抗肿瘤化合物E7在不同种属肝微粒体酶中的体外代谢研究
体外代谢产物实验报告
一、实验目的本实验旨在通过体外代谢实验，研究某种化合物在特定酶系作用下的代谢过程，鉴定其代谢产物，并分析其代谢动力学特性。
通过此实验，可以为该化合物的体内代谢研究提供实验依据，并为后续的药物研发和毒理学评价提供参考。
二、实验材料1. 实验化合物：待研究化合物A（纯度≥98%）2. 实验试剂：肝微粒体酶、NADPH、辅酶A、磷酸盐缓冲液（pH 7.4）、硫酸铵、氯化钠、氢氧化钠等3. 实验仪器：低温离心机、紫外-可见分光光度计、高效液相色谱仪（HPLC）、质谱仪（MS）等4. 实验动物：比格犬（体重2-3kg）三、实验方法1. 肝微粒体酶的制备：取比格犬肝脏，剪碎后用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）制成匀浆，低温离心（10000g，4℃，10min）分离肝微粒体。
用磷酸盐缓冲液（pH 7.4）调整肝微粒体蛋白浓度为10mg/mL。
2. 代谢反应：取肝微粒体酶溶液、NADPH、辅酶A和待研究化合物A，按一定比例混合，在37℃、pH 7.4的条件下进行代谢反应。
3. 代谢产物分析：代谢反应结束后，用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）分析代谢产物，鉴定其结构。
4. 代谢动力学分析：通过计算酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax），分析酶的代谢动力学特性。
四、实验结果1. 代谢产物分析：实验结果显示，待研究化合物A在肝微粒体酶的作用下，产生了多个代谢产物，其中主要产物为B和C。
2. 代谢动力学分析：酶的米氏常数（Km）为0.5μM，最大反应速率（Vmax）为0.2μM/min。
五、讨论1. 本实验成功鉴定了待研究化合物A的代谢产物，为后续的体内代谢研究提供了实验依据。
2. 代谢动力学分析结果显示，该酶对化合物A的代谢动力学特性符合米氏方程，说明该酶对化合物A的代谢具有可逆性。
3. 通过比较不同酶系的代谢动力学参数，可以为药物研发和毒理学评价提供参考。
六、结论本实验通过体外代谢实验，研究了待研究化合物A的代谢过程，鉴定了其代谢产物，并分析了其代谢动力学特性。
药物体外肝代谢研究方法
药物体外肝代谢研究方法摘要：对近几年的文献资料进行分析、综合、归纳。
介绍肝微粒体体外温孵法、肝细胞体外温孵法、离体肝灌流及器官组织切片法。
其中，肝细胞体外温孵法是当今药物体外肝代谢研究的热点，对新药研究与开发及正确指导临床合并用药有着巨大的推动作用，将对其进行重点论述。
关键词：体外肝代谢；肝微粒体；肝细胞；离体肝灌流；组织切片广义的药物代谢指药物在体内吸收、分布、代谢、排泄等一系列过程［1］。
狭义的药物代谢是指药物的生物转化。
生物转化后，药物的理化性质发生变化，从而引起其药理和毒理活性的改变。
因此，研究药物的生物转化，明确其代谢途径［2］，对制定合理的临床用药方案，剂型设计及新药开发工作都具有重要的指导意义。
当前，国内外对药物代谢的研究主要集中在代谢产物生成和确定代谢途径。
在分子生物学技术推动下，药物代谢酶［3］领域的研究因其对临床药物间相互作用的研究有着积极的推动意义，已得到广泛的重视。
肝脏是药物代谢的重要器官，是机体进行生物转化的主要场所，富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统［4］，大多数药物的Ⅰ相反应及Ⅱ相反应都依赖于肝脏酶系统而发生。
以肝脏为基础的体外代谢模型以其特有的优势在药物代谢研究中得到广泛应用，现概述如下。
1 肝微粒体体外温孵法肝微粒体法［5］是由制备的肝微粒体辅以氧化还原型辅酶［6］，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，制备肝微粒体一般用差速离心法。
肝微粒体体外温孵法和其它的体外肝代谢方法相比较，其酶制备技术简单，代谢过程快，结果重现性好，易大量操作，便于积累代谢样品供结构研究；同时，该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究，因而在实际工作中应用较为普遍。
但肝微粒体体外温孵法同其它体外肝代谢方法相比，在体内情况的一致性方面存在不足，因而其实验结果用于预测体内情况仍需进一步的确证。
2 肝细胞体外温孵法肝细胞体外温孵法同肝微粒体法相似，即以制备的肝细胞辅以氧化还原型辅酶，在模拟生理温度及生理环境条件下进行生化反应的体系，适于研究蛋白及mRNA水平药物代谢酶诱导及酶活性，在评估药物代谢过程中药物间的相互作用时，该方法得到广泛的应用。
野百合碱在5种肝微粒体中的体外代谢研究_刘倩
图 1 DHP，DHＲ，DHH，野百合碱的结构
收稿日期： 2013-06-15 基金项目： 上海市国际科技合作基金项目 （ 12430700200） 作者简介： 刘 倩 （ 1978—） ，女，博士，研究方向： 中药化学和代谢。Tel： 13917735267，E-mail： liuqian01101@ 163． com * 通信作者： 谢天培 （ 1962—） ，男，博士，研究方向： 中药物质基础。Tel： （ 021） 51320033，E-mail： tam@ nature-standard． com
rolizine］。结论 野百合碱在地塞米松诱导的 F344 大鼠、F344 大鼠、SD 大鼠、人及 ICＲ 小鼠肝微粒体均可发生代谢，
但代谢率有一定差异。
关键词： 野百合碱； 体外代谢； 液相色谱 / 串联质谱； 野百合碱-N-氧化物； DHP
中图分类号： Ｒ969. 1
文献标志码： B
文章编号： 1001-1528（ 2014） 08-1764-04
2014 年 e Traditional Patent Medicine
August 2014 Vol． 36 No． 8
野百合碱在 5 种肝微粒体中的体外代谢研究
刘 倩1 ， 陈龙龙2 ， 马双成3 ， 张祖艳1 ， 李云华1 ， 钱 勇2 ， 谢天培2* （ 1. 上海沪丰生物科技有限公司，上海 200433； 2. 上海诗丹德生物技术有限公司，上海 201203； 3. 中国 食品药品检定研究院，北京 100050）
内的代谢产物［4］。代谢产物具有很强的亲电性，能与组织 中亲核性 的 酶、蛋 白 质、DNA，ＲNA 结 合，引 起 各 种 损 伤［5］。其 中 （ + / -） -6，7-二 氢-7- 羟 基-1-羟 甲 基-5H-吡 咯 里嗪 （ DHP，包括 DHＲ、DHH，结构见图 1） 形成的 DNA 加合物，是导致肿瘤发生的原因［6］。
药物代谢研究的技术与方法
药物代谢研究的技术与方法药物代谢是指药物在人体中的分解、转化和排泄过程。
药物代谢过程涉及到许多酶系统和代谢通路，不同的药物会通过不同的代谢途径进行代谢。
药物代谢研究对于药物开发和临床应用具有重要意义。
下面介绍几种常用的药物代谢研究技术与方法。
1. 体内代谢试验体内代谢试验是研究药物在整个机体内的代谢过程，常用的方法有体外实验动物试验和人体试验。
体外试验通常使用小鼠、大鼠、兔子和犬等实验动物，人体试验则需要遵循严格的伦理审查和安全措施。
通过体内代谢试验，可以了解药物的药代动力学、药效学和通过药物代谢酶系统的代谢途径。
2. 体外代谢试验体外代谢试验是研究药物在体外模拟环境中的代谢过程，包括微粒体酶体和肝酶体代谢试验。
微粒体酶体代谢是指药物在细胞质中的代谢，而肝酶体代谢则是指药物在肝细胞的内质网中的代谢。
通过体外代谢试验，可以获得关于药物代谢酶的详细信息和药物代谢通路的理解。
3. 体外代谢酶体系体外代谢酶体系是建立在包含药物代谢酶的部分纯化物中的体外代谢试验。
这种方法可以对药物代谢酶进行更加详细的分析，包括其结构、功能和识别机制等。
体外代谢酶体系可以被广泛应用于药物代谢研究、药物安全性评估和药物治疗反应预测等领域。
4. 代谢产品分离代谢产品分离是一种直接从样品中获得药物代谢产品的方法，包括代谢产物分离和纯化，以及将代谢产物通过质谱技术或结合质谱和其他分析技术进行鉴定和定量。
这种方法可以便捷地获得药物代谢产物，为药物代谢途径和代谢酶系统的研究提供重要信息。
5. 分子生物学方法分子生物学方法包括克隆、表达和纯化药物代谢酶等。
这种技术可以通过基因工程技术对特定酶进行修改和优化，以便更好地研究药物代谢通路和药物代谢产物。
此外，这种方法还可以筛选新的药物代谢酶和新的代谢产物，推动药物发现和开发。
总结来说，以上几种药物代谢研究技术与方法各有所长，相互补充，可以为药物代谢的探索和理解提供重要的工具和手段。
药物代谢研究的未来将继续探索新的技术和方法，以推进药物的研发和治疗。
体外代谢清除率模型用于药物肝代谢过程的研究
体外代谢清除率模型用于预测药物肝代谢过程的研究黄峰中药学2110948107摘要：本文主要就计算体外代谢清除率的理论与预测模型做一综述，以期使体内药物代谢过程的检测更加准确，并在此基础上可以预测创新药物在体内可能进行的代谢过程，确定其是否适合进行进一步研究开发，为筛选新药提供新的思路。
关键词：代谢清除率；药物代谢动力学；体外模型前言药物发现与开发的目标是找出并确定具有药理活性的新化学实体。
在过去的几十年里, 药物发现与开发一般方法是在进行药理活性检测后,再对新化学实体进行临床前的动物实验和临床人体试验[1]。
近些年随着组合化学和高通量活性筛选技术的发展,已经使人们能够在一周之内筛选的化合物超过10万个[2],从而发现大量具有药理活性的化合物。
然而一个化合物最终成为能够上市的药物,必须具备良好的类药属性,即：药效活性、安全性、药代属性和适宜制剂的理化性质。
其中,药代属性主要是指化合物能够通过不同生物膜到达作用部位的能力,包括口服生物利用度的高低；以及化合物能否在体内保持一定的浓度水平；与靶受体维持足够时间的结合以产生具有临床意义的药理作用等。
药代研究是一项非常复杂的费时费力的工作，是目前加速药物发现阶段研究速度的瓶颈。
此外,要在前期阶段了解化合物的药代动力学特征,还有一个重要的原因是考虑开发新药的经济成本,一个新药上市需要投入大量的资金,大约在10~30亿美元之间[3],其间被淘汰化合物的数量也是惊人的,因而可以说大量的资金是投入到那些失败了的化合物。
因此,任何能够尽早地揭示化合物的药代动力学特征的研究方式对于降低在高成本的药物开发阶段的失败率是非常有价值的[4]。
肝脏是药物的主要代谢器官,富含参与药物I相代谢和II相代谢的混合功能氧化酶系统,其中90%药物主要是由细胞色素P450酶(cytochromeP-450,CYPs)参与进行生物转化。
当前,人肝细胞[3, 4]、肝切片[5]、cDNA表达的基因重组肝药酶系[6]及人肝微粒体[7]等体外模型已被成功用于对体内肝代谢研究的预测。
体外_鸡尾酒法_研究靶向小分子抗_省略_CYP450酶主要亚型的抑制作用_张乐多
Inhibitory effect of SPH0396，a small molecular targeted antitumor agent， on cytochrome P450 isozymes using an in vitro “cocktail”method
［作者简介］ 张乐多，女，工程师，硕士，主要从事新药研发中药物代谢动力学筛选研究。联系电话： （ 021） 61871700 － 8187，E-mail： zhangld@ sphchina． com。 ［通讯作者］ 夏广新，男，博士，教授级高级工程师，主要从事新药研发工作。联系电话： （ 021） 61871700 － 6080，E-mail： xiagx@ sphchina． com。
ZHANG Le-duo1 ，XIANG Zhi-xiong1 ，WAN Hui-xin2 ，XIA Guang-xin1 （ 1 DMPK Department of Central Ｒesearch Institute； 2 Department of Pharmaceutical Chemistry， Central Ｒesearch Institute，Shanghai Pharmaceuticals Holding Co． ，Ltd． ，Shanghai 201203，China）
［摘要］ 目的： 评价靶向小分子抗肿瘤化合物 SPH0396 在体外对人肝微粒体 CYP450 酶 7 种主要亚型 的直接抑制作用和时间依赖性抑制作用，从而为预测其体内抑制情况和临床药物-药物相互作用提供依据。 方法： 采用人肝微粒体外“鸡尾酒法”的孵育体系，选取人肝微粒体 CYP450 酶 7 种主要亚型的混合探针底 物，以液质联用（ LC / MS / MS） 法同时测定各探针底物相应代谢产物的生成量，并求算 SPH0396 对 7 种主要 亚型直接抑制的半数抑制浓度（ IC50 ） 值和时间依赖性抑制的 IC50 偏移值，进而评价 SPH0396 对 7 种主要亚 型的抑制作用。结果： SPH0396 对 CYP1A2 的 IC50 ＞ 100 μmol·L － 1 ，没有直接抑制； 对 CYP3A4 /5，CYP2D6， CYP2C9，CYP2C19 的 IC50 在 10 ～ 17． 6 μmol·L － 1 之间，为较弱的直接抑制作用； 对 CYP2B6 和 CYP2C8 的 IC50 值均为 2． 2 μmol·L － 1 ，为 中 等 强 度 直 接 抑 制 作 用； 对 CYP2D6，CYP2C9，CYP2C19，CYP1A2，CYP2B6 和 CYP2C8 的 IC50 没有偏移，但是对 CYP3A4 /5 的 IC50 偏 移 分 别 为 2． 6 （ 咪 达 唑 仑） 和 4． 2 （ 睾 酮） ，因 此 对 CYP3A4 /5 存在时间依赖性抑制作用。结论： SPH0396 对主要的 CYP450 酶亚型存在直接抑制和机制性抑制 作用，如果 SPH0396 被开发为临床药物，必须密切关注其与上述酶底物之间发生药物相互作用而导致合用 药物药动学改变的可能，避免临床药效无法发挥，甚至不良反应的加剧。
肝微粒体体外代谢在中药生物转化中的应用研究进展
肝微粒体体外代谢在中药生物转化中的应用研究进展
宋川霞;韩雪花;郭大乐
【期刊名称】《成都中医药大学学报》
【年(卷),期】2017(40)2
【摘要】中药生物转化是我国传统中药与现代生物技术的有效融合的产物,而肝微粒体对中药有效成分的体外代谢研究是中药生物转化一个重要领域。
肝微粒体对中药有效成分的体外代谢研究对于中药药性改变、疗效提高、降低毒副作用、中药有效成分代谢途径的确定等方面具有一定的指导作用。
肝微粒体体外代谢研究为指导临床合理、安全用药、中药的二次开发利用以及新药的研究与开发提供可靠的依据。
本文主要针对肝微粒体体外代谢在中药生物转化中的应用研究进展进行综述。
【总页数】4页(P115-118)
【关键词】肝微粒体;体外代谢;中药;生物转化;应用
【作者】宋川霞;韩雪花;郭大乐
【作者单位】成都中医药大学
【正文语种】中文
【中图分类】R284;R2-03
【相关文献】
1.UPLC-MS/MS方法研究次乌头碱在大鼠肝微粒体CYP450中的体外代谢产物及代谢酶亚型 [J], 毕云枫;李雪;皮子凤;宋凤瑞;刘志强
2.肝微粒体体外温孵法与基因重组P450酶系在药物体外肝代谢研究中的应用进展
[J], 刘颖;马小军
3.利多卡因在人肝微粒体中的体外生物转化 [J], 张顺国;唐跃年;李方
4.去氢土莫酸在大鼠体外肝微粒体体系中的生物转化研究 [J], 阿拉腾其木格;杨秀伟
5.基于液相色谱-质谱联用的肝微粒体中药物代谢酶定量方法研究进展 [J], 王欢欢;吕雅瑶;彭博;钱小红;张养军
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代谢稳定性研究中肝微粒体与肝细胞的差异
代谢稳定性作为化合物重要的ADME性质，其影响着化合物在机体内的清除率、半衰期和口服生物利用度。
由此，代谢稳定性研究常作为早期化合物筛选的重要环节，其对于优势化合物的筛选、指导结构修饰、预测体内清除率、构建IVIVC和预估剂量等具有重要意义。
目前常用于代谢稳定性研究的高通量方法主要包括肝微粒体、肝细胞和肝S9，其中肝微粒体代谢稳定性（LMS）和肝细胞代谢稳定性（HMS）最为常见。
而化合物在LMS和HMS中结果存在差异的现象时有发生，那么针对这种情况，我们难免会产生一些疑问，导致差异存在的内在因素是什么？找到差异的原因是否可以对化合物结构改造有利？选择哪个数据作为评价化合物的标准值？该采用哪个数据去预测人体清除率？下文将带着这些疑问进行阐述。
1 肝微粒体与肝细胞的差别要想弄清楚化合物LMS和HMS的差异，首先我们必须要了解肝微粒体和肝细胞本身。
肝脏组织匀浆后高速离心上清液即为S9，再经超高速离心后底部沉淀重悬即为微粒体，肝微粒体酶主要源于肝细胞内质网，包含CYP、水解酶和UGT。
由肝微粒体的制备过程可知肝微粒体失去了细胞完整结构，药物可直接暴露于代谢酶中。
另外肝细胞胞质中还存在部分肝微粒体缺失的代谢酶，如醛氧化酶（AO）、黄嘌呤氧化酶（XO）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）等，下表附有各类药物代谢酶在肝细胞中的定位。
此外，由于肝细胞完整的细胞结构，其细胞膜表面表达有各类药物相关转运体蛋白，如OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、BCRP、BSEP等摄入或外排转运体，下图附有肝细胞中转运体表达情况。
(摘至《Donglu Zhang,Sekhar Surapaneni - ADME-Enabling Technologies inDrug Design and Development》一书)（参考Membrane transporters in drug development一文）2 LMS和HMS结果存在差异的原因此处将LMS和HMS的差异的原因分为机制性的原因和经验性的原因。
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抗肿瘤化合物E7在不同种属肝微粒体酶中的体外代谢研究采用商品化的人、Beagle犬、食蟹猴、SD大鼠的肝微粒体酶，考察E7在4个种属肝微粒体中的代谢稳定性，比较代谢的种属差异。
采用选择性化学抑制剂，测定不同抑制剂对E7代谢速率的影响，分析预测大鼠肝微粒中参与E7代谢的主要亚酶。
实验结果显示E7在人、犬、食蟹猴和大鼠4个种属的肝微粒体中体外代谢半衰期T1/2分别为5775，6930，1690，3013 min；体外固有清除率分别为0004 8，0004 0，0016 4，0009 2 mL·min-1·mg-1。
推测E7在人和犬肝微粒体中代谢速率相近，均比较慢；在猴和大鼠肝微粒体中代谢速率相近，均比较快；代谢速率存在明显的种属差异。
CYP2E1，CYP2A6，CYP1A2和CYP2D6均可能参与代谢E7，而多态性的CYP3A4对其的代谢贡献较小。
标签：E7；肝微粒体；代谢稳定性；酶表型[Abstract]To investigate the metabolic stability of E7 in liver microsomes of human，Beagle dog，Cynomolgus monkey and SD rats，and compare the metabolic differences between different species Selective chemical inhibitors were used to determine the effects of different inhibitors on E7 metabolic rate，and predict the main enzymes involved in E7 metabolism in rat liver microsomes The experimental results showed that the in vitro halflives （T1/2）of E7 in liver microsomes of human，dog，monkey and rats were 5775，6930，1690，3013 min respectively Their intrinsic clearance rate was 0004 8，0004 0，0016 4 and 0009 2 mL·min-1·mg-1 respectively Hence，it could be speculated that the metabolic rate of E7 was similarly slow in human and dog liver microsomes；while it was similarly fast in monkey and rat liver microsomes There was significant difference in metabolic rate of E7 between different species The results showed that CYP2E1，CYP2A6，CYP1A2 and CYP2D6 might participate in metabolism of E7，while the contribution of polymorphic CYP3A4 was small[Key words]E7；liver microsomes；metabolic stability；metabolic phenotypedoi：10.4268/cjcmm20160927E7是本實验室基于抗肿瘤化合物MPC6827开发的香豆素类化合物，结构见图1，企图在一定程度上保留其抗肿瘤活性的同时，又降低其细胞毒性作用[12]。
香豆素类化合物是一类具有苯并α吡喃酮母核的天然产物的总称，是自然界中重要的一类芳香族化合物，广泛分布于动植物中[34]，具有抗HIV、抗癌、降压、抗心律失常、抗骨质疏松、镇痛、平喘及抗菌等多种生物活性，且呈浓度效应关系[1，5]，其中抗肿瘤作用是一个研究热点[1]；植物中提取的天然产物大多毒副作用较低，香豆素类化合物具有相对分子质量小、合成相对简单、溶解度好、生物利用度高等[2]优点。
在此基础上，以构效关系为指导，合成目标化合物E7。
实验室前期药理学体外细胞筛选结果表明，该化合物对不同肿瘤细胞B16，A549等均呈现良好的抗肿瘤效果，有进一步开发的可能性。
体外代谢方法具有试验简便、周期短等特点，被广泛应用于早期阶段的药物研发。
类似于体内实验存在的种属差异，体外代谢实验中不同CYP同工酶能介导不同的代谢反应，因而CYP酶介导的代谢反应和生成的代谢产物种类或量也存在着种属差异[67]。
为了全面了解E7在不同种属肝微粒体中的代谢特性，给后续药物开发的体内实验动物选用提供支持，选择了容易获得的啮齿类动物和跟人更接近的大动物[8]的肝微粒体来进行E7体外代谢研究，内容包括①探究E7在不同种属肝微粒中的代谢稳定性；②采用选择性化学抑制剂方法预测E7的代谢表型。
1材料超高效液相色谱（UPLC）系统：包括溶剂系统（Waters Quaternary Solvent Manager）、进样系统（Waters Sample Manager FTN）、色谱柱（Waters Acquity UPLCTM BEH C18色谱柱，21 mm×100 mm，17 μm）；数据处理软件（Waters MassLynx V41 Software），购自美国Waters公司；三重四极杆质谱（MS）：Waters xevo TQD，美国Waters公司；Thermo Heraeus Fresco 17低温冷冻离心机（Thermo Scientific 公司）；230VUK涡旋混合器（Labnet International公司）；BT125D电子天平（北京赛多利斯仪器有限公司）；Milli Q超纯水系统（美国Merck Millipore 公司）。
E7是四川大学生物治疗国家重点实验室以香豆素为基础合成的抗肿瘤药物小分子，经UV，1H和13CNMR，HRMS分析鉴定其结构，通过RPHPLC测定，其纯度大于98%；内标1201A由四川大学生物治疗国家重点实验室合成，经UV，1H，13CNMR，HRMS分析鉴定其结构，纯度大于98%；α萘黄酮（ANF，东京化成工业株式会社）；盐酸噻氯匹定（TCP，中国食品药品检定研究院）；奎尼丁（QND，TCI上海化成工业发展有限公司）；二乙基二硫代氨基甲酸钠（DDTC）、磺胺苯吡唑（SUL）购于美国Sigma；酮康唑（KCZ，Dr Ehrenstorfer 公司）；甲醇为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；其余试剂为分析纯。
人肝微粒体（HLM）、SD大鼠肝微粒体（RLM）、Beagle犬肝微粒体（DLM）、猴肝微粒体（MoLM）：20 g·L-1，购自武汉普莱特生物医药技术有限公司，于-80 ℃冷冻保存；NADPH发生系统（A液、B液）购自武汉普莱特生物医药技术有限公司，于-80 ℃冷冻保存。
2方法21储备液和工作液的配制E7储备液的配制：精密称定E7 1000 mg，使用甲醇作为溶剂定容至10 mL 棕色量瓶中，混匀，即得质量浓度为1 g·L-1的E7贮备液，密封，4 ℃冰箱保存备用。
工作时，使用甲醇稀释贮备液制成不同梯度浓度的工作液。
内标溶液的配制：精密称定1201A 1000 mg，使用甲醇作为溶剂定容至10 mL 棕色量瓶中，混匀，即得质量浓度为1 g·L-1的1201A贮备液，密封，4 ℃冰箱保存。
工作时，精密量取贮备液，用甲醇稀释为30 μg·L-1的溶液，密封，4 ℃冰箱保存待用。
22UPLCMS/MS条件液相条件：Waters Acquity UPLCTM BEH C18色谱柱（21 mm×100 mm，17 μm）；柱温30 ℃；流动相为01%甲酸水（A）甲醇（B），梯度洗脱，0～25 min，60%～90%B；进样体积5 μL。
质谱条件：电喷雾离子化（ESI）方式，检测离子为正离子；毛细管电压3 kV，离子源温度150 ℃，脱溶剂气温度450 ℃，脱溶剂气流量700 L·h-1，锥孔气流量45 L·h-1。
以上条件下，采用多级反应监测（MRM）测定E7和内标，其对应的监测离子对和碰撞能量分别是E7（29810→26812，30 eV），内标（28716→13814，25 eV）。
23E7在肝微粒體体外代谢孵育模型中的代谢稳定性231代谢稳定性孵育模型参照文献[9]每个孵育体系总体积为2095 μL，体系包括01 mol的PBS缓冲液（pH 74）188 μL，NADPH发生系统12 μL。
其中NADPH 发生系统由10 μL的Solution A和2 μL的Solution B临用时冰浴上混合制得。
冰浴上将2 μL 100 μmol的E7加入孵育体系中，在37 ℃水浴中预热5 min；然后冰浴上分别加入75 μL不同种属的肝微粒体酶，轻轻混匀，置于37 ℃水浴中孵育，孵育时间为0，5，10，20，30 min。
待反应完毕后加入400 μL内标质量浓度为30 μg·L-1的甲醇溶液（4 ℃）终止反应，平行实验3次，考察E7化合物在不同酶源中的代谢稳定性。
232体外半衰期将孵育0 min E7的浓度作为100%，其他孵育时间点的浓度转换为百分剩余量，将各时间点的百分剩余量的自然对数对孵育时间作线性回归，求算得斜率k，根据公式，T1/2 =-0693/k可以计算得到体外半衰期。
肝微粒体中的清除率（CL，mL·min-1·mg-1）=0693×孵育液（mL）/[T1/2（min）×肝微粒体（mg）][6]。
24E7在CYP450酶中的代谢表型研究代谢表型指特定代谢酶对目标化合物代谢相对贡献的测算，以确定参与药物代谢的主要酶，为预测个体差异和药物间相互作用提供依据。
241代谢表型研究体系根据文献[10]，本实验选用的选择性化学抑制剂如下：1 μmol α萘黄酮（αnaphthoflavone，CYP1A2）；50 μmol盐酸噻氯匹定（ticlopidine，CYP2C19）；10 μmol奎尼丁（quinidine，CYP2D6）；100 μmol二乙基二硫代氨基甲酸钠（clomethiazole，CYP2E1）；1 μmol酮康唑（ketoconazole，CYP3A4）；20 μmol磺胺苯吡唑（sulphaphenazole，CYP2C9）。