脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。
它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。
PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：
1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。
2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。
3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。
4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。
总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。
该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。
下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。
1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。
可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。
选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。
2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。
将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。
b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。
在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。
c. 让凝胶固化。
根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。
3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。
将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。
b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。
确保尽量避免气泡进入凝胶槽。
c. 启动电泳。
电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。
启动电源，并将电流设置为所需的值。
4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。
常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。
b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。
这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。
5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。
b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。
6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。
b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
PFGE实验的标准流程
大肠杆菌0157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂（TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养14-18小时；用同一个接种针/环,穿刺或接种于小螺帽管中的TSA、HIA或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。
同时接种标准株H9812。
第一天步骤1 细菌的包埋1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配方见附件）制备1%Seakem Gold:1%SDS琼脂糖.以配置25ml体积为例说明,方法如下:1)准确称取0.25g Seakem Gold agarose,放入250ml的蓝盖瓶中.2)加入22.5mlTE缓冲液,轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开.3)微松盖瓶,将玻璃瓶放入微波炉内搞活加热30秒,取出轻柔摇荡,再次加热30秒,重复操作直至琼脂彻底溶解(无颗粒物、悬浮物、透光均一，无明显异常折光，无气泡)4)将溶解的Seakem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml,置于56℃水浴箱备用.3、在Falcon2054管(或其他相当的管)上标记样品名称和空白对照;在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称.4、在Falcon2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB(配方见附件).注:使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同.5、用CSB湿润棉签，从培养皿上刮去适量细菌，均与悬浊于CSB中。
通过加入CSB稀释或增加菌量提高浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。
1）用比浊仪（bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度,并调整浓度至4.0-4.5麦氏单位.2）用分光光度计时,在610nm波长吸光度应在1.3-1.4.3）Dade Microscan Turbidity Meter:0.48-0.52(以Falcon2054管测量) 0.68-0.72(以Falcon2057管测量)注:在 4.0-4.5该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果,但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异,影响条带的识别.6、取400ul细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中,置于37℃水浴中孵育5分钟.将剩余的细菌悬浊液置于冰上知道胶块制备完毕.7、从水浴箱中取出微量离心管,没管加入20ul蛋白酶K(储存液浓度20mg/ml)混匀,使其终浓度为0.5 mg/ml,蛋白酶K置于冰上备用.8、加入400ul的1%Seakem Gold:1%SDS到上述装有400ul细菌悬液的微量离心管内,用枪头轻轻混匀,避免有气泡产生.(此时1%Seakem Gold:1%SDS需置于56℃水浴中)9、迅速将混合物加入模具,避免气泡产生,在室温下凝固10-15分钟.为节省时间也可以在4℃下凝固5分钟.10、记录好模具内对应样品的名称。
科室PFGE分析
背景的问题
• • • • • DNA降解 菌量过多 裂解不完全 清洗不足 酶切不完全
谢谢！
PFGE操作及注意事项
金东 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 传染病预防控制国家重点实验室
PFGE原理与方法
实践表明：长度大于40KB的DNA不能在恒强水平琼脂糖凝胶电泳中 分离。脉冲场凝胶电泳解决了这一难题，该法可以分离长至50MB 的DNA分子。其原理是：DNA分子在交替变换方向的电场中做出反 应的时间取决于它的大小。较小的分子重新定向较快，因而在凝胶 中移动也较快，于是不同大小的分子被成功分离。 DNA分子在交替电场作用下的行为可以用分子的延展性和沿电场 方向平行泳动前的重新定向解释。DNA分子以蠕行（reptation） 方式在琼脂糖凝胶的连续孔洞中迁移。当电场变换方向时，DNA 分子在新的方向泳动前必须再定向。
PFGE是一个操作步骤相对复杂的试 验过程，除了保证相关仪器和耗材 的质量外还需要操作人员的仔细认 真和试验程序的标准化
Excellent gels
1. Gel fills the whole TIFF 2. Wells included on TIFF 3. All bands including the last band of the standard appear on the TIFF 4. The last band of the standard is 1-1.5cm from the bottom of the gel 5. The cell concentration is approximately the same in each lane 6. Clear and distinct bands all the way to the bottom of the gel 7. Straight lane 8. Complete restriction in all lanes 9. Clear backgroud 10.No DNA degradation (no smearing in all lanes)
脉冲场凝胶电泳技术_PFGE_在分子分型中的应用现状_王丽丽
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疾病监测 ２００６ 年 ５ 月 ３１ 日第 ２１ 卷第 ５ 期 Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ， Ｍａｙ．３１，２００６， Ｖｏｌ．２１， Ｎｏ．５
·综 述·
脉冲场凝胶电泳技术（PFGE）在分子分型中的应用现状
王丽丽， 徐建国
关键词： 脉冲场凝胶电泳； 分子分源自； 应用【中 图 分 类 号 】Ｒ－ ３３１
一 ＰＦＧＥ 方法原理
ＰＦＧＥ 以 其 重 复 性 好 ， 分 辨 力 强 而 被 誉 为 细 菌 分子生物学分型技术的＂金标准＂。它可以用于大 分 子 ＤＮＡ 的 分 离 ， 其 分 辨 范 围 达 到 １０ Ｍｂ。 而 普 通 的 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 仅 能 分 离 小 于 ５０ ０ ｋｂ 的 ＤＮＡ 分 子 。ＰＦＧＥ 的 基 本 原 理 是 通 过 电 场 的 不 断 改 变 ， 使 包 埋 在 琼 脂 糖 凝 胶 中 的 ＤＮＡ 分 子 的 泳 动 方 向 做 相 应 改 变 ， 小 的 ＤＮＡ 分 子 比 大 的 变 化 快 ，
PFGE原理及参数设置
金东 2010年6月
PFGE原理及相关参数
PFGE原理及相关参数
超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同 速率迁移。大于该极限长度后DNA的迁移速度几乎与分子 大小无关。当DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，卷曲 的DNA分子在电场作用下会沿电场方向拉伸变形挤过筛孔， 凝胶介质的分子筛效应不明显，此时DNA分子在电场中的 迁移速度主要取决于电场强度。 有实验证明长度大于40KB的DNA分子不能在恒强水平琼脂 糖凝胶电泳中分离。
PFGE操作基本流程
PFGE操作的基本流程—革兰氏阴性菌
PFGE操作的基本流程
相对于容易破壁 的革兰氏阴性菌， 革兰氏阳性菌通 常需要使用溶菌 酶或者是其他试 剂对其进行预先 处理。
PFGE聚类分析原则
TENOVER原则与聚类分析
不同研究者对于同样的PFGE带型会有完全不同的解 释，对于这些菌株是否属于暴发相关或者暴发不相关 的菌株也会有完全不同的意见，对于PFGE带型上条 带的差异也有不同的解释。 TENOVER原则是在没有使用软件进行分析的时候 PFGE带型解释方法。这个标准对于临床实验室分析
缓冲液的缓冲能力以及长电泳时间中液体的损耗问题。
通常用于脉冲场凝胶电泳的电泳缓冲液包括两种 0.5XTBE和1XTAE，其中1XTAE常用于MB级的DNA片 断的分离（>3MB），而0.5XTBE常用于<1MB的片断
的分离。
电泳温度
脉冲场凝胶电泳通过冷凝以及循环系统实现对电泳缓冲液
的温度控制。
当缓冲液的温度越高，电泳所需要的时间也就越短。但是， 较高的温度会造成条带弥散，影响分辨率。
PFGE作为暴发菌株的鉴定是一种有效的方法，然而 一旦收集菌株的时间跨度超过三到六个月，分型研究 就转化为种群研究。而另外一些技术，如MLST，主 要用于监测微生物种群随时间的变化。管家基因的突 变是中性突变，不受环境选择压力的影响。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
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普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNDR-II脉冲场电泳 仪
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
伯乐CHEF Maмын сангаасFGE电泳实验过程
胶块的制备
1、取肌肉组织、研磨过滤、细胞计数。 2、将细胞与低熔点琼脂糖混合后加入凝胶模 具中，待凝固后取出。 3、用含有蛋白酶K的裂解液将胶块内的细胞 裂解，释放出DNA. 4，用苯甲基磺酰胺（PMSF）去除蛋白酶K。 5、存贮于0.5M EDTA中半年无降解。
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA 片段 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的 DNA片段，不过条带很弥散
2.缓冲液的种类、浓度和温度的影响 缓冲液中的离子浓度越低，电泳跑得越快。 Buffer缓冲液的温度影响整个电泳时间和结 果，缓冲液的温度越低，电泳跑的越慢，得 到的条带越细直，结果越理想.目前认为14℃ 能得到最好的电泳带型。
最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer， 有时也可以用1.0x的TAE buffer代替。缓
冲液体积不得少于2.2 L
3.脉冲角度、时间、电压梯度
电泳角度： 使用较小的角度，可以把电泳时间减少50 ％ ,较大的片段分离的更理想，但较小的片段分离效果 降低 。因此要根据分离片段大小来调整脉冲角度。 脉冲时间 ：脉冲时间就是电极在单一方向改变所需要的 时间，如30s的脉冲时间即为电极在单一方向受脉冲作 用30s，然后在另一个方向作用30s。为了分离小片段 的样本，通常减小脉冲时间；为了分离大片段的样本， 通常增大脉冲时间。 电压：850 kb左右的DNA片段，6 V／cm的电压梯度最 宜； 大于3 Mb的DNA片段，1.5～3 V／cm电压梯度最 宜；
谢谢！！！
制胶过程模拟图
胶块上样模拟图
拆卸凝胶槽，小心取出凝胶，放在电泳槽中 适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、 脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min， 清水漂洗20min，置凝胶成像系统 中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼 脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化 温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可 以从凝胶中回收天然形式的DNA
4.制冷系统以及泵的流速等
蠕动泵的流速：一般控制在50-70左右，以免速度 太快，使胶在溶液中移动。
冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打 开，以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝 结成冰块而堵塞管道。
电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作， 以避免因为时间太长，而造成条带的弥散。
五、PFGE方法的局限和不足