BIO-RAD脉冲场电泳介绍

﹡此后,随着PFGE技术的不断改进,现已具有分辨出高达10Mb级 DNA的能力。
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
– Cluster according to similarity of pattern
Dice (Opt:1.50%) (Tol 1.5%-1.5%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%]
PFGE-XbaI
PFGE-XbaI
80 100
.E2003002160 .E2003002977 .E2003002278 .E2003002247 .E2003002231 .E2003002306 .E2003002276 .E2003002366 .E2003002399 .E2003002778 .E2003002827 .E2003002828 .E2003003026 .E2003002033
（2）细胞壁裂解，蛋白的消化
制好的胶块，可以在1天内或4天中 进行后续处理
Proteinase K
胶块在细胞裂解液和蛋白酶K溶液中 处理
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
胶块的制备:
常规的DNA制备方法 得不到完整的大分子量 DNA,因为DNA大片段很 脆弱,容易因提取过程中 的机械作用如吸打、离心 等而导致DNA的断裂。
脉冲场电泳（PFGE）的原理 普通核酸电泳的应用：
1、分子克隆-PCR产物特异性的确认
2、RNA完整性的确认 （定量PCR的验证环节）
脉冲场电泳（PFGE）的原理
﹡脉冲场凝脉电泳 (Pulsed field gelelectrophoresis,PFGE),是近年 发展起来的一种重要的分离大分子量线性DNA分子的电泳技术。
脉冲场电泳（PFGE）的应用
PFGE具有独特的分离大片段DNA的能力, 是一种分析染色体DNA强有力的工具。目前 PFGE主要应用于染色体DNA的分离、微生物基 因分型、DNA辐射损伤修复、细胞凋亡、酵母人 工染色体电泳分析及单向电场泳难以分辨的DNA 图谱制作等研究中。
脉冲场电泳（PFGE）的应用——分子分型
TM554 TM99 TM557 TM5b TM376 TM562 TM571 TM122 TM122 TM122 TM122 TM122 TM361 TM40
脉冲网实验室使用BIO-RAD的脉冲场电泳系统分离菌株DNA，电泳完毕后凝胶用 EB染色，然后用BIO-RAD的分辨率更高的成像仪采集和处理图像，并制成TIFF 格式， 使用带数据共享工具的Fingerprinting 软件或BioNumeric软件进行分析。该模式成功地应 用于细菌性传染疾病的溯源及监控。
﹡普通的琼脂糖凝胶电泳分离DNA分子的上限是50 kb
﹡大于该极限的DNA分子,常规的琼脂糖凝胶便失去了其分子筛的作 用,导致电泳带型无法分辨，PFGE的发明正好解决了这一问题。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
﹡1984年, Schwartz和Cantor首次用此技术成功分离得到酿酒酵 母菌(Saccharomyces cerevisiae)细胞的16条完整染色体DNA。
Digest with Proteinase K, EDTA and detergent
Wash this solution out of the plug
Store in EDTA buffer until use These are usually stable for 3-4 months at 4癈
脉冲场电泳（PFGE）的原理
不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围
浓 度（%） 标 准(kb)
高强度(kb) 低熔点(kb) 低黏度低溶点(kb)
0.3
1~50
0.5
0.7~25
0.8
0.5~15
1.0
0.25~12
1.2
0.15~6
1.5
0.08~4
2.0
3.0
4.0
6.0
0.8~10 0.4~8 0.3~7 0.2~4 0.1~3
Blood Concentrate White Cells
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
（1） 细胞包被
Agarose
Cellular Protein
Cell Wall
DNA
所有的培养细胞用琼脂糖包被，避 免后续处理过程中DNA被剪切
琼脂糖和细胞的混合物注入制样模块 中， (1.5mm x 10mm x 5mm)，凝固 后，胶块可以从制样模块中取出。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
常用的核酸凝胶电泳有琼脂糖(Agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰 胺凝胶电泳（PAGE）。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2-50 kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1-1, 000 bp之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高 ，孔隙越小，其分辨能力就越强。
Mix cells with Low Melt agarose and harden in mold (be sure to use certified agarose when doing restriction digestions)
Digestion of cell walls using lysozyme, lyticase, chitinase, etc...
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
（3） DNA的酶切
16hr
Rare Cutting Restriction Enzyme
用不常用的限制性内切酶消化 DNA，产生15-20 条带，可以清 楚的鉴别亚型
（4）上样、电泳
(Side view of agarose
gel)
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
为了得到完整的大量DNA大片段,目前主要是采用低熔点琼脂糖(Lowmelting point agarose)包埋样品,再进行原位裂解和去蛋白处理从而释放DNA。
低熔点琼脂糖在这个过程中阻止了机械力对DNA大片段的剪切作用,因而细 胞裂解所释放的DNA大片段包埋在胶块中。制作好的样品插块可以在电泳时直接 插入加样孔中。
这种电泳技术促进了癌症研究、食品安全、公共健康、品质 控制和基因组作图的进步。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
普通核酸电泳
PFGE
BIO-RAD 脉冲场电泳的型号选择
Pattern Comparison
• BioNumerics Computer Software
– Create dendrograms
65
8.0
60~400
160
45
12.0
40~200
70
20
15.0
25~150
60
15
20.0
6~1004512源自脉冲场电泳（PFGE）的原理
在 凝 胶 电 泳 中 或 后 ， 加 入 溴 化 乙 锭 （ Ethidium bromide，EtBr）染料对核酸分子进行染色，然后放置 在紫外光下观察，可灵敏而快捷地检测出凝胶介质中 DNA的谱带部位，即使每条DNA带中仅含有0.05μg的 微量 DNA，也可以被清晰地检测出来。
Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium Typhimurium
项目 方法依据 方法举例
优点 缺点
表型分型
分子分型
表型特征
遗传特征
生物分型、血清分型、噬菌体分 型、耐药性分析
成熟可靠的数据库，作为初级分 型仍在常规使用
质粒分型、PFGE、核糖体分型 、基于PCR方法、基于测序方法 （MLST、VNTR、MLVA）
高分辨率，可重复性，易于标准 化及自动化
低分辨率、不可重复，并不适用 于所有病原体
脉冲场电泳（PFGE）的操作流程
（5） 染色，观察结果
DNA用EB 染色，在紫外下 观察结果。