咖啡因在大鼠及小鼠肝微粒体中体外代谢种属差异研究
nnk是烟草中特有的一种物质
nnk是烟草中特有的一种物质，可以诱导肺癌的发生。
卷烟燃烧可产生4000多种化学物质，其中40余种有明确的诱变/致癌性。
主要的致癌物有烟草特有亚硝胺（TSNA）、苯并（a）芘、多环芳烃（PAH），芳香胺、苯、二嗯英、儿茶酚及致癌的醌、肼类等。
TSNA是尼古丁被亚硝化的产物，4-（甲基亚硝氨基）-3-吡啶-1-丁酮（NNK）是已知7种TSNA中最强的致癌源。
NNK在主流、侧流烟气及不燃烧的烟草中均大量存在。
NNK是卷烟致癌的主要标志物，尼古丁是吸烟成瘾的主要原因。
Efficient Bioelectronic Actuation of the Natural Catalytic Pathway ofHuman Metabolic Cytochrome P450sSadagopan Krishnan,†Dhanuka Wasalathanthri,†Linlin Zhao,†John B. Schenkman,‡and James F. Rusling*,†,‡Herein, we describe fabrication of LbL films made by combining pure cyt P450s with CPR microsomes on electrodes to achieve a large ratio of cyt P450 to CPR (Figure 1), as in the human liver.1,2,40 Electrons are injected into the film from the electrode to accurately mimic the natural cyt P450 catalytic cycle at high catalytic turnover.We provide unambiguous evidence for electron transfer from electrode to CPR to cyt P450 from measured redox potentials, electron transfer rates, enzyme turnover rates, and carbon monoxide (CO) binding. Results suggest dynamic participation of a CPR-cyt P450 complex in a key equilibrium redox process facilitating efficient catalytic turnover of the excess cyt P450s. In addition, the electrode-driven turnover rate for a model oxidation reaction was as good as or better than when NADPH was utilized.这里我们主要叙述了层层膜结构通过将纯的P450酶和P450还原酶连接到电极上来实现像人体中从P450酶到P450还原酶一个较大差异，电子从电极中被送到膜中，准确模拟再高催化转化情况下的p450的催化过程。
药物代谢研究的技术与方法
药物代谢研究的技术与方法药物代谢是指药物在人体中的分解、转化和排泄过程。
药物代谢过程涉及到许多酶系统和代谢通路，不同的药物会通过不同的代谢途径进行代谢。
药物代谢研究对于药物开发和临床应用具有重要意义。
下面介绍几种常用的药物代谢研究技术与方法。
1. 体内代谢试验体内代谢试验是研究药物在整个机体内的代谢过程，常用的方法有体外实验动物试验和人体试验。
体外试验通常使用小鼠、大鼠、兔子和犬等实验动物，人体试验则需要遵循严格的伦理审查和安全措施。
通过体内代谢试验，可以了解药物的药代动力学、药效学和通过药物代谢酶系统的代谢途径。
2. 体外代谢试验体外代谢试验是研究药物在体外模拟环境中的代谢过程，包括微粒体酶体和肝酶体代谢试验。
微粒体酶体代谢是指药物在细胞质中的代谢，而肝酶体代谢则是指药物在肝细胞的内质网中的代谢。
通过体外代谢试验，可以获得关于药物代谢酶的详细信息和药物代谢通路的理解。
3. 体外代谢酶体系体外代谢酶体系是建立在包含药物代谢酶的部分纯化物中的体外代谢试验。
这种方法可以对药物代谢酶进行更加详细的分析，包括其结构、功能和识别机制等。
体外代谢酶体系可以被广泛应用于药物代谢研究、药物安全性评估和药物治疗反应预测等领域。
4. 代谢产品分离代谢产品分离是一种直接从样品中获得药物代谢产品的方法，包括代谢产物分离和纯化，以及将代谢产物通过质谱技术或结合质谱和其他分析技术进行鉴定和定量。
这种方法可以便捷地获得药物代谢产物，为药物代谢途径和代谢酶系统的研究提供重要信息。
5. 分子生物学方法分子生物学方法包括克隆、表达和纯化药物代谢酶等。
这种技术可以通过基因工程技术对特定酶进行修改和优化，以便更好地研究药物代谢通路和药物代谢产物。
此外，这种方法还可以筛选新的药物代谢酶和新的代谢产物，推动药物发现和开发。
总结来说，以上几种药物代谢研究技术与方法各有所长，相互补充，可以为药物代谢的探索和理解提供重要的工具和手段。
药物代谢研究的未来将继续探索新的技术和方法，以推进药物的研发和治疗。
大鼠肝微粒体代谢研究槲皮素对CYP1A2,CYP2E1,CYP3A2活性的影响及抑制机制(英文)
大鼠肝微粒体代谢研究槲皮素对CYP1A2,CYP2E1,CYP3A2活性的影响及抑制机制(英文)周江泉;汤致强【期刊名称】《中国药学：英文版》【年(卷),期】2005(14)4【摘要】目的体外代谢研究槲皮素对大鼠肝CYP1A2,CYP2E1,和CYP3A2活性的影响。
研究其抑制强度及抑制机制。
方法QU与底物共同温孵,HPLC检测底物特定的代谢产物生成量的变化反映对应亚酶的活性变化。
比较槲皮素与酮康唑,红霉素在相同浓度下对CYP3A2的抑制能力强弱。
不同浓度槲皮素对CYP3A2和CYP2E1底物代谢产物生成双倒数直线的影响初步分析槲皮素可能的抑制机制。
结果各HPLC检测方法线性相关系数均>0.9991,RSD均<8.4%,回收率91.1%-107.6%。
槲皮素在体外0～8μmol·L-1诱导大鼠肝微粒体CYP1A2的活性达338.1%,并抑制CYP2E1(49.2%),和CYP3A2(60.3%)。
槲皮素对CYP3A2的抑制能力在酮康唑和红霉素之间。
槲皮素竞争性抑制CYP3A2右美沙芬N脱甲基反应,非竞争性抑制CYP2E1氯唑沙宗6羟化反应。
结论槲皮素对多个CYP450亚酶有抑制作用,它是有效的CYP3A竞争性抑制剂。
做为黄酮类植物雌激素,槲皮素有分子结构的优势亦有对CYP450酶调控能力而具有未来抗肿瘤药物研究的潜力。
【总页数】6页(P231-236)【关键词】槲皮素;细胞色素P450;肝微粒体;高效液相色谱;抑制剂【作者】周江泉;汤致强【作者单位】中国医学科学院中国协和医科大学肿瘤医院药剂科【正文语种】中文【中图分类】R96【相关文献】1.六味地黄丸对大鼠肝微粒体代谢酶P450活性影响的研究 [J], 吴秀梅;杨小秋2.川阿格雷对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响 [J], 吴吉洋;唐原君;礼嵩;范国荣3.淫羊藿总黄酮对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响(英文) [J], 胡道德;姚慧娟;顾磊;王松坡;刘皋林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
羟基芫花素对UGTs及UGT1A1活性抑制作用种属差异的体外研究
羟基芫花素对UGTs及UGT1A1活性抑制作用种属差异的体外研究考察羟基芫花素对尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGTs）及UGT1A1活性的影响，为预测其与其他药物的代谢性相互作用提供理论借鉴。
该实验采用体外肝微粒体孵育模型，以4-硝基酚（4-NP）为底物检测UGTs活性；β-雌二醇为底物检测UGT1A1活性，利用UV和HPLC测定底物或代谢物含量。
结果表明，在大鼠、小鼠和人肝微粒体（HLM）孵育体系，羟基芫花素能显著抑制UGTs 活性；对UGT1A1，在小鼠肝微粒体（MLM）孵育体系中，羟基芫花素几乎无抑制作用（IC50=190 μmol·L-1）；在大鼠肝微粒体（RLM）和重组酶（rUGT1A1）孵育体系中，羟基芫花素表现为中等强度的抑制作用（IC50=10.93，20.07 μmol·L-1），抑制类型分别为竞争性抑制和线性混合型抑制；在HLM孵育体系中，羟基芫花素表现为弱抑制作用（IC50=76.31 μmol·L-1），抑制类型为竞争性抑制；其抑制强弱顺序为RLM>rUGT1A1>HLM>MLM。
综上，羟基芫花素对不同肝微粒体孵育体系中UGTs及UGT1A1活性均可产生抑制作用且存在种属差异性，提示羟基芫花素可能存在基于UGT1A1酶的药物相互作用。
该研究可为合理开发利用羟基芫花素提供实验依据，并为研究药物在临床上的联合用药提供理论借鉴。
标签：羟基芫花素；UGTs；UGT1A1；相互作用；肝微粒体；体外[Abstract]To predit the mechanism of metabolic drug-drug interactions of hydroxygenkwanin with other drugs，we investigated the inhibition inhibitory effect of hydroxygenkwanin on UGTs and UGT1A1 activities of different liver microsomes. In the present study，4-nitrophenol （4-NP）and β-estradiol were elected as substrates to determine activities of UGTs and UGT1A1 by UV and HPLC，respectively. The results showed that，hydroxygenkwanin significantly inhibited UGTs activity in rat，mouse and human liver microsomes. UGT1A1 activity was inhibited by hydroxygenkwanin to varying degrees，with IC50 about 190，10.93，20.07，76.31 μmol·L-1 in mouse liver microsome（MLM），rat liver microsome （RLM）and recombinant UGT1A1，and human liver microsome （HLM），respectively. The inhibition types were competitive inhibition （RLM，HLM）and linear mixed-typed linear inhibition （recombinant UGT1A1）. The order for the inhibitory intensity was RLM>rUGT1A1>HLM>MLM. In conclusion，hydroxygenkwanin has an inhibitory effect on UGTs and UGT1A1 activities of different liver microsomes，with differences in species，indicating its potential drug interactions based on UGT1A1 enzyme. This study aims to provide a reliable experimental basis for its further research and development of hydroxygenkwanin，and provide theoretical reference for the clinic drug combination research.[Key words]hydroxygenkwanin；UGTs；UGT1A1；interaction；liver microsomes；in vitro羟基芫花素（hydroxygenkwanin，HGK，图1）为天然黄酮类化合物，此类化合物广泛存在于多种抗肿瘤功效的中药材中，如芫花、虎杖、藜芦；具有祛痰、镇咳、抗氧化、抗菌、抗肿瘤等广泛生物学活性[1]。
药物在肝微粒体酶的体外代谢研究
C还原酶传递，还原成P-450 Fe2+药物。 • 接受一分子氧：P450 Fe2+药物中的低铁血红素能与分子氧结合。 • 再接受电子还原： O2—P—Fe2+—药物再接受两个电子，由NADPH提供
谢谢大家
药物相互作用实验过程
• 采用与代谢稳定性一致孵育体系，冰浴上加入1 µL的一系列浓度的待 测化合物（1、10、100、1000、10000 µM）和1 µL的各特异性探针 底物（空白对照样品不加待测化合物，只加等量溶剂），在37 ℃水 浴中预热5 min，然后冰浴上加入5 µL的肝微粒体酶，轻轻混匀，根据 不同的探针底物在37 ℃水浴中孵育10~30 min，加入有机溶剂混匀终 止反应，每个浓度组设3个平行样品。其中待测化合物浓度为0.01、 0.1、1、10、100 µM。反应结束后，采用LC-MS/MS方法测定各特异 性底物对应的代谢产物的生成量，考察不同浓度的药物对各个特异性 探针底物代谢速率的影响。
不同种属的代谢稳定性实验
• 采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系，一致的实验过程，分别加不
同种属的肝微粒体酶孵育，通过不同种属中药物剩余量的百分比的对
数与反应时间做曲线，求斜率，计算不同种属的代谢半衰期和清除率，
比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接
近程度，最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考。
实验过程和代谢稳定性实验一致只是选用的肝微粒体为几种不同种属不同种属的代谢稳定性实验?采用跟前面代谢稳定性一致的代谢体系一致的实验过程分别加不同种属的肝微粒体酶孵育通过不同种属中药物剩余量的百分比的对数与反应时间做曲线求斜率计算不同种属的代谢半衰期和清除率比较不同动物种属的肝微粒体的代谢性质和人肝微粒体代谢性质的接近程度最终为后期的体内药代动力学评价动物选择提供参考
大鼠肝微粒体孵育体系中2种成分的测定及其代谢
大鼠肝微粒体孵育体系中2种成分的测定及其代谢邓少东;王颖;赵文昌;肖凤霞;林靖然;段倩倩【期刊名称】《中成药》【年(卷),期】2017(039)005【摘要】目的测定大鼠肝微粒体孵育体系中2种成分的含有量,并考察其在不同时间点(0、20、40、60、80、100、120 min)的代谢情况.方法 UPLC分析采用Waters BEH C1s色谱柱(3.0 mm×100 mm,1.7 μm);流动相甲醇-0.1％醋酸,梯度洗脱;体积流量0.5 mL/min;柱温30℃;检测波长338 nm.结果野漆树苷和芹菜素分别在3.714 ～37.143μg/mL(r=0.999 0)和3.729～37.286 μg/mL(r=0.999 6)范围内线性关系良好,方法回收率(RSD)分别为89.44％～ 93.75％ (0.78％～1.59％)和88.06％～93.98％ (0.91％～2.14％).两者在体外肝微粒体孵育体系的Ⅰ相代谢均呈线性消除,其中芹菜素更为显著.结论该方法简单、快速、可靠,可用于测定大鼠肝微粒体孵育体系中野漆树苷和芹菜素的含有量和代谢情况.【总页数】4页(P1002-1005)【作者】邓少东;王颖;赵文昌;肖凤霞;林靖然;段倩倩【作者单位】广东医科大学第二临床医学院科研平台,广东东莞523808;广东医科大学第二临床医学院科研平台,广东东莞523808;广东医科大学药学院,广东东莞523808;广州中医药大学中药学院,广东广州510006;广州中医药大学中药学院,广东广州510006;广州中医药大学中药学院,广东广州510006【正文语种】中文【中图分类】R284.1【相关文献】1.三物黄芩汤组分(群)配伍在大鼠肝微粒体孵育模型中的相互作用 [J], 周杰;商雪莹;杜慧琴;卢丽萍;张蕾2.LC-MS/MS定量测定大鼠和人肝微粒体孵育液中丁苯酞浓度方法的建立 [J], 赵芊;李燕;江骥;胡蓓3.大黄5种蒽醌类成分在大鼠肝微粒体中的代谢及酶促反应动力学 [J], 冯素香;王蒙蒙;吴兆宇;李先;郝蕊;徐艳华4.肝微粒体孵育体系中大黄酸及其代谢活化产物的检测方法研究 [J], 李恩泽;袁媛;邵华5.东莨菪内酯在大鼠肝微粒体孵育体系中的代谢产物分析及其含药血清对大鼠肝星状细胞的影响 [J], 杨增艳; 张颖; 李嘉; 陈少锋; 黄鑫; 靳洪涛因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
药物化学中的药物代谢途径研究
药物化学中的药物代谢途径研究药物代谢是指药物在人体内发生的一系列化学变化过程，研究药物代谢途径对于药物的安全性、有效性以及用药指导具有重要意义。
本文将就药物化学中的药物代谢途径研究展开论述。
一、药物代谢的意义及研究方法药物代谢对于药物的药理学效应、毒性以及临床应用都具有深远的影响。
药物代谢途径的研究可以帮助我们了解药物在人体内的转化情况以及体内与药物相互作用的机制，从而指导合理用药和避免药物不良反应的发生。
药物代谢途径的研究主要通过体外试验、体内试验以及体外与体内的联合试验进行。
体外试验主要包括体外肝脏微粒体试验（S9试验）、重组酶系统试验以及酶活性测定等。
体内试验则主要通过动物模型研究药物代谢途径，如小鼠、大鼠、猴子等。
体内和体外的联合试验可以更全面地了解药物代谢的情况，避免单一方法的局限性。
二、药物代谢途径的分类及研究进展根据药物代谢途径的不同，可以将其分为两大类：氧化还原代谢途径和非氧化还原代谢途径。
氧化还原代谢途径是指药物在氧化酶的参与下发生氧化还原反应，如脱酰基、氧化、脱氢等。
非氧化还原代谢途径则包括水解、酯酶催化等非氧化还原反应。
近年来，随着基因组学和蛋白质组学的发展，药物代谢途径的研究进展迅猛。
通过对药物代谢途径与相关基因的关联性研究，可以指导药物的个体化用药，提高药物疗效并降低不良反应的风险。
三、药物代谢途径的临床应用了解药物的代谢途径对于临床药物应用和剂量调整非常重要。
在临床上，药物代谢途径的研究可以为合理用药提供依据，例如通过调整药物剂量和给药途径来提高药物的疗效。
另外，药物代谢途径的研究还可以指导药物相互作用的评估，预防药物不良反应。
四、药物代谢途径研究的挑战与展望在药物化学中，药物代谢途径的研究仍然面临一些挑战。
首先，药物代谢途径的研究需要多个学科的交叉合作，如药理学、生物化学、分子生物学等。
其次，药物代谢途径研究需要大量的试验数据和技术手段的支持，对研究人员的实验技术要求较高。
咖啡因对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用
0105, 3 3 P < 0101
3. 2 咖啡因对急性酒精性肝损伤小鼠肝匀浆中的 SOD 活性 、MDA含量的影响 结果如表 3所示 ,与 正常组比较 ,模型组小鼠肝匀浆中 MDA 的含量显 著上升 ,而 SOD 活性显著降低 。咖啡因组 ( 30 mg / kg)能显著降低模型小鼠肝匀浆中 MDA 的含量 ,咖 啡因组 (15、30 mg / kg)能显著升高模型小鼠肝匀浆 中 SOD 活性 。
MDA
( nmol/mgp rot) 5. 07 ±0. 83 8. 30 ±2. 96△△ 7. 81 ±2. 30 8. 23 ±1. 46 6. 94 ±1. 313 5. 90 ±1. 203 3
与正常组比较 : △ P < 0105, △△ P < 0101; 与模型组比较 : 3 P <
表 3 咖啡因对急性酒精性肝损伤
小鼠肝组织的 SOD、MDA的影响 (珋x ±s, n = 10)
组别 正常 模型 咖啡因
凯西莱
剂量
(mg/ kg) 5 15 30 30
SOD
(U /mgp rot) 28. 77 ±4. 08 17. 63 ±4. 28△△ 19. 91 ±1. 83 22. 49 ±4. 343 23. 39 ±3. 893 3 25. 03 ±4. 873 3
◇药学研究 ◇
安徽医科大学学报 A cta U n iversita tis M ed icina lis A nhu i 2009 Jun; 44 (3)
·359·
咖啡因对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用
陈 震 1, 2 ,吕雄文 1 ,李 俊 1 ,张 磊 1 ,刘洪峰 1 ,黄 成 1 ,朱鹏里 1
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咖啡因在大鼠及小鼠肝微粒体中体外代谢种属差异研究咖啡因及其代谢产物在临床应用中具有重要作用，该文拟采用高分辨质谱系统对咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体代谢进行系统研究，以全面评价咖啡因体外代谢产物以及体外代谢的种属间差异。
采用基于MMDF的UPLCQTOFMS/MS高分辨质谱系统，借助metabolitepolite软件，分析咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体代谢的产物及种属差异。
研究发现咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体后产生除以往分析中的去甲基、氧化等产物之外，还存在甲基化、双氧化、脱水以及脱羰基新的代谢产物，并发现大鼠及小鼠体外代谢的明显差异。
在小鼠体外代谢物中发现的去甲基代谢物M2（C7H8N4O2）和脱羰基代谢物M6（C7H10N4）在大鼠体外代谢物中并为发现，但是在大鼠体外代谢中发现的M7（C8H12N4O5），在小鼠中并未发现。
咖啡因药物在大鼠及小鼠的体外代谢存在明显种属差异，将对咖啡因进一步代谢研究及安全性评价提供重要参考价值。
标签：咖啡因；微粒体；代谢；种属差异[Abstract]Caffeine and its metabolic products play an important role in clinical applications An ultrahigh performance liquid chromatography/quadrupole timeofflight mass spectrometry （UPLCQTOF MS/MS）method was applied to systemically study the caffeine metabolism in liver microsomes of rats and mice，and comprehensively evaluate caffeine metabolites in vitro and metabolism differences between species The caffeine metabolites and metabolism differences between species in liver microsomes of rats and mice were analyzed by UPLCQTOFMS/MS high resolution mass spectrometry system and metabolitepolite software The results showed that in addition to the demethylated and oxidized products in previous analysis，methylated，double oxidized，dehydrated and decarbonylated metabolites were also found in caffeine metabolism in liver microsomes of rats and mice，with significant difference in metabolism in vitro between rats and mice The demethylated metabolite M2（C7H8N4O2）and decarbonylated metabolite M6（C7H10N4）in metabolism in vitro of mice were not found in rats，and the in vitro metabolite M7（C8H12N4O5）in rats were not found in mice There was significant species difference in caffeine metabolism in vitro between rats and mice，providing important reference value for the further metabolism study and safety evaluation of caffeine[Key words]caffeine；microsomes；metabolism；species differencesdoi：10.4268/cjcmm20161028药物在体内的代谢过程导致药物的药理活性发生变化，直接引起药物活性变化和安全性的风险，药物代谢在新药的设计与开发，药物临床前评价与研究，治疗药物检测以及药物安全性评价等方面都具有重要意义[1]。
但是在实际的临床前评价中并不能直接在人体进行实验，而是通过动物的体内与体外等途径获取申报资料的药效学、药代学以及毒代方便的资料，以判断药物成药的可能性以及在人体应用的安全范围[2]。
由于动物的种属差异、药物代谢途径、代谢速率等都存在着较大的差别，因此，研究药物体外代谢的种属差异对药物代谢研究以及药物安全性评价都具有重要意义[39]。
咖啡因（caffeine）是甲基黄嘌呤生物碱，广泛分布于茶叶、咖啡等多种食物中，纯品咖啡因为白色、强烈苦味的粉状物，化学式C8H10N4O2，化学名1，3，7三甲基黄嘌呤或3，7二氢1，3，7三甲基1H嘌呤2，6二酮。
适度使用咖啡因有祛除疲劳、兴奋神经的作用，临床上多应用于感冒药的复方制剂中。
大剂量或长期使用咖啡因具一定的成瘾性，由于药物的耐受性而导致用药量不断增加时，咖啡因不仅作用于大脑皮层，还能直接兴奋延髓，引起阵发性惊厥和骨骼震颤，损害肝、肾等重要内脏器官，诱发呼吸道炎症、妇女乳腺瘤等疾病，甚至导致下一代智能低下，肢体畸形，属国家管制的精神药品[5]。
咖啡因体内代谢过程复杂，在尿液中现今已发现咖啡因15种主要的代谢产物，咖啡因的使用与生命健康关系紧密[1011]，并已作为药物代谢酶活性测定的探药，但由于咖啡因代谢产物复杂，检测手段限制，并未完全展现咖啡因的代谢过程。
本文拟借助高分辨LCMS/MS系统，进一步分析咖啡因在微粒体中的体外代谢过程，更深入的了解咖啡因的代谢产物，并对其在大鼠及小鼠肝微粒体中的体外代谢进行种属差异研究，为咖啡因的药物代谢研究以及药物安全性评价提供参考意义。
1材料Triple TOF 4600高分辨质谱系统（美国ABSCIEX公司）；LC30AD超高效液相系统（日本SHIMADZU公司）；R21G型高速冷冻离心机（日本日立公司）；Elix10超纯水净化系统（美国MILLIPOER公司）；组织匀浆机（德国IKA公司）；XS105 1/10万精密电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）。
咖啡因（caffeine，Agilent Technologies，Kit for capillary LC OQ/PV，批号N080776）；小牛血清蛋白（Albumin Bovine V，批号020*********）；NADPH 还原型辅酶Ⅱ（triphosphopyridine nucleotide，SigmaAldrich公司，批号N7505）；无水氯化镁（magnesium chloride，阿拉丁公司，批号1107758）；甲酸（formic acid，SigmaAldrich公司，批号5630210ML）；乙腈、甲醇均为色谱纯（美国Fisher公司），其他试剂均为市售分析纯，水为超纯水。
清洁级雄性SpragueDawley （SD）大鼠、清洁级昆明小鼠各5只，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格许可证号SCXK（渝）20070002 。
2方法21大鼠及小鼠肝微粒体蛋白的制备分别脱臼处死后立即取肝脏，用含015 mol·L-1KCl的100 mmol·L-1磷酸钾缓冲盐（pH 74）冲洗至土黄色，各自冰上匀浆。
采用差速离心法制备微粒体[12]，以小牛血清蛋白为对照品，采用Lowry 法测定微粒体蛋白含量[13]。
22咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体的代谢为了检测咖啡因经大鼠及小鼠肝微粒体代谢的产物，分别取500 mg·L-1咖啡因对照溶液20 μL加入终体积200 μL 微粒体反应体系中，肝微粒体反应酶体系[11]包括05 g·L-1大鼠或小鼠肝微粒体蛋白，4 mmol·L-1MgCl2溶液20 μL，100 mmol·L-1 PBS缓冲液140 μL。
于37 ℃循环水浴中预孵3 min，加入10 mmol·L-1NADPH 20 μL起始反应。
分别于37 ℃循环水浴中反应0，30 min，分别加入冰乙腈200 μL终止反应，4 ℃下以12 000 r·min-1离心15 min，取上清于4 ℃保存至检测。
23Triple TOF 4600高分辨质谱系统的分析条件取离心后上清液5 μL进样分析。
超高效液相检测条件：Kinetex XBC18柱（21 mm×100 mm，26 μm），流动相含01%甲酸的超纯水（A）乙腈（B），梯度洗脱，0～1 min，10%B，1～5 min，10%～80%B，5～7 min，80%B，7～701 min，80%～10%B，701～10 min，10%B，流速300 μL·min-1；柱温30 ℃。
Triple TOF 4600高分辨质谱系统采用ESI离子源，分别采用positive和negative 2种离子化方式，质量扫描范围m/z 50～300，鞘气55 Pa，辅助气55 Pa，气帘气25 Pa，雾化温度600 ℃，采用TOFMSProduct IonIDA扫描模式，TOF/MS 一级预扫描和触发的二级扫描Product IonIDA离子累积时间分别为250，100 ms，采用多重质量亏损（MMDF）和动态背景扣除（DBS）作为二级触发条件，解簇电压80 V，CE碰撞能量为35 eV，CES碰撞能量叠加为（35±15）eV。
3结果与讨论通过查阅文献对咖啡因已知代谢途径进行分析，咖啡因的代谢物主要有15种。
根据已知信息，采用Analyst TF16，Peakview （Version 12，AB SCIEX）以及MetabolitePilot （Version 15，AB SCIEX）软件对咖啡因代谢后质谱数据进行处理分析。
以相对分子质量与理论精确相对分子质量的偏差<10为原则，确定各色谱峰对应化合物的分子式，在已获知的咖啡因代谢物信息中检索匹配的化合物。
31咖啡因对照品质谱信息分析咖啡因对照品采用23项下方法进行分析，结果见图1。