脉冲场凝胶电泳的原理
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
pfge原理
pfge原理PFGE原理是一种分子生物学技术，全称为脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），它是一种分离和分析DNA片段的方法，可以将大片段的DNA分子从凝胶中分离出来，从而进行电泳分析。
1. 原理PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场，使DNA的运动方向变化，从而使大分子量DNA可以被更好的分离。
首先，DNA被切成片段，并在凝胶中进行电泳分离。
PFGE所采用的凝胶是一种“交错”的凝胶，即在不同方向上阻碍电泳运动的纤维素。
在电场中，DNA分子因为其大小、形状和电荷密度不同而负载不同的电荷，向着凝胶的两个端点移动。
在PFGE过程中，电场方向会不断改变，这种改变可以使大分子量DNA分子在不同方向上进行运动。
一次分离过程通常持续16小时以上。
2. 应用PFGE技术是目前常用的DNA分子分离技术之一，其应用范围广泛，主要用于以下领域：（1）遗传学研究：PFGE技术可以帮助了解基因组结构和动态变化，尤其是在菌群的基因组研究中，PFGE技术具有重要作用。
（2）食品安全检测：PFGE技术可以用于食品安全检测，例如细菌的分离和鉴定，食品中微生物的种类、数量及分布等的研究。
（3）医学研究：PFGE技术在医学领域中有广泛应用，比如可以用来检测癌症等重大疾病，检测病原体和细菌的快速鉴定等。
3. 优势相较于常规的DNA电泳，PFGE技术有以下几点优势：（1）可以分离大分子量的DNA分子，比如细菌的染色体DNA。
（2）可以提高DNA分离的分辨率，从而更准确地分析DNA的结构和变异情况。
（3）PFGE的原理可以单独分离DNA分子，使处理比较麻烦的DNA成为可能，比如重复序列等。
总之，PFGE技术在现代生命科学中已经成为了不可或缺的基础技术之一。
通过PFGE技术，我们可以更好地理解细胞DNA的组成和结构，同时对食品和医学工作中的研究也有着巨大的帮助作用。
脉冲场凝胶电泳分离技术
脉冲场凝胶电泳分离技术在生物学、医学、环境科学等领域广泛应用，它针对DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的高分辨率分离和分析具有非常重要的意义。
一、的原理是在凝胶电泳基础上发展出来的。
它利用凝胶矩阵中各点的电阻率不同，即芯中高，表层低的特性，将生物大分子按大小和电荷在凝胶中进行分离。
基于两个国际单位制（SI）的物理量——电场强度和电流密度。
在其中电场强度指单位电量在两点间的电场强度，它的基本单位是伏特每米；电流密度指通过某一面积的电流值，它的基本单位是安培每平方米。
生物大分子在凝胶中进行电泳时，电场强度和电流密度的变化规律直接影响它们在凝胶中的迁移距离和选择性质。
二、的优缺点1.优点具有极高的分辨能力，在分离比较小的DNA片段方面具有明显的优势。
另外，它较为灵活，可以根据样本的特性和需求来设计实验方案。
此外，这种技术实验成本不高，实验条件相对简单。
2.缺点的缺点在于，进行实验需要逐级递增加强电场，涉及到的专业知识比较复杂，操作门槛较高。
另外，由于DNA迁移距离与其电荷量和大小成反比，因此在进行分离的过程中，需要选定相应的凝胶浓度和电场，以克服基于这些因素引起的迁移距离不均的问题。
三、的应用1.在DNA分离中的应用在DNA分离中应用比较广泛，可以用来鉴定遗传变异、克隆DNA、以及构建DNA指纹等。
对于基因测序中所需的较长的DNA片段，也可以进行分离。
2.在RNA分离中的应用也可以应用于RNA分离领域，在这一领域中，它可以用来鉴定表达的不同等。
3.在蛋白质分离中的应用除了在DNA和RNA分离中的应用，还可以应用于蛋白质的分离中。
在蛋白质分离中，这项技术使用较少，但仍然具有应用潜力，可用于鉴定蛋白质降解产物等。
总结：在生物技术领域具有非常重要的意义。
其高分辨率、灵活性等特性，使得它可以在不同的领域进行应用。
虽然技术门槛相对较高，但它的优点仍然是非常显著的。
我们期待，在后续的发展研究中，会变得更加成熟，更加高效，并且得到更加广泛的应用。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳技术的应用及其发展趋势
移 动 比较慢 ， 根据 各 Ｄ ＮＡ 分子 迁 移距 离 的不 同 ， 从 而 可 以 达 到 分 离 不 同 大 小 的 ＤＮＡ 分 子 的 目 的 。在 所 有分 子 分 型 方 法 中 ， 脉 冲 场 凝 胶 电 泳 以 重 复 性 好、 分辨性强 ， 被作 为细菌分 子分 型 的“ 金 标准” 。 现在 Ｐ Ｆ Ｇ Ｅ 已被 广 泛 应 用 于 菌 株 遗 传 关 系 比较 、 食
・
２ ２ ・
《 上 海畜牧 兽 医通讯 》 ２ Ｏ １ ４年 第 ６期
脉 冲 场凝 胶 电 泳 技 术 的应 用及 其 发 展 趋 势
董 栋 海 洋 大 学 上 海 ２ ０ １ ３ ０ ６ ２上 海 市 兽 药 饲 料 检 测 所 上 海 ２ ０ １ １ ０ ３）
ｌ ｙ ｄ ｒ ｕ ｇ － ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎ ｔ Ａｃ ｉ ｎ ｅ ｔ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｂａ ｕ ｍａ ｎｎ ｉ ｉ ， ＸＤＲ・ ＡＢ）
药谱相 近多 重耐 药大肠 杆 菌进 行 ＤＮＡ 指纹 图谱 分 型， 比较菌 株 间 的亲 缘 关 系 ， 结 果 发 现 同一 养 殖 场
分离 的菌 株 相 关 。这 是 对 引 发 病 症 的溯 源 起 到 很 好 的作 用 。如果 用 Ｐ Ｆ ＧＥ分 析 细菌 耐药 性 ， 就可 以 追踪 病 原 菌 来 源 ， 从 而 对 病 原 菌 引 发 的疾 病 做 预
防 。Ｐ Ｆ ＧＥ应 用 于 细 菌 耐 药 性 已 有 研 究 。 以 ２ ０ １ １
一
分型与鉴定 的血清型呈现 明显关 系 ， 但通 过研究 吸 附 能 力 的结 果 显 示 ， 单核细胞增生李 斯特菌 的 Ｐ Ｆ Ｇ Ｅ分
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳近年来，以脉冲场凝胶电泳(Pulsed field gel electrophoresis ，PFGE)为代表的分子生物学分型方法日渐受到青睐，其原理为通过一定的方法，直接或间接反映病原体变异分化的本质即DNA 序列的改变，从而做到微观变化的宏观显示。
电泳结果通常是条带图谱。
该方法的发展成熟为监测控制细菌的流行提供了广阔的前景。
通过分型可以鉴定比较菌株是否一致， 对于细菌性传染病监测、传染源追踪、传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意义。
一、脉冲场凝胶电泳的原理PFGE 与常规电泳的不同之处在于，常规的电泳采用的是单一的均匀电场，DNA 分子经凝胶的分子筛作用由负极移向正极。
而PFGE 采用了两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，使DNA 分子的电泳方向随着电场的变化而改变。
正是因为电场方向的交替改变，才使大分子DNA 得以分离。
图l 是根据Carle 和Olson最初设计的正交场电泳装置(orth-ogona1field gel electrophoresis ，OFA-GE)绘制的PFGE 示意图。
A 、B 代表两个交替开启和关闭的电场。
当A 电场开启时，B 电场关闭，DNA 分子从A 电场的负极(A-)向正设(A+ )移动；当B 电场开启时，DNA 分子改变原来的运行方向，随B 电场由负极向正极移动。
这样，随着电场方向的交替变化DNA 分子 即呈“Z” 字形向前移动。
目前的理论和实验研究表明，当某一电场开启时，DNA 分子即顺着此电场的方向纵向拉长和伸展，以“蛇行”(reputation)的方式穿过凝胶孔。
如果电场方向改变 DNA 分子将必须先调转头来，才能沿着新的电场方向泳动。
这样，随着电场方向反复变化，伸展的DNA 分子必须相应地变化移动方向。
可以想象， 较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulse Field Gel Electrophoresis, PFGE），是一种通过交替改
变电场方向和大小等参数，使得大分子DNA在凝胶中得到更好的分离的电泳技术。
该技术
主要依靠电场对DNA分子的移动与定向拉伸，通过一系列的脉冲场控制形成脉冲态运动，
使DNA分子得到更广泛的电泳分离。
在经过凝胶电泳之后，得到的分离图谱呈现出一组带状分布的DNA分子，每条带都代
表着分子的大小。
DNA分子越大，迁移的速率就越慢，因此大的分子在凝胶上迁移的距离
要比小的分子短。
这个技术被广泛应用于基因编辑、基因检测和病原体的快速分型等领域。
实验中，将DNA分子高压加在凝胶中，通过影响电场的大小和方向，脉冲场凝胶电泳
可以将DNA分子拉伸成一系列不同长度的线条。
接下来应该是经过染色或者转移等方法，
对凝胶进行图像处理，得到DNA分子的带状图谱。
带状图谱中，每一条带代表一个不同的DNA分子长度，因此可以确定DNA的大小。
根据带的数量、大小和密度等参数，可以进一
步区分样品中不同的DNA分子。
需要注意的是，PFGE并不能很好地分离具有相同长度的DNA分子，因为它们将聚集成一个带状图。
但总的来说，PFGE是一种用于高分辨率DNA分离的强大工具，已被广泛用于研究多种生物学和医学问题，例如：身份鉴定、结构基因组学、基因突变分析等。
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脉冲场trophoresis ,PFGE)
用于分离大分子量DNA 片段的一种电泳方法。
PFGE 是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完 成分离大分子DNA。
影响PFGE的因素 琼脂糖凝胶浓度
浓度越高，移动速度越慢，适合分离低分子量DNA 浓度越低，移动速度越快，适合分离高分子量DNA 1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA片段 1.2–1.5%的琼脂糖浓度可以使片段更加紧密 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的DNA片段， 不过条带很弥散
注意事项
蠕动泵的流速：电泳过程中，控制好蠕动泵的流速， 一般控制在50-70左右，以免速度太快，使胶在溶液中 移动。
冷却泵的开启：冷却泵开启时，一定要把蠕动泵打开， 以避免冷却泵管道内的溶液因为过度制冷，凝结成冰 块而堵塞管道。
电泳结束后，应及时取出凝胶，进行染色等操作，以 避免因为时间太长，而造成条带的弥散。
条带变粗 ---减少上样量
条带拖尾或模糊---电场转换时间不适合，优化电 场转换时间、上样量太高，调整样品浓度
大片段DNA 不能有效分离---降低电压、延长电场 转换时间
条带弯曲---缓冲液缓冲能力下降，更换缓冲液、 上样时样品块被挤碎、泵速度太慢
当DNA分子变换方向的时间小于脉冲周期时,DNA 就可以 按其分子量大小分开
改变脉冲时间
分离不同大小DNA
电压
最常用的电压是6V/cm，低电压时，迁移率与电 压成正比，想分离大分子DNA时一般选用低电压 和延长脉冲时间
脉冲角度
随着角度的减小，较大的片段分离的更好，较小的片段分 离的效果降低。
可能遇到的问题以及解决方法
凝胶在缓冲液中漂浮---蠕动泵的速度太快或太慢， 请调到合适的速度。
缓冲液不流动或流速慢---检查冷却泵：当冷却泵制 冷时，如果蠕动泵没有开，会造成管道内结冰，导 致管道堵塞。
电泳条带扭曲---因为流速太低，导致制冷不充分， 或不均一 、缓冲液体积必须大于2.2 L
脉冲场凝胶电泳的原理 及相关注意事项
普通凝胶电泳
通常的琼脂糖凝胶电泳利用双链DNA 分子在电场作用下，在凝胶中的迁移率 不同而达到分离的目的。
当双链DNA 分子超过一定的大小以后， DNA 双螺旋的半径超过了凝胶的孔径， 在琼脂糖中的电泳速度会达到极限，此 时凝胶不能按照分子大小来筛分 DNA。
缓冲液和温度
温度越高，DNA移动速度越快，但是条带的 清晰度和分辨力明显下降。温度过高会导致 DNA带变形或解链。
最佳电泳温度是14 ℃
最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer，有时 也可以用1.0x的TAE buffer代替
脉冲时间
当电场方向发生改变, 大分子的DNA 便滞留在胶孔中, 直 至沿新的电场重新定向后, 才能继续向前移动,大分子DNA 重新定向需要的时间长