脉冲场电泳(PFGE)数据分析
脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用
脉冲场凝胶电泳技术在致病菌分型技术的应用脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，该技术是将电泳电场方向交替性改变，并优化脉冲时间和其他条件，可以分辨凝胶中35～10 000 kb的DNA分子。
该方法应用于分子流行病学中，通过观察电泳条带的差异，为确定菌株之间的亲缘关系提供了可靠的技术手段。
该技术在致病菌溯源（细菌性传染性疾病溯源、细菌性食源性疾病溯源）、医院内感染流行监测等方面都有广泛的应用。
标签：脉冲场凝胶电泳；致病菌分型；致病菌溯源；院感监测[Abstract] Pulsed Field Gel Electrophoresis （PFGE）is a new technique of gelelectrophoresis developed in1980’s. It can be used to separate large DNA molecules ranging from 35 to10 Mb. It has been widely applied to the pathogen molecular typing ，identification of species groups ，Source-tracking of pathogen and nosocomial infection surveillance.[Key words] PFGE；Pathogen molecular typing；Traceability pathogens；Hospital infection surveillance脉冲场凝胶电泳（pulse-field gelelectrophoresis，PFGE），又称脉冲式交变电场电泳，是上世纪80年代后期发展起来的一种新型的电泳技术，主要用来分离大分子量线性DNA。
传统的琼脂糖凝胶电泳技术仅能分离50 kb以下的DNA分子，对于超过50 kb的DNA分子，传统的琼脂糖凝胶其分子筛作用较弱，无法清晰分辨电泳条带[3]。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为：细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要，所采用的内切酶常为寡切点酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），这种酶切后的片段少而大，适合于作PFGE电泳。
McCllelland等通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现，四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的，在他们所试验的16个细菌的染色体中，被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切，每100000bps中不到一次，这些酶的识别序列分别为：XbaⅠ（TCTAGA），SepⅠ（ACTAGT），AvrⅡ（CCTAGG）和NheⅠ（GCTAGC）。
同样地，在许多含G+C<45%的基因组，CCG和CGG更少。
这样用SmaⅠ（CCCGGGG）、R srⅡ（CGGWCGG）、NaeⅠ（GCCGGC）和SacⅡ（CCGCGG）进行酶切，对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察，可因不同研究者而出现较大差异，据此，Tenover等经过多年的研究提出了PFGE的解释标准：(1)相同（indistinguishable）：酶切图谱间有同样的条带数，且相应条带大小相同，流行病学上则认为相同，这种经PFGE证实的结果，用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
(2)紧密相关（closelyrelated）：PFGE试验中，其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改变，如点突变、插入或DNA缺失。
典型的情况下，这种变化可导致2～3条带的差异，当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。
(3)可能相关（possiblyrelated）：两个独立的基因情况所致的一致的差异，如出现了4～6条带差异，此时能用简单的插入或DNA缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。
科室PFGE分析
背景的问题
• • • • • DNA降解 菌量过多 裂解不完全 清洗不足 酶切不完全
谢谢！
PFGE操作及注意事项
金东 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室
PFGE原理与方法
实践表明：长度大于40KB的DNA不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中 分离。脉冲场凝胶电泳解决了这一难题，该法可以分离长至50MB 的DNA分子。其原理是：DNA分子在交替变换方向的电场中做出反 应的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较快，因而在凝胶 中移动也较快，于是不同大小的分子被成功分离。 DNA分子在交替电场作用下的行为可以用分子的延展性和沿电场 方向平行泳动前的重新定向解释。DNA分子以蠕行（reptation） 方式在琼脂糖凝胶的连续孔洞中迁移。当电场变换方向时，DNA 分子在新的方向泳动前必须再定向。
PFGE是一个操作步骤相对复杂的试 验过程，除了保证相关仪器和耗材 的质量外还需要操作人员的仔细认 真和试验程序的标准化
Excellent gels
1. Gel fills the whole TIFF 2. Wells included on TIFF 3. All bands including the last band of the standard appear on the TIFF 4. The last band of the standard is 1-1.5cm from the bottom of the gel 5. The cell concentration is approximately the same in each lane 6. Clear and distinct bands all the way to the bottom of the gel 7. Straight lane 8. Complete restriction in all lanes 9. Clear backgroud 10.No DNA degradation (no smearing in all lanes)
脉冲场凝胶电泳技术_PFGE_在分子分型中的应用现状_王丽丽
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疾病监测 ２００６ 年 ５ 月 ３１ 日第 ２１ 卷第 ５ 期 Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ， Ｍａｙ．３１，２００６， Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．５
·综 述·
脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）在分子分型中的应用现状
王丽丽， 徐建国
关键词： 脉冲场凝胶电泳； 分子分源自； 应用【中 图 分 类 号 】Ｒ－ ３３１
一 ＰＦＧＥ 方法原理
ＰＦＧＥ 以 其 重 复 性 好 ， 分 辨 力 强 而 被 誉 为 细 菌 分子生物学分型技术的＂金标准＂。它可以用于大 分 子 ＤＮＡ 的 分 离 ， 其 分 辨 范 围 达 到 １０ Ｍｂ。 而 普 通 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 仅 能 分 离 小 于 ５０ ０ ｋｂ 的 ＤＮＡ 分 子 。ＰＦＧＥ 的 基 本 原 理 是 通 过 电 场 的 不 断 改 变 ， 使 包 埋 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 的 ＤＮＡ 分 子 的 泳 动 方 向 做 相 应 改 变 ， 小 的 ＤＮＡ 分 子 比 大 的 变 化 快 ，
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNDR-II脉冲场电取出凝胶，放在电泳槽中 适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、 脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min， 清水漂洗20min，置凝胶成像系统 中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼 脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化 温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可 以从凝胶中回收天然形式的DNA
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析
脉冲场凝胶电泳技术及其在细菌感染性疾病中的应用分析在细菌的相关研究中，比如其流行特征、追踪传染源等，有多种方式可以实现。
其中应用比较广泛的方法是将菌株分型，以此来得到同源性关系。
具体来说，脉冲场凝胶电泳技术是实现基因分型的一种最为常用的方法，该方法得到的结果的重复性和分辨率都是非常好的，很多相关的研究人员都会采用该种方式来研究细菌感染性疾病的相关知识。
本文对脉冲场凝胶电泳技术的应用进行相关分析和探究，具体内容如下。
1 原理脉冲场凝胶电泳技术也称为PFGE技术，该技术是在1984年被美国科学家提出的。
PFGE技术主要是通过限制性核算内切酶可以将DNA实现消化，最终可以产生多个有限的，并且各段长度都不一样的DNA片段，一般来说，片段数量通常在5到20之间。
之后便可以采用常用的电泳方式实现分离。
根据跟李的电泳条带图谱，可以正确地判断细菌的种类。
基于以上原理，PFGE技术可以很好地反应细菌所有基因组的情况，包括一些细微的地位，这将对细菌的相关研究具有非常有利的影响。
2 结果判断如果在图片条带上的大小以及出现的数量都是相同的，则可以认为其型别是相同的。
如果在所有的图片条带中，有两个或者三个是有所差别的，则可以认为其亲缘关系是较为密切的。
如果在所有的图片条带中，有四到六个是有所大的，则可以认为它们之间有可能会存在亲缘关系。
而如果在所有的图片条带中出现了大于等于七个有所差异的条带，则认为两者之间不存在任何的亲缘关系。
考虑到细菌间的变异特性，将85%作为判断相关的标准。
3 主要影响因素第一，是缓冲液温度。
缓冲液的温度会产生一定的影响。
这是因为缓冲液的温度越高，那么电泳对应的速度是越快的，这就使得整个的时间变得更短，这会导致条带的分辨率变得较低，不能很好得进行识别。
在缓冲液温度较低的情况下，对应的电泳所需要的时间就会变得越长，会让条带更好地进行分辨，通常将温度维持在14度左右，第二，是脉冲的角度。
脉冲的角度也会对结果产生一定的影响。
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细菌分子分型技术服务(PFGE/MLVA/MLST)
一、产品描述信息
过去20年的实践证明，分子分型方法在细菌的分子流行病学、种群结构分析、基因多态性分析等方面显示了很好的应用能力，在疾控、医药、农业、食品、环境、出入境检验检疫等领域发挥重要作用。
其中脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）和多位点可变数目串联重复序列分型（MLVA）三种技术是目前应用最广泛的细菌分子分型方法。
PFGE以其重复性好，分辨力强而被誉为细菌分子分型技术的“金标准”。
它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10 Mb。
PFGE选用识别低频率酶切位点的内切酶切割基因组DNA，获得的DNA大片段在外加脉冲电场的低浓度琼脂糖凝胶中分离，产生数量有限的DNA条带，在凝胶上按染色体片段长度的不同而呈现出电泳带型，从而实现对菌株分型以检测菌株的基因多态性。
MLST是基于细菌核苷酸序列比对的一种分子分型方法，其原理是通过比较细菌个体7个或者更多管家基因的核苷酸序列的多态性，确定其基因多态性，同时通过划分序列群和构建最小生成树来揭示细菌群体遗传结构。
MLVA是基于细菌基因组中多个位点的数目可变化的串联重复序列核心序列的拷贝数的差异来对不同细菌个体进行分型的一种技术。
MLVA具有快速高通量易于操作等优点，不仅能确定基因多态性，而且能揭示细菌群体遗传结构特征。
使用PFGE、MLST、MLVA中的一种或者综合使用多种分型方法，可以揭示细菌的基因多态性和群体遗传结构，结合细菌的三间分布信息以及其他生物学信息（如耐药特征、特殊表型、毒力基因检测）等可以进行细菌的流行特征、传播机制、变异特征分析，以及特殊意义克隆群的甄别等研究，另外还可以为后续的研究，如全基因组测序、致病机制研究等项目筛选具有基因组代表性的测试菌株。
二、产品详细信息
1、技术路线
2、技术优势
1.技术成熟，本团队具有丰富的实践经验，可为客户提供详细先进的实验方案；
2.有多种分型方法组合供不同的实验目的选择；
3.性价比高，适合开展大样本量的实验项目；
4.快速高效，只需一个月时间可以完成100株细菌的基因多态性和种群结构分析。
3、样本要求
1.细菌（PFGE用）
冻存或者平板培养状态均可。
2.细菌DNA（MLST和MLVA用）
浓度≥ 30 ng/μL；总量100μL；纯度达到可开展常规PCR扩增要求。
三、数据分析服务
BioNumerics主要应用：
◆PFGE typing
◆RiboPrinter typing
◆MLST analysis、MLVA typing
◆MALDI、AFLP、RFLP、RAPD
◆REP-PCR、ARDRA、DGGE、TGGE
◆Whole genome MLST
◆Whole Genome Map Types
◆Antibiotic resistance profiling
◆Community fingerprinting
◆Diversilab genotyping
◆Hetero-Duplex Analysis (HDA)
◆HIV drug resistance prediction
◆ISSR-PCR using QIAxcel
◆ITS typing
◆MIRU-VNTR typing
◆MLPA analysis
◆Molecular surveillance
◆Sequence-based typing
◆Sequence repeat typing
◆SmartFinder data analysis
◆spa-typing
◆T aqman-based SNP genotyping
四、服务咨询及技术支持
电话: 021 - 6488 7580 QQ:327 162 799
E-mail：info@。