脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术用途
脉冲场凝胶电泳技术（Pulsed-Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一种用于分离和分析大分子DNA的技术。
它利用电场在凝胶中引起的不断变化的方向来分离DNA分子，适用于分析大片段DNA，如整个基因组或染色体。
PFGE技术在生物学和医学领域有着广泛的用途，包括但不限于以下几个方面：
1. 研究基因组结构：PFGE技术可以用于分析和研究细菌、真菌、植物和动物等生物的基因组结构，帮助科研人员了解基因组的大小、形态和结构。
2. 分子生物学研究：PFGE技术可以用于分析DNA的大小和构成，例如在基因克隆、DNA 指纹图谱分析、基因组映射等方面有着重要的应用。
3. 疾病研究：PFGE技术可以用于分析病原微生物（如细菌、真菌等）的基因组，帮助研究人员了解病原微生物的遗传特性、毒力因子等，对于疾病的预防、诊断和治疗有着重要的意义。
4. 分子流行病学：PFGE技术可以用于分析病原微生物的遗传特征，帮助研究人员追踪疾病的传播途径和流行病学特征，对于疾病的控制和预防有着重要的作用。
总的来说，PFGE技术在生物学、医学和疾病研究领域有着广泛的应用，可以帮助科研人员深入了解DNA的结构和功能，从而促进基础科学研究和临床医学的发展。
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作
pfge脉冲场凝胶电泳具体操作PFGE（Pulsed Field Gel Electrophoresis）是一种高分辨率的凝胶电泳技术，可用于分离和检测大分子量DNA片段。
该技术常用于研究基因组结构、遗传变异和DNA断裂等领域。
下面将详细介绍PFGE的具体操作步骤。
1. 准备DNA样品:a. 从细胞中提取DNA。
可以使用标准的DNA提取方法，如酚/氯仿法或商用DNA提取试剂盒。
b. 用酶切酶或限制酶对DNA进行切割。
选择使DNA在所需大小范围内切割的酶，以便获得所需的DNA片段。
2. 制备凝胶:a. 准备1% - 2% 的琼脂糖溶胶。
将所需琼脂糖加入TE缓冲液中，并在适当的温度下加热搅拌，直到完全溶解。
b. 将琼脂糖溶胶倒入制作凝胶的模具中。
在模具顶部放置梳子以制作凝胶槽，并确保梳子的位置水平。
c. 让凝胶固化。
根据琼脂糖溶胶中指定的温度和时间，将模具放入冰箱或培养箱中，使凝胶完全固化。
3. 负载和电泳样品:a. 准备DNA样品。
将所需比例的DNA标记物和DNA样品混合，并加入适量的加载缓冲液，如Bromophenol Blue。
b. 用吸管吸取混合物，并将其轻轻注入凝胶槽中的样品孔中。
确保尽量避免气泡进入凝胶槽。
c. 启动电泳。
电泳前，确保样品中有足够的时间固定在凝胶上。
启动电源，并将电流设置为所需的值。
4. 设置电泳条件:a. 选择适当的电泳缓冲液。
常用的电泳缓冲液包括TBE缓冲液（三硼酸钠缓冲液）和TAE缓冲液（乙醋酸/三乙酸片性缓冲液）。
b. 设置电泳条件，如电流密度，脉冲时间和频率等。
这些条件可以根据所研究的DNA分子量和所使用的电泳设备进行调整。
5. 进行电泳:a. 启动电泳设备，确保电泳条件设置正确，并在所需时间内运行电泳。
b. 当电泳结束时，关闭电源，并小心地取出凝胶，以免损坏样品。
6. 可选的染色和可视化:a. 将凝胶放入染色缓冲液中，如溴化乙锭溶液，使DNA可被视觉化。
b. 在染色缓冲液中搅拌凝胶，确保各个区域充分染色。
pfge原理
pfge原理PFGE原理是一种分子生物学技术，全称为脉冲场凝胶电泳（Pulsed-Field Gel Electrophoresis），它是一种分离和分析DNA片段的方法，可以将大片段的DNA分子从凝胶中分离出来，从而进行电泳分析。
1. 原理PFGE的原理在于凝胶中应用交错电场，使DNA的运动方向变化，从而使大分子量DNA可以被更好的分离。
首先，DNA被切成片段，并在凝胶中进行电泳分离。
PFGE所采用的凝胶是一种“交错”的凝胶，即在不同方向上阻碍电泳运动的纤维素。
在电场中，DNA分子因为其大小、形状和电荷密度不同而负载不同的电荷，向着凝胶的两个端点移动。
在PFGE过程中，电场方向会不断改变，这种改变可以使大分子量DNA分子在不同方向上进行运动。
一次分离过程通常持续16小时以上。
2. 应用PFGE技术是目前常用的DNA分子分离技术之一，其应用范围广泛，主要用于以下领域：（1）遗传学研究：PFGE技术可以帮助了解基因组结构和动态变化，尤其是在菌群的基因组研究中，PFGE技术具有重要作用。
（2）食品安全检测：PFGE技术可以用于食品安全检测，例如细菌的分离和鉴定，食品中微生物的种类、数量及分布等的研究。
（3）医学研究：PFGE技术在医学领域中有广泛应用，比如可以用来检测癌症等重大疾病，检测病原体和细菌的快速鉴定等。
3. 优势相较于常规的DNA电泳，PFGE技术有以下几点优势：（1）可以分离大分子量的DNA分子，比如细菌的染色体DNA。
（2）可以提高DNA分离的分辨率，从而更准确地分析DNA的结构和变异情况。
（3）PFGE的原理可以单独分离DNA分子，使处理比较麻烦的DNA成为可能，比如重复序列等。
总之，PFGE技术在现代生命科学中已经成为了不可或缺的基础技术之一。
通过PFGE技术，我们可以更好地理解细胞DNA的组成和结构，同时对食品和医学工作中的研究也有着巨大的帮助作用。
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为：细菌包埋于琼脂块中，用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切，酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要，所采用的内切酶常为寡切点酶（low frequency cleavagerestric-tionendoucleases），这种酶切后的片段少而大，适合于作PFGE电泳。
McCllelland等通过对细菌的PFGE电泳图谱的内切酶的选择研究发现，四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的，在他们所试验的16个细菌的染色体中，被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切，每100000bps中不到一次，这些酶的识别序列分别为：XbaⅠ（TCTAGA），SepⅠ（ACTAGT），AvrⅡ（CCTAGG）和NheⅠ（GCTAGC）。
同样地，在许多含G+C<45%的基因组，CCG和CGG更少。
这样用SmaⅠ（CCCGGGG）、R srⅡ（CGGWCGG）、NaeⅠ（GCCGGC）和SacⅡ（CCGCGG）进行酶切，对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察，可因不同研究者而出现较大差异，据此，Tenover等经过多年的研究提出了PFGE的解释标准：(1)相同（indistinguishable）：酶切图谱间有同样的条带数，且相应条带大小相同，流行病学上则认为相同，这种经PFGE证实的结果，用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
(2)紧密相关（closelyrelated）：PFGE试验中，其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改变，如点突变、插入或DNA缺失。
典型的情况下，这种变化可导致2～3条带的差异，当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。
(3)可能相关（possiblyrelated）：两个独立的基因情况所致的一致的差异，如出现了4～6条带差异，此时能用简单的插入或DNA缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。
脉冲场凝胶电泳分离技术
脉冲场凝胶电泳分离技术在生物学、医学、环境科学等领域广泛应用，它针对DNA、RNA和蛋白质等生物大分子的高分辨率分离和分析具有非常重要的意义。
一、的原理是在凝胶电泳基础上发展出来的。
它利用凝胶矩阵中各点的电阻率不同，即芯中高，表层低的特性，将生物大分子按大小和电荷在凝胶中进行分离。
基于两个国际单位制（SI）的物理量——电场强度和电流密度。
在其中电场强度指单位电量在两点间的电场强度，它的基本单位是伏特每米；电流密度指通过某一面积的电流值，它的基本单位是安培每平方米。
生物大分子在凝胶中进行电泳时，电场强度和电流密度的变化规律直接影响它们在凝胶中的迁移距离和选择性质。
二、的优缺点1.优点具有极高的分辨能力，在分离比较小的DNA片段方面具有明显的优势。
另外，它较为灵活，可以根据样本的特性和需求来设计实验方案。
此外，这种技术实验成本不高，实验条件相对简单。
2.缺点的缺点在于，进行实验需要逐级递增加强电场，涉及到的专业知识比较复杂，操作门槛较高。
另外，由于DNA迁移距离与其电荷量和大小成反比，因此在进行分离的过程中，需要选定相应的凝胶浓度和电场，以克服基于这些因素引起的迁移距离不均的问题。
三、的应用1.在DNA分离中的应用在DNA分离中应用比较广泛，可以用来鉴定遗传变异、克隆DNA、以及构建DNA指纹等。
对于基因测序中所需的较长的DNA片段，也可以进行分离。
2.在RNA分离中的应用也可以应用于RNA分离领域，在这一领域中，它可以用来鉴定表达的不同等。
3.在蛋白质分离中的应用除了在DNA和RNA分离中的应用，还可以应用于蛋白质的分离中。
在蛋白质分离中，这项技术使用较少，但仍然具有应用潜力，可用于鉴定蛋白质降解产物等。
总结：在生物技术领域具有非常重要的意义。
其高分辨率、灵活性等特性，使得它可以在不同的领域进行应用。
虽然技术门槛相对较高，但它的优点仍然是非常显著的。
我们期待，在后续的发展研究中，会变得更加成熟，更加高效，并且得到更加广泛的应用。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。
（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
脉冲场凝胶电泳的原理
条带变粗 ---减少上样量 条带拖尾或模糊---电场转换时间不适合，优化电 场转换时间、上样量太高，调整样品浓度 大片段DNA 不能有效分离---降低电压、延长电场 转换时间 条带弯曲---缓冲液缓冲能力下降，更换缓冲液、 上样时样品块被挤碎、泵速度太慢
脉冲时间
当电场方向发生改变, 大分子的DNA 便滞留在胶孔中, 直 至沿新的电场重新定向后, 才能继续向前移动,大分子DNA 重新定向需要的时间长 当DNA分子变换方向的时间小于脉冲周期时,DNA 就可 以按其分子量大小分开
改变脉冲时间
分离不同大小DNA
电压
最常用的电压是6V/cm，低电压时，迁移率与电 压成正比，想分离大分子DNA时一般选用低电压 和延长脉冲时间
1%的琼脂糖浓度最大可以分离3Mb的DNA片段 1.2–1.5%的琼脂糖浓度可以使片段更加紧密 0.5-0.9%的琼脂糖浓度可以分离片段更大的DNA片段， 不过条带很弥散
缓冲液和温度
温度越高，DNA移动速度越快，但是条带的 清晰度和分辨力明显下降。温度过高会导致 DNA带变形或解链。 最佳电泳温度是14 ℃ 最常用的电泳液是 0.5x的TBE buffer，有时 也可以用1.0x的TAE buffer代替
脉冲场凝胶电泳 (Pulsed Field Gel Electrophoresis ,PFGE)
用于分离大分子量DNA 片段的一种电泳方法。 PFGE 是通过脉冲电场方向、时间与电流大小交替改变完 成分离大分子DNA。
影响PFGE的因素
琼脂糖凝胶浓度
浓度越高，移动速度越慢，适合分离低分子量DNA 浓度越低，移动速度越快，适合分离高分子量DNA
脉冲场凝胶电泳(PFGE)
脉冲场凝胶电泳
报告人：吉尚雷 2013-03-13
一、原理
常规的电泳采用的是单一的均匀电 场，DNA分子经凝胶的分子筛作用由负 极移向正极。而脉冲场凝胶电泳(Pulse dfield gel electrophoresis，PFGE) 采用 了两个交变电场，即两个电场交替地 开启和关闭，使DNA分子的电泳方向随 着电场的变化而改变。电场方向的交 替改变使大分子DNA得以分离。
普通凝胶电 泳
PFGE
二、PFGE在分子生物学中的应用
在普通的凝胶电泳中，大于10kb的 DNA分子移动速度接近，很难分离形成足 以区分的条带。脉冲场凝胶电泳可以用来 分离大小从10kb到10Mb的DNA分子 。主 要用于基因组DNDR-II脉冲场电取出凝胶，放在电泳槽中 适当位置。调节脉冲场电泳参数，4V/cm、 脉冲时间1-40s, 14℃ 电泳18h，泵 70。
将电泳完的凝胶用EB染色20min， 清水漂洗20min，置凝胶成像系统 中检测
四、影响PFGE的因素
1.琼脂糖凝胶浓度
低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼 脂糖，30℃左右成胶，熔点是65℃。熔化 温度低于大多数双链DNA熔点。这种性质可 以从凝胶中回收天然形式的DNA
1 PFGE是公认的比较繁琐耗时的技术。一次电泳至少需 要两天时间。 2 电泳带型易受人为等多种因素的影响，需要较高的技 术水平。 3 不能同时优化胶的每个部分的条带分布。 4 不能确切地认为相同大小的条带就是相同的DNA片段。 5 一个酶切位点的变化可能引起不止一个条带的变化。 6 PFGE分型技术在大肠杆菌O157：H7等细菌的分子生 物学分析中得到了广泛的应用。但有些菌种用PFGE是 不可分的。研究人员发现对于有广泛基因重组现象的 细菌，PFGE并不是一个适宜的分子分型工具。
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脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理
脉冲场凝胶电泳（PFGE）的原理大致为:
细菌包埋于琼脂块中,用适当的内切酶在原位对整个细菌染色体进行酶切,酶切片段在特定的电泳系统中通过电场方向不断交替变换及合适的脉冲时间等条件下而得到良好的分离。
PFGE中内切酶的选用至关重要,所采用的内切酶常为寡切点酶(low frequency cleavage restriction endonucleases),这种酶切后的片段少而大,适合于作PFGE电泳。
McClelland等[8]通过对细菌的PFGE 电泳图谱的内切酶的选择研究发现,四核苷酸CTAG在许多GC含量>45%的细菌染色体中是很少见的,在他们所试验的16个细菌的染色体中,被1个或多个可识别CTAG位点的内切酶酶切,每100000ｂｐｓ中不到一次,这些酶的识别序列分别为:XbaI(TCTAGA), SepI(ACTAGT),AvrII(CCTAGG)和NheI(GCTAGC)。
同样地,在许多含
Ｇ+Ｃ<45%的基因组,CCG和CGG更少。
这样用SmaI(CCCGGG)、RsrII(CGGWCCG)、NaeI(GCCGGC)和SacII(CCGCGG)进行酶切,对产生平均超过100000bps片段是非常合适的。
对PFGE结果的观察,可因不同研究者而出现较大差异,据此,Tenover 等[6]经过多年的研究提出了PFGE的解释标准:(1)相同(indistinguishable):酶切图谱间有同样的条带数,且相应条带大小相同,流行病学上则认为相同,这种经PFGE证实的结果,用其它方法检测不可能显示实质性的差异。
(2)紧密相关(closely related): PFGE试验中,其它克隆株与暴发克隆株有一致的单一基因事件的改
变,如点突变、插入或ＤＮＡ缺失。
典型的情况下,这种变化可导致2～3条带的差异,当一些分离菌株被多次重复培养或自同一病人多次分离时可观察到这种现象。
(3)可能相关(possibly related):两个独立的基因情况所致的一致的差异,如出现了4～6条带差异,此时能用简单的插入或ＤＮＡ缺失或限制性位点的获得或缺失来解释。
这些菌株与暴发株间遗传基因不紧密相关,流行病学上也不大可能相关,在长于6个月时间及大范围的暴发中收集的菌株可出现这类情况。
(4)不相关(unrelated):1个分离菌株通过3个更多个独立的基因事件所致的一致的改变,其PFGE图谱与暴发克隆株样式不同,则可认为与暴发克隆株不相关(一般总有7个或更多个条带的差异)。
典型情况下,这一分离株常只有少于50%的良好的分离的片段出现在暴发株图谱样式中。