脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。
（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
210mg/mL tRNA。
35mol/L NaCl。
4 苯酚/氯仿。
53mol/L NaAc，pH5.2。
695%乙醇。
3. 设备1TBE 缓冲液。
2Seakem HGT 琼脂糖。
3Wide Mini-Sub Cell 凝胶电泳设备。
4 变速泵或蠕动泵 (Bio-Red Laboratory。
5IBI FIJI 600 HV 程序性开关设备。
6 缓冲液冷却循环器 (Fotodyne ， New Britain ，WI 或Mini Chiller(Bio-Rad Laboratory 。
【实验步骤】1. 脉冲电场凝胶电泳的DNA 样品的制备为避免大分子DNA 在提取过程中断裂，细胞需在琼脂糖凝胶块中进行原位裂解，在本实验中，我们使用金黄色葡萄球菌(StapHylococcusaureus 作为例子。
1 取100mL 对数生长期金黄色葡萄球菌细胞于4℃，5000g 离心5min 。
2 用20mL TEN 缓冲液冲洗沉淀，同样条件离心5min 。
之后用10mL EC 缓冲液使细胞悬浮。
3 取1.5mL 细胞样品与相同体积含2%SeaPLaque 琼脂糖的EC缓冲液迅速混合混匀并等分流溶液至封闭的模块中于4℃凝固，混合前加热至琼脂糖熔解并冷却至50℃。
4 对于每一个菌株，需要15～20 个凝胶块，将它们放至含有30～45μg/mL RNase(50mL 的10mg/mL 的RNase 的10mL EC缓冲液中，于37℃振摇过夜。
5 去掉裂解缓冲液，换为10mL ESP 缓冲液于50℃轻度振摇温育48h 。
6 将凝胶块放在10mL 含有174μg/mL 苯甲基磺酰氟(PMSF的TE 缓冲液中，室温温育4h(2h 换液一次，以灭活ESP 中的蛋白酶K 。
7 用TE 清洗琼脂块6h(2h 换液一次，置于TE 中4℃保存。
2. 限制酶消化提高PFGE 的分辨率取决于100～1000kb 片段电泳结果的重复率，它与酶切关系密切，可在琼脂糖凝胶块中使用合适的内切酶消化。
（生物秀实验频道 ）125μL10× 反应缓冲液，30U 限制酶，加双蒸水至250μL 混匀。
2 取一个凝胶块置其中，合适温度下温育过夜(按内切酶要求后，用TE 缓冲液洗涤并贮存。
3. 应用PFGE 对样品DNA 进行分析1 用0.5×TBE 缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT 琼脂糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。
若用Wide Minisub Cell进行电泳的话，50mL 该溶液即可。
2 胶凝后，小心移去样品梳。
将凝胶块用小刀切成与加样孔一致的大小，将样心地插入加样孔，避免产生气泡。
(若样品在溶液中，以l:1的比率与 50℃2%Seaplaque 琼脂糖相混合，迅速注入加样孔中。
3 把胶放入电泳槽内，加缓冲液，刚好覆盖胶的表面即可，缓冲液事先14℃冷却。
4 将电泳槽和一个连着稳压电源的程序性开关设备相连。
打开电源，调节蠕动泵到适当流速(5～10mL/rain或打开变速泵至40。
5 通过计算机启动极性转换程序。
大于50kb 的限制性片段在1.2s 和0.4s 正向和反向的电脉冲下得以分离，时间一般为3.5h 或更长。
小于50kb的限制性片段在0.4s 正向和0.2s 反向的电脉冲(比率为2:1下得以分离，时间为3～5h 。
6 在0.5μg/mL 溴化乙锭中进行染色并拍照。
4. 分离、纯化大的DNA 片段1 凝胶染色、分析后，在目的带前(靠近正极处切一个 0.25cm2左右的槽，注入0.8%Seaplaque琼脂糖，使之凝固。
2 重新打开极性转换开关，用紫外递质检测DNA 的迁移，当目的带进入Seaplaque 凝胶中时，关闭开关，切下目的带，移至1.5mL EP 管中。
3 加入2μL 的tRNA ，30μL 5mol/L NaCl，370μL 蒸馏水，在65～70℃之间，化胶并保温10min 。
4 苯酚/氯仿500μL 抽提两次。
5 用2.5 倍体积95%乙醇和1/10 体积NaAc(3mol/L，pH5.2 于-70℃10min 沉淀水相。
再用70%乙醇洗两次并将沉淀溶于TE缓冲液中。
【注意事项】1. 换缓冲掖时尽可能小心不要碰坏琼脂凝胶。
2.PMSF 是一个强烈的蛋白酶共价抑制剂，即有毒又挥发，操作时应在通风橱中进行。
3. 用蛋白酶K 包埋的材料时50℃温育时间很长(24～48h ，有些学者提出如此长时间不必要(Mortimer etal.1990 ，且可能造成高分子质量DNA 降解。
在实验中可视情况而定。
4. 琼脂糖凝胶块在TE(pH7.6中4℃可存放数年，如在0.5mol/L EDTA 中可存放更长时间。
5. 一些高压电源并不适合脉冲电场凝胶电泳，因为这些电源设计时均带有保护电路，它可以检测到负载的突然降低并且引发外加电源自动关闭。
6. 由于电压较高，就会产生热量，为了保证温度为14℃，需要一些冷却设备(缓冲液冷却循环器或MiniChiller 。
此外，把电泳系统放在一个敞口的冰盒中也可保持恒温。
PFGE （脉冲场凝胶电泳）标准操作规程(SOP目的：运用PFGE 方法对20Kb 至数Mb 的DNA 进行分子分型背景知识：这个试验是公认的操作繁琐，至少要2天，而且每一步操作对结果的好坏都有很大影响，因此，一个严格、标准的操作方法是十分十分必要的。
主体内容：一、胶块的制备1、在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，分别加入约2ml 细胞悬浊液(CSB；2、在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称；3、在模具上标记好对应样品的名称；4、用CSB 湿润接种环，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB 中，用bioMerieux Vitek colorimeter 测其OD 值，并调整至3.6~4.5。
如果OD 值大于4.5，加入CSB 稀释；如果OD 值小于3.6，增加菌量提高其浓度。
5、取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。
将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备好放在水浴摇床中。
6、从水浴箱中取出eppendorf 管，每管加入20µl蛋白酶K(储存液浓度为20mg/ml混匀，使其终浓度为0.5mg/ml。
7、制备好1%Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。
8、在eppendorf 管中加入400µl的1% Seakem Gold：1%SDS，用枪头轻轻混匀。
9、将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。
注意事项：(1用后的接种环要放在指定的废弃物容器中。
(2细胞悬浊液、蛋白酶K 要置于冰上。
(3在混合细胞悬浊液和1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。
(4混合物加入模具时不能产生气泡。
(5在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。
二、细胞的裂解1、在50ml 的screw-cap tube上做好标记。
2、配制细胞裂解液(CLB：每5ml 细胞裂解液加入25µl蛋白酶 K(20mg/ml，使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。
注意：蛋白酶K 要置于冰上，配制好的细胞CLB 也要置于冰上。
3、每个管子加入5ml 蛋白酶K/CLB混合液。
4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。
(1可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap 管中。
(2一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap 管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。
5、保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。
7、将纯水和TE 放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块1、从水浴摇床中拿出screw-cap 管，盖上绿色的screened-cap 。
轻轻倒掉CLB 。
在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。
注意：把管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排除干净。
随后的操作中也如此。
2、每管中加入15ml 预热的纯水。
3、确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床中，摇10分钟。
4、倒掉水，用纯水再洗一次。
、5、倒掉水，加入15ml 预热的TE ，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。
6、倒掉TE ，用TE 重复洗三次，每次10－15分钟。
7、倒掉TE ，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备用。
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。
它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。
PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：
1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。
2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。
3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。
4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。
总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。
该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。
下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。
1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。
可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。
选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。
2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。
将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。
b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。
在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。
c. 让凝胶固化。
根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。
3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。
将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。
b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。
确保尽量避免气泡进入凝胶槽。
c. 启动电泳。
电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。
启动电源，并将电流设置为所需的值。
4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。
常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。
b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。
这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。
5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。
b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。
6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。
b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为：细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要，所采用的内切酶常为寡切点酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），这种酶切后的片段少而大，适合于作PFGE电泳。
McCllelland等通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现，四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的，在他们所试验的16个细菌的染色体中，被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切，每100000bps中不到一次，这些酶的识别序列分别为：XbaⅠ（TCTAGA），SepⅠ（ACTAGT），AvrⅡ（CCTAGG）和NheⅠ（GCTAGC）。
同样地，在许多含G+C<45%的基因组，CCG和CGG更少。
这样用SmaⅠ（CCCGGGG）、R srⅡ（CGGWCGG）、NaeⅠ（GCCGGC）和SacⅡ（CCGCGG）进行酶切，对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察，可因不同研究者而出现较大差异，据此，Tenover等经过多年的研究提出了PFGE的解释标准：(1)相同（indistinguishable）：酶切图谱间有同样的条带数，且相应条带大小相同，流行病学上则认为相同，这种经PFGE证实的结果，用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
(2)紧密相关（closelyrelated）：PFGE试验中，其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改变，如点突变、插入或DNA缺失。
典型的情况下，这种变化可导致2～3条带的差异，当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。
(3)可能相关（possiblyrelated）：两个独立的基因情况所致的一致的差异，如出现了4～6条带差异，此时能用简单的插入或DNA缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。
脉冲场凝胶电泳分离技术
脉冲场凝胶电泳分离技术在生物学、医学、环境科学等领域广泛应用，它针对DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的高分辨率分离和分析具有非常重要的意义。
一、的原理是在凝胶电泳基础上发展出来的。
它利用凝胶矩阵中各点的电阻率不同，即芯中高，表层低的特性，将生物大分子按大小和电荷在凝胶中进行分离。
基于两个国际单位制（SI）的物理量——电场强度和电流密度。
在其中电场强度指单位电量在两点间的电场强度，它的基本单位是伏特每米；电流密度指通过某一面积的电流值，它的基本单位是安培每平方米。
生物大分子在凝胶中进行电泳时，电场强度和电流密度的变化规律直接影响它们在凝胶中的迁移距离和选择性质。
二、的优缺点1.优点具有极高的分辨能力，在分离比较小的DNA片段方面具有明显的优势。
另外，它较为灵活，可以根据样本的特性和需求来设计实验方案。
此外，这种技术实验成本不高，实验条件相对简单。
2.缺点的缺点在于，进行实验需要逐级递增加强电场，涉及到的专业知识比较复杂，操作门槛较高。
另外，由于DNA迁移距离与其电荷量和大小成反比，因此在进行分离的过程中，需要选定相应的凝胶浓度和电场，以克服基于这些因素引起的迁移距离不均的问题。
三、的应用1.在DNA分离中的应用在DNA分离中应用比较广泛，可以用来鉴定遗传变异、克隆DNA、以及构建DNA指纹等。
对于基因测序中所需的较长的DNA片段，也可以进行分离。
2.在RNA分离中的应用也可以应用于RNA分离领域，在这一领域中，它可以用来鉴定表达的不同等。
3.在蛋白质分离中的应用除了在DNA和RNA分离中的应用，还可以应用于蛋白质的分离中。
在蛋白质分离中，这项技术使用较少，但仍然具有应用潜力，可用于鉴定蛋白质降解产物等。
总结：在生物技术领域具有非常重要的意义。
其高分辨率、灵活性等特性，使得它可以在不同的领域进行应用。
虽然技术门槛相对较高，但它的优点仍然是非常显著的。
我们期待，在后续的发展研究中，会变得更加成熟，更加高效，并且得到更加广泛的应用。
脉冲场凝胶电泳的原理
条带变粗 ---减少上样量 条带拖尾或模糊---电场转换时间不适合，优化电 场转换时间、上样量太高，调整样品浓度 大片段DNA 不能有效分离---降低电压、延长电场 转换时间 条带弯曲---缓冲液缓冲能力下降，更换缓冲液、 上样时样品块被挤碎、泵速度太慢
脉冲时间
当电场方向发生改变, 大分子的DNA 便滞留在胶孔中, 直 至沿新的电场重新定向后, 才能继续向前移动,大分子DNA 重新定向需要的时间长 当DNA分子变换方向的时间小于脉冲周期时,DNA 就可 以按其分子量大小分开
改变脉冲时间
分离不同大小DNA
电压
最常用的电压是6V/cm，低电压时，迁移率与电 压成正比，想分离大分子DNA时一般选用低电压 和延长脉冲时间
1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA片段 1.2–1.5%的琼脂糖浓度可以使片段更加紧密 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的DNA片段， 不过条带很弥散
缓冲液和温度
温度越高，DNA移动速度越快，但是条带的 清晰度和分辨力明显下降。温度过高会导致 DNA带变形或解链。 最佳电泳温度是14 ℃ 最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer，有时 也可以用1.0x的TAE buffer代替
脉冲场凝胶电泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)
用于分离大分子量DNA 片段的一种电泳方法。 PFGE 是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完 成分离大分子DNA。
影响PFGE的因素
琼脂糖凝胶浓度
浓度越高，移动速度越慢，适合分离低分子量DNA 浓度越低，移动速度越快，适合分离高分子量DNA
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNDR-II脉冲场电取出凝胶，放在电泳槽中 适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、 脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min， 清水漂洗20min，置凝胶成像系统 中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼 脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化 温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可 以从凝胶中回收天然形式的DNA
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。
而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。
图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。
当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。
可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。
该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。
在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。
DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。
这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。
实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。
接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。
带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。
根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。
需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。
但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。
脉冲场凝胶电泳技术
5、 把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。 如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在 第1、5、10个齿上。 6、 用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在 室温下风干约3分钟。 7、 把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上， 并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央 缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％ SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在 室温下凝固30分钟左右。 8、 记录加样顺序。
多余的部分。
5、 保证胶块在液面下而不在管壁上。
6、 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速
约170转/分钟。
7、 将纯水和TE放在50℃水浴摇床中预热。
三、洗胶块 1、 从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的 screened-cap。轻轻倒掉CLB。在实验台上轻磕管 底使胶块落在管底。 2、 每管中加入15ml预热的纯水。 3、 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回 50℃水浴摇床中，摇10分钟。 4、 倒掉水，用纯水再洗一次。 5、 倒掉水，加入15ml预热的TE，在50℃的水浴 摇床中摇15分钟。 6、 倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。 7、 倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备 用。
四、胶块内DNA的酶切 1、 在1.5ml eppendorf管上标记好相应的样品及 H9812的名称。 2、 按照下面的比例配制缓冲液H的稀释液，混匀。 试剂 µl/胶块 µl /10胶块 纯水 180µl 1800µl Buffer D 20µl 200µl 总体积 200µl 2000µl 注意：缓冲液要置于冰上。
调整至3.6~4.5。如果OD值大于4.5，加入CSB稀释；如果