 (3)2.4数据分析 (4)3 结果 (4)3.1抗肿瘤对照品溶液的UPLC-UV/Q-TOF MS分析 (4)3.2UPLC-UV/Q-TOF MS法鉴定肝微粒体孵育液中的抗肿瘤相关代谢产物 (4)3.2.1 M0（[M+H]+，m/z 809.265） (5)3.2.2 M1（[M+H]+，m/z 212.101） (5)3.2.3 M2（[M+H]+，m/z 364.129） (5)3.2.4 M3（[M+H]+，m/z 380.125） (5)3.2.5 M4（[M+H]+，m/z 464.147） (6)3.2.6 M5（[M+H]+，m/z 480.142） (6)3.2.7 M6（[M+H]+，m/z 709.210） (6)3.2.8 M7（[M+H]+，m/z 825.259） (6)4 结论 (7)附图 (8)附表 (23)1研究目的本研究比较抗肿瘤在人、猴、犬、大鼠和小鼠五个种属肝微粒体中代谢过程的差异，为临床前药动学和安全性评价研究动物种属的选择提供参考。
2 材料与方法2.1 药品抗肿瘤储备液由美迪西普亚医药科技（上海）有限公司提供。
2.2 样品及预处理方法肝微粒体样品由美迪西普亚医药科技（上海）有限公司提供。
取肝微粒体双样本样品各60 μL合并，获得人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体的0 min和60 min样品。
加入360 μL乙腈沉淀蛋白，离心10 min（4000 rpm）。
全取上清液于40 o C空气下吹干，残留物用120 μL乙腈/水（1:9, v/v）溶解，涡流混合。
取 2.0 μL进行UPLC-UV/Q-TOF MS分析。
2.3仪器和条件仪器美国Waters公司Synapt G2-Si型四极杆-飞行时间串联质谱仪（Q-TOF MS），配有电喷雾电离源（ESI源）和Acquity UPLC H-CLASS液相色谱系统。
色谱条件色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 C18 column（2.1 ×100 mm I.D.，1.7 µm粒径），美国Waters公司；柱温为45ºC；流速为0.4 mL/min；紫外检测波长200 –600 nm，流动相梯度见下表。
质谱条件离子源为电喷雾电离源（ESI），正离子扫描方式检测，去溶剂气（氮气）流速为750 L/h，去溶剂气温度为350 o C，源温度为120 o C，毛细管电压为3.0 kV。
低能量扫描时传输碰撞能量为2 eV，阱碰撞能量为2 eV；高能量扫描时传输碰撞能量为12 –18 eV，阱碰撞能量为18 –32 eV。
扫描范围为m/z 50 –1200。
选取400 ng/mL的亮氨酸-脑啡肽（m/z 556.2771）作为质荷比校正外标物，流速为6 µL/min。
2.4 数据分析采用Waters公司的Masslynx V4.1软件进行数据采集，采用Waters公司的Masslynx V4.1中的子软件MetaboLynx XS进行数据分析。
3 结果3.1 抗肿瘤对照品溶液的UPLC-UV/Q-TOF MS分析首先对抗肿瘤对照品溶液进行UPLC-UV/Q-TOF MS分析，推测质谱裂解规律，为其他代谢产物结构推测奠定基础。
在本研究选取的色谱条件下，抗肿瘤的色谱保留时间为7.74 min（图1A和1B），一级全扫描质谱图中（图1C），获得m/z 809.265的准分子离子（[M + H]+）。
在高碰撞能量下，产生m/z 112.048、272.046、387.069、524.093、661.117和735.192的碎片离子。
为了便于描述，将抗肿瘤结构中的两个羧酸酯键分别命名为酯键A和酯键B。
推测的抗肿瘤的质谱裂解途径如图2所示。
本试验将根据这些质谱断裂特点，鉴定抗肿瘤在肝微粒体中的代谢产物（图3和4）。
代谢物按照分子量和保留时间依次命名。
3.2 UPLC-UV/Q-TOF MS法鉴定肝微粒体孵育液中的抗肿瘤相关代谢产物与孵育0 min的肝微粒体比较，在孵育60 min肝微粒体样品中主要发现8种相关离子，其质荷比分别为m/z 809.265、212.101、364.129、380.125、464.147、480.142、709.210和825.259，分别命名为M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7。
其中M3检测到两个色谱峰，根据保留时间分别命名为M3-1和M3-2；M7检测到三个色谱峰，根据保留时间分别命名为M7-1、M7-2和M7-3。
在人肝微粒体孵育体系中检测到所有代谢物M0、M1、M2、M3、M4、M5、M6和M7（图3A）。
在猴肝微粒体孵育体系中检测到M1、M2、M3-1、M4、M5和M7-2（图3B）。
在犬肝微粒体孵育体系中检测到M0、M1、M2、M3-1、M4、M5、M6和M7-2（图3C）。
在大鼠肝微粒体孵育体系中检测到代谢物M1、M2、M3-1和M4（图3D）。
在小鼠肝微粒体孵育体系中检测到代谢产物M1、M2、M3-1、M4和M5（图3E）。
这些离子的精确质量信息以及可能元素组成见表1。
为了确定这些相关离子对应的结构，对这些离子进行产物离子全扫描质谱分析。
3.2.1 M0（[M+H]+，m/z 809.265）在人和犬肝微粒体中能检测到M0，以人肝微粒体样品为例对M0的鉴定加以说明。
从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 809.265，在保留时间t R为7.75 min 出现一个色谱峰（图5-1），命名为M0。
M0与抗肿瘤对照品溶液的色谱保留时间以及质谱行为相同，确定M0是未被代谢的原形药物抗肿瘤。
3.2.2 M1（[M+H]+，m/z 212.101）在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中均能检测到M1，以人肝微粒体样品为例对M1的鉴定加以说明。
从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z212.101，在保留时间t R为5.37 min出现一个色谱峰（图5-2），命名为M1。
根据精确质量，推测M1的分子式为C9H13N3O3，比原形减少C23H27N3O11F4。
在高碰撞能量下，M1产生与原形相同的碎片离子m/z112.051。
碎片离子m/z156.041为末端丁基断裂后产生，因而推测M1为原形N-去烷基化的代谢产物。
3.2.3 M2（[M+H]+，m/z 364.129）在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中均能检测到M2，以人肝微粒体样品为例对M2的鉴定加以说明。
从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z364.129，在保留时间t R为5.86 min出现一个色谱峰（图5-3），命名为M2。
根据精确质量，推测M2的分子式为C14H19F2N3O6，比原形减少C18H21N3O8F2。
在高碰撞能量下，M2产生与原形相同的碎片离子m/z112.051。
碎片离子m/z308.069为末端丁基断裂后产生。
因而推测M2为原形酯键A水解的代谢产物。
3.2.4 M3（[M+H]+，m/z 380.125）从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z380.125，在保留时间t R为4.38和4.62 min各出现一个色谱峰（图5-4），分别命名为M3-1和M3-2。
在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中能检测到M3-1，而M3-2仅在人肝微粒中检测到。
以人肝微粒体样品为例对M3的鉴定加以说明。
根据精确质量，推测M3的分子式为C14H19F2N3O7，比原形减少C18H21N3O7F2。
在高碰撞能量下，M3-1和M3-2产生相似的碎片离子。
碎片离子m/z 156.041和308.069与M2的碎片离子相同。
碎片离子m/z 228.098比M2的碎片离子m/z 212.104增加了16 Da，因而推测M3为M2羟基化的代谢物。
3.2.5 M4（[M+H]+，m/z 464.147）在人、猴、犬、大鼠和小鼠肝微粒体中均能检测到M4。
从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 464.147，在保留时间t R为6.37 min出现一个色谱峰（图5-5），命名为M4。
根据精确质量，推测M4的分子式为C18H23F2N3O9，比原形减少C14H17N3O5F2。
在高碰撞能量下，M4产生原形相同的碎片离子m/z112.051。
碎片离子m/z 156.041和212.103与M2的碎片离子相同。
因而推测M4为原形酯键B水解的代谢产物。
3.2.6 M5（[M+H]+，m/z 480.142）在人、猴、犬和小鼠肝微粒体中均能检测到M5。
以人肝微粒体样品为例对M5的鉴定加以说明。
从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z480.142，在保留时间t R 为4.99 min出现一个色谱峰（图5-6），命名为M5。
根据精确质量，推测M5的分子式为C18H23F2N3O10，比原形减少C14H17N3O4F2。
在高碰撞能量下，M5产生与原形相同的碎片离子m/z272.046。
碎片离子m/z 390.075比M4的碎片离子m/z364.096增加了16 Da。
因而推测M5为M4羟基化的代谢产物。
3.2.7 M6（[M+H]+，m/z 709.210）仅在人和犬肝微粒中能检测到M6。
以人肝微粒体样品为例对M6的鉴定加以说明。
从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 709.210，在保留时间t R为6.00 min 出现一个色谱峰（图5-7），分别命名为M6。
根据精确质量，推测M6的分子式为C27H32F4N6O12，比原形减少C5H8O2。
在高碰撞能量下，M6产生与原形相同的碎片离子m/z 112.050、272.048、387.071和524.093，因而推测M6为原形酰胺水解的代谢产物。
3.2.8 M7（[M+H]+，m/z 825.259）从人肝微粒体MDF色谱图中选择性检测m/z 825.259，在保留时间t R为6.63、6.69和6.88 min各出现一个色谱峰（图5-8），分别命名为M7-1、M7-2和M7-3。
M7-1和M7-3仅在人肝微粒中能检测到，而M7-2可在人、猴和犬肝微粒中被检测到。
根据精确质量，推测M7的分子式为C32H40F4N6O15，比原形增加一个O。
在高碰撞能量下，M7-1~M7-3生成相似的二级图谱，均产生与原形相同的碎片离子m/z 272.047、387.081、524.095、661.118和735.189。
碎片离子m/z 751.176比原形的碎片离子m/z 735.189增加16 Da，因而推测M7-1~M7-3均为原形羟基化的代谢产物。
4 结论抗肿瘤在人肝微粒体中孵化60 min后，仅检测到少量原形药物，共检测到10种代谢产物。