脉冲场凝胶电泳技术资料
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
pfge原理
pfge原理PFGE原理是一种分子生物学技术，全称为脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），它是一种分离和分析DNA片段的方法，可以将大片段的DNA分子从凝胶中分离出来，从而进行电泳分析。
1. 原理PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场，使DNA的运动方向变化，从而使大分子量DNA可以被更好的分离。
首先，DNA被切成片段，并在凝胶中进行电泳分离。
PFGE所采用的凝胶是一种“交错”的凝胶，即在不同方向上阻碍电泳运动的纤维素。
在电场中，DNA分子因为其大小、形状和电荷密度不同而负载不同的电荷，向着凝胶的两个端点移动。
在PFGE过程中，电场方向会不断改变，这种改变可以使大分子量DNA分子在不同方向上进行运动。
一次分离过程通常持续16小时以上。
2. 应用PFGE技术是目前常用的DNA分子分离技术之一，其应用范围广泛，主要用于以下领域：（1）遗传学研究：PFGE技术可以帮助了解基因组结构和动态变化，尤其是在菌群的基因组研究中，PFGE技术具有重要作用。
（2）食品安全检测：PFGE技术可以用于食品安全检测，例如细菌的分离和鉴定，食品中微生物的种类、数量及分布等的研究。
（3）医学研究：PFGE技术在医学领域中有广泛应用，比如可以用来检测癌症等重大疾病，检测病原体和细菌的快速鉴定等。
3. 优势相较于常规的DNA电泳，PFGE技术有以下几点优势：（1）可以分离大分子量的DNA分子，比如细菌的染色体DNA。
（2）可以提高DNA分离的分辨率，从而更准确地分析DNA的结构和变异情况。
（3）PFGE的原理可以单独分离DNA分子，使处理比较麻烦的DNA成为可能，比如重复序列等。
总之，PFGE技术在现代生命科学中已经成为了不可或缺的基础技术之一。
通过PFGE技术，我们可以更好地理解细胞DNA的组成和结构，同时对食品和医学工作中的研究也有着巨大的帮助作用。
202X年脉冲场凝胶电泳(1)
2) 噬菌体载体DNA的分离
纯净病毒颗粒 病毒载体DNA
M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法
第十二页，共三十八页。
二、RNA的分离与纯化
1. 制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用
1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒 (0~65℃均具活性）；抗变性剂
单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍） 藻类 132（裸藻）~191kb（衣藻）
第八页，共三十八页。
1) DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) 65℃温育
20’
冰浴冷却 离心去细胞碎片 苯酚抽提法①
CsCl密度梯度离心②
1) 苯酚抽提法 上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽 至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉 淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNAase处理 除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
2) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶; 竖式/聚丙烯酰胺凝胶
3) 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易
2. 用途
琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规(chángguī)分析；聚丙烯酰胺凝胶常 用于小分子核酸分析。
3. 凝胶电泳的一般程序
制胶 点样 电泳 染色 观察
二、DNA电泳
1. DNA分子种类
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。
（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。
其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。
具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。
本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。
1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。
PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。
之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。
根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。
基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。
2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。
如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。
如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。
而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。
考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。
3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。
缓冲液的温度会产生一定的影响。
这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。
在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。
脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。
而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。
图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。
当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。
可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
凝胶电泳技术课件
提高灵敏度：通过改进检测 方法、优化实验条件等方法 提高灵敏度，以便更好地检 测低丰度的DNA片段。
降低成本：通过优化实验 方案、改进实验设备等方 法降低成本，以便更好地 推广凝胶电泳技术。
应用领域拓展
生物制药：蛋白质、核酸等 生物大分子的分离和纯化
基因工程：DNA片段的克 隆和测序
食品安全：食品添加剂、微 生物检测
凝胶电泳技术课件
目录
01. 凝胶电泳技术概述 02. 凝胶电泳实验步骤 03. 凝胶电泳结果分析 04. 凝胶电泳技术发展
凝胶电泳原理
凝胶电泳技术是一种利用凝胶介质对不同分子量 的DNA、RNA或蛋白质进行分离和检测的技术。
凝胶电泳的原理是利用电场对不同分子量的DNA、 RNA或蛋白质进行分离和检测。
04
06
确定分子量：根 据迁移率和分子 量之间的关系确 定分子量
确定电泳条件： 根据结果分析 确定合适的电 泳条件
技术改进方向
提高分辨率：通过优化凝胶 配方、改进电泳技术等方法 提高分辨率，以便更好地区 分不同大小的DNA片段。
提高速度：通过优化电泳 技术、改进实验流程等方 法提高速度，以便更快地 完成实验。
凝胶电泳技术主要包括凝胶制备、样品处理、电 泳、染色和检测等步骤。
凝胶电泳技术在分子生物学、生物化学、遗传学、 医学等领域具有广泛的应用。
凝胶电泳类型
聚丙烯酰胺凝胶电 泳（PAGE）：根 据分子量进行分离
毛细管凝胶电泳 （CGE）：根据分 子大小和电荷进行
分离
琼脂糖凝胶电泳 （AGE）：根据分
子大小进行分离
03
电泳方向：观 察电泳方向的 正负，判断样 品的电荷和分 子量
04
电泳时间：观 察电泳时间的 长短，判断样 品的电荷和分 子量
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注意事项：
（1） 用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
（2） 细胞悬浊液、蛋白酶K要置于冰上。
（3） 在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：
1%SDS时要避免气泡的产生。
（4） 混合物加入模具时不能产生气泡。 （5） 在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中 1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱 中。
蛋白酶K（储存液浓度为20mg/ml）混匀，使其终浓
度为0.5mg/ml。
7、 制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃
水浴箱中。
8、 在eppendorf管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。 9、 将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下 凝固10-15分钟。
3、 在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl缓冲液H 的稀释液。 4、小心从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。 5、 用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf 管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原
来的TE中。
6、 用同样的方法处理标准株H9812的胶块。
四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几 乎所有生物基因组结构的研究。
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场, 其方向、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改 变时,大分子DNA便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重 新定向后,才能继续向前泳动,DNA分子越大,这种重新定向 需要的时间就越长,当DNA分子改变方向的时间小于脉冲 时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开,经EB染色后 在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果
OD值小于3.6，增加菌量提高其浓度。 5、 取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置 于37℃水浴中孵育5分钟。将剩余的细菌悬浊液置于冰上直 到胶块制备好放在水浴摇床中。
6、 从水浴箱中取出eppendorf管，每管加入20µl
脉冲场凝胶电泳技术
生科院遗传学 胡银松
脉冲场凝脉电泳
(Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE), 是近年发展起来的一种重要的分离大分子量 线性DNA分子的电泳技术。
kb
大于该极限的DNA分子,常规的琼脂糖凝胶便
二、 细胞的裂解
1、 在50ml的screw-cap tube上做好标记。
2、 配制细胞裂解液（CLB）：每5ml细胞裂解液
加入25µl蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为
0.1mg/ml，然后颠倒混匀。
3、 每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。
4、 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面
失去了其分子筛的作用,导致电泳带型无法 分辨，PFGE的发明正好解决了这一问题。
1984年, Schwartz和Cantor首次用此技术成功分离 得到酿酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)细胞 的16条完整染色体DNA。
此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高 达10Mb级DNA的能力。
低熔点琼脂糖在这个过程中阻止了机械力对DNA大
片段的剪切作用,因而细胞裂解所释放的DNA大片段
包埋在胶栓中。制作好的样品插块可以在电泳时直
接插入加样孔中
PFGE的操作步骤
PFGE的简要操作步骤包括样品的包埋、原
位裂解、稀少酶切位点的限制性内切酶对染
色体DNA的消化、脉冲场电泳、凝胶的EB染
色观察5个步骤。
PFGE的方法
常规的DNA制备方法得不到完整的大分子量DNA,因 为DNA大片段很脆弱,容易因提取过程中的机械作用 如吸打、离心等而导致DNA的断裂。
为了得到完整的大量DNA大片段,目前主要是采用低 熔点琼脂糖(Lowmelting point agarose)包埋样品,再
进行原位裂解和去蛋白处理从而释放DNA
胶块的制备
1、 在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，
分别加入约2ml细胞悬浊液（CSB）；
2、 在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；
3、 在模具上标记好对应样品的名称；
4、 用CSB湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬 浊于CSB中，用bioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
7、 将管子放在37℃水浴中孵育10-15分钟。
8、 在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶
切缓冲液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块
纯水 175µl 1750µl
Buffer D 20µl 200µl 酶（10U/µl） 5µl 50µl 总体积 200µl 2000µl 9、 每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，