脉冲场凝胶电泳技术_PFGE_在分子分型中的应用现状_王丽丽

参 考 Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｒｓ （ＥＳＧＥＭ） 指 出 的 评 价 流 行 病 学 分 型 系 统 时要考虑的几个标准， 对于分子流行病学分型方 法的选择， 我们认为应该以下列标准来衡量： １ 分 型 力 （ ｔｙｐｅａｂｌｉｔｙ） 指 对 被 分 析 的 每 一 菌 株 能够获得明确的、不似是而非的、阳性结果的能 力。不可分型菌株是指那些没有结果或者结果不 可解释的菌株。 ２ 可 重 复 性 （ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ） 指 用 一 种 技 术 对 同一菌株反复测试能够获得相同结果。技术因素 和生物因素都可以影响可重复性。技术因素是指 对同一菌株进行多次重复性实验而出现不同试验 间的差异。生物因素是指细菌的某种测试特性存 在生物学变异， 代表同一菌株的不同菌落的检测 结果会有不同。 ３ 分 辨 力 （ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｏｒｙ ｐｏｗｅｒ） 指 区 分 不 相 关 菌株的能力。
三 ＰＦＧＥ 结果的解释
目 前 ＰＦＧＥ 已 用 于 常 见 的 细 菌 病 原 体 分 析 。 同时， 计算机凝胶扫描和软件分析有助于创建病 原 菌 ＰＦＧＥ 图 谱 数 据 库 ， 通 过 与 数 据 库 中 的 病 原 菌 ＰＦＧＥ 图 谱 比 较 ， 来 判 断 被 测 菌 株 与 相 同 菌 属 间 的 染 色 体 ＤＮＡ 相 似 程 度 。
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疾病监测 ２００６ 年 ５ 月 ３１ 日第 ２１ 卷第 ５ 期 Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ， Ｍａｙ．３１，２００６， Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．５
·综 述·
脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）在分子分型中的应用现状
王丽丽， 徐建国
关键词： 脉冲场凝胶电泳； 分子分型； 应用
【中 图 分 类 号 】Ｒ－ ３３１
疾病监测 ２００６ 年 ５ 月 ３１ 日第 ２１ 卷第 ５ 期 Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ， Ｍａｙ．３１，２００６， Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．５
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故小分子泳动的快， 从而在凝胶上按染色体大小 而呈现出电泳带型。脉冲场凝胶电泳的具体操作 包 括 将 细 菌 染 色 体 ＤＮＡ 包 埋 在 胶 块 中 ， 经 蛋 白 酶 水解， 稀有酶切位点的内切酶对细菌染色体组 ＤＮＡ 进 行 消 化 ， 脉 冲 场 电 泳 ， 从 而 细 菌 ＤＮＡ 大 片 段 得 以 有 效 分 离 。ＤＮＡ 带 的 密 度 在 一 定 程 度 上 反 映 了 细 菌 内 ＤＮＡ 的 含 量 以 及 ＤＮＡ 分 子 的 大 小 ， 最终达到分型的目的。
［作者单位］传 染 病 预 防 控 制 国 家 重 点 实 验 室 中 国 疾 病 预 防 控 制 中
心 传 染 病 预 防 控 制 所 １０２２０６ ［作 者 简 介 ］王 丽 丽 ， （ １９７９－ ） ， 女 ， 辽 宁 省 康 平 县 人 ， 硕 士 ， 主 要 从
事微生物学研究工作 ［通 讯 作 者］王 丽 丽 ， Ｅｍａｉｌ：ｗａｎｇｌｌ４５８５＠１６３．ｃｏｍ
一 ＰＦＧＥ 方法原理
ＰＦＧＥ 以 其 重 复 性 好 ， 分 辨 力 强 而 被 誉 为 细 菌 分子生物学分型技术的＂金标准＂。它可以用于大 分 子 ＤＮＡ 的 分 离 ， 其 分 辨 范 围 达 到 １０ Ｍｂ。 而 普 通 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 仅 能 分 离 小 于 ５０ ０ ｋｂ 的 ＤＮＡ 分 子 。ＰＦＧＥ 的 基 本 原 理 是 通 过 电 场 的 不 断 改 变 ， 使 包 埋 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 的 ＤＮＡ 分 子 的 泳 动 方 向 做 相 应 改 变 ， 小 的 ＤＮＡ 分 子 比 大 的 变 化 快 ，
理想的情况是， 每一个不相关菌株的结果都 是 独 特 的 。 可 通 过 Ｈｕｎｔｅｒ － Ｇａｓｔｏｎ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ（Ｄ）［５， ６］计 算 两 个 不 相 关 菌 株 被 正 确 分 为 不 同 型 别 的 概 率 来 测 量 分 辨 率 。在 实 际 应 用 中 ， 当 最 常 见的型别代表群体的比例小于 ５％时， 此种方法在
统计学上就可以应用了。对于那些评估多种特性 的技术来说， 如噬菌体分型和电泳分型技术， 当可 重 复 性 降 低 时 ， 分 辨 力 通 常 下 降 。这 是 因 为 要 可 靠 地进行区分， 不相关的菌株必须在许多特性方面 不同。 ４ 流 行 病 学 相 关 性 （ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｌｇｉｃ ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ） 指分子分型的结果与流行病学资料相符， 易于解 释 ， 得 到 的 结 果 逻 辑 性 强 、客 观 ， 解 释 更 加 可 靠 。 ５ 可 比 性 （ ｔｙｐｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｃｏｎｃｏｒｄａｎｃｅ） 指 不 同 操 作人员， 尤其不同实验室之间分型结果的可比性。 ６ 灵敏性 是指所选的分型方法能尽可能反映 较多的变化（ 差异） 信息， 反映有意义的变异信息。 ７ 分型方法 快速、费用低、技术简单、易于操作。
当今传染病暴发流行的性质发生了改变， 即： 暴发流行不再局限于某一地区， 一段相对集中的 时间里， 由同一污染源引起的暴发流行， 而是由多 个传染源， 在较长的时间段内， 跨越省市甚至是国 家的暴发流行。脉冲场凝胶电泳方法由于其自身 优势而被广泛应用于追踪监测细菌传染性疾病的 暴 发 流 行 ， ［１２，１３］ 还 有 助 于 识 别 散 发 病 例 的 传 染 源 。 ３ 可用于对已确认的爆发疫情进行传染源的追 踪 ， 从 而 有 效 预 防 疫 情 的 再 次 发 生［１４］。 ４ 除了帮助流行病学调查外， 细菌分型还能对病 人的诊断和治疗提供线索， 对连续继发性感染患 者 分 离 菌 株 进 行 ＰＦＧＥ 分 析 可 以 区 分 是 复 发 （ 单 一 菌 株 型 ） 还 是 新 的 菌 株 引 发 的 再 感 染［１５］。 ５ ＰＦＧＥ 也 用 于 抗 生 素 敏 感 株 和 多 重 耐 药 菌 株 的 分 子 分 型 ， 如 耐 苯 唑 西 林 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 ［１６］和 耐 甲 氧 苯 青 霉 素 金 黄 色 葡 萄 球 菌（ＭＲＳＡ）。 ６ 对生活环境中分离的菌株和病人中分离菌株 进 行 相 关 性 分 析 。 ［１７，１８］ ７ ＰＦＧＥ 还 可 用 于 其 他 领 域 ， 如 百 日 咳 抗 原 性 变 异 和 ＰＦＧＥ 的 相 关 性［１９］。
目 前 ＰＦＧＥ 图 像 应 用 ＢｉｏＮｕｍｅｒｉｃｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０） 数 据 库 软 件 进 行 处 理 ， 识 别 图 像 条 带 。聚 类 图 类 型 选 择 ＵＰＧＭＡ （Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ Ｐａｉｒ ｇｒｏｕｐ Ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ Ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ ａｖｅｒａｇｅｓ）方 法 ， 条 带 位 置 差 异 容 许 度 选 择 １．０％， 优 化 值 选 择 ０．５％。脉 冲 场 凝 胶 电 泳 分 析 通 常 使 用 Ｂａｎｄ ｂａｓｅｄ／Ｄｉｃｅ 方 法 计 算 相 似 性 系 数 ， 即 Ｄｉｃｅ 系 数 （Ｆ ×１００％ ， Ｆ ｖａｌｕｅ ×１００％ ） 来 衡 量 ＰＦＧＥ 带 型 之 间 的 相 似 度 。Ｆ﹦２ｎｘｙ／（ｎｘ﹢ｎｙ），ｎｘ 是 菌 株 ｘ 的 总 的 片 段 数 ， ｎｙ 是 菌 株 ｙ 的 总 的 片 段 数 ， ｎｘｙ 是 菌 株 ｘ 和 菌 株 ｙ 的 相 同 的 片 段 数［２４］， Ｆ 值 反 映 的 是 不 同 菌 株 电 泳 条 带 的 相 似 性 程 度 ， 范 围 在 ０～１ 之 间 ， ０ 代 表 完 全 不 相 关 ， １ 代 表 完 全 相 同［２５］。
二 ＰＦＧＥ 在分子生物学中的应用
ＰＦＧＥ 是 一 种 非 常 有 效 的 分 子 分 型 方 法 ， 在 国 外被广泛应用于很多菌种的分子流行病学研究 中 。能 够 用 于 分 析 菌 株 之 间 的 相 关 性 ， 协 助 追 踪 感 染 来 源 ， 在 疫 情 控 制 方 面 可 发 挥 重 要 的 作 用 。具 体 表现在以下几个方面： １ 研 究 菌 株 之 间 的 遗 传 差 异 。 ［１０，１１］ ２ 在表面上散在分布的病例中寻找可能的联系， 通过监测及时发现暴发。
但 是 Ｄａｖｉｓ 等［２１］认 为 ， 不 同 的 限 制 性 内 切 酶 可 能对菌株产生矛盾的聚类结果。所以如果必须根 据 ＰＦＧＥ 数 据 推 测 菌 株 间 的 流 行 病 学 关 系 ， 需 要 ６ 种或以上的限制性内切酶以对它们的遗传学关系 提供合理的估计。
Ｔｅｎｏｖｅｒ 等［２２］提 出 了 有 关 菌 株 同 源 性 的 判 别 标 准， 按其电泳条带可分为： 无差异， 说明为相同菌 株 ； 有 １～３ 条 带 的 差 异 说 明 菌 株 间 有 相 近 关 系 ， 且 只 有 单 基 因 的 改 变 ； ４～６ 条 带 的 差 异 说 明 菌 株 间 可能有相近关系， 表示出有两个独立基因的差异； 如菌株间有 ６ 条带或更多条带差异， 说明有三个 或 更 多 基 因 的 变 化 ， 被 视 为 无 相 关 性 。该 标 准 只 适 合于小量的局部性基因的变化研究， 有一定的局 限 性 。因 为 细 菌 的 高 变 异 性 ， 判 断 是 否 是 同 一 菌 株 时 允 许 一 定 的 变 异 存 在 。Ｆｒｅｄ［２３］在 解 释 ＰＦＧＥ 结 果 时 提 出 将 具 有 ８５％以 上 相 同 条 带 的 菌 株 认 为 是 相 同 的 菌 株 ， ５０％以 上 的 条 带 不 相 同 时 ， 菌 株 被 认 为 流行病学不相关。
同一种菌可以用多种内切酶来消化， 每一种 酶 得 到 的 ＰＦＧＥ 条 带 可 能 不 同 ， 但 是 最 终 聚 类 的 结 果 相 似 。Ｊａｉｍｅ Ｍａｒｔｉｎｅｚ－ Ｕｒｔａｚａ 等［２０］的 实 验 表 明 ： 副 溶 血 性 弧 菌 使 用 内 切 酶 Ｎｏｔ Ｉ 和 Ｓｆｉ Ｉ 的 ＰＦＧＥ 分型结果相似。
目前对病原细菌常用的分子生物学分型方法 有 ： 限 制 性 片 段 长 度 多 态 性 （ ＲＦＬＰ） ， 特 定 片 段 ＰＣＲ， 随 机 扩 增 多 态 性 ＤＮＡ 片 段 （ ＲＡＰＤ） ， 基 因 外 重 复 回 文 序 列 ＰＣＲ （ Ｒｅｐ－ ＰＣＲ） ， 裂 解 酶 片 段 长 度 多 态 性 （ ＣＦＬＰ） ， 扩 增 片 段 长 度 多 态 性 （ ＡＦＬＰ） ， ＤＮＡ 测 序 以 及 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 （ ＰＦＧＥ） ， 新 的 分 型 方 法 还 有 Ｍｕｌｔｉｐｌｅ － ｌｏｃｕｓ ｖａｒｉａｂｌｅ － ｎｕｍｂｅｒ ｔａｎｄｅｍ－ ｒｅｐｅａｔｓ ａｎａｌｙｓｉｓ （ＭＬＶＡ） 以 及 Ｍｕｌｔｉｐｌｅ － ｌｏｃｕｓ ｓｅ－ ｑｕｅｎｃｅ ｔｙｐｉｎｇ （ＭＬＳＴ）多 位 点 序 列 分 析 等 。 脉 冲 场 凝胶电泳是目前国内外流行病学研究广泛接受的 方 法 之 一 ， 与 其 他 方 法 相 比 ， 具 有 重 复 性 好 、分 辨 率 高［７－ ９］、结 果 稳 定 、易 于 标 准 化 的 优 点 ， 能 在 细 菌 基因组很庞大的情况下， 尽可能反映较多的变异 信 息 ， 其 周 期 长 的 缺 点 已 逐 渐 为 一 种 快 速 ＰＦＧＥ 方 法 （ ２４～４８ ｈ） 所 克 服 。