CHEF-DR III 脉冲场电泳系统
CHEF Mapper XA脉冲场电泳操作规程
CHEF Mapper XA脉冲场电泳操作规程一、开机在等待凝胶凝固的期间，检查管路的连接状态，加入约2.2L的0.5X TBE缓冲液到电泳槽中。
打开主机电源开关，然后打开旁边的蠕动泵开关，最后打开冷凝泵开关。
二、制冷将蠕动泵流速调节到100，按冷凝泵上的“Set temp”键将温度设定到14°，按“Actual temp”显示实际温度。
三、放置凝胶1、将电泳凝胶的框架放入电泳槽中，白色螺丝固定到电泳槽的孔中。
2、将凝固好的凝胶从模具中卸下，连同黑色底板一起放到框架中。
3、确认液面完全超过胶面，确认挡胶条已经安装在电泳槽的下端。
四、电泳1.开机后，按“AUTO ALGORITHM”键。
2.屏幕上显示“Molecular Weight:Low”，此时通过面板上的数字键和字母键输入你所要分离的最小片段。
比如：220kb，输入220，“K-BASES”，回车键；3.随后，屏幕上显示“Molecular Weight:High”，此时输入你所要分离的最大片段，比如2200kb，输入2200，“K-BASES”，回车键；4.屏幕上显示“Calibration Factor”,按回车键；5.屏幕上显示“0.5X TBE,14℃,1%PFC agarose，按回车键；6.此时屏幕上会显示如下参数：6V/cm，Run Time=**.**(hr)，Included angel 120 ，将Run Time改为18-19h，其他按回车即可；7.屏幕上显示：Int. Sw. Tm=**.**s, Fin Sw. Tm=**.**s, Ramping Foctor:a=[linear],按回车键。
8.此时显示“A program is in memory”,按“START RUN”即开始运行。
五、清洗1、电泳结束后，关闭冷凝泵并取出凝胶进行染色和成像，将放水管插入右侧的接口中，把缓冲液放到一个容器中。
2、加入2L的双蒸水，将蠕动泵调节到100，冲洗电泳槽15分钟后将水放出。
脉冲场电泳仪参数
脉冲场电泳仪参数一、技术经济指标1、六角形电极的电泳槽，保证矢量电场的自由旋转，提供更高的分辨率、电泳速度和更精确的分离，对100bp-10Mb的DNA片段都能提供有效的分离。
2、自动演算：提供给用户一套程序用于优化实验参数。
只要输入待分离DNA片段的最小、最大长度，结合10个主要变量的确定，帮助使用者获得最理想的实验条件。
3、脉冲角度：可以在0-360°间自由选择脉冲角度，使用户可以在同一系统上实现大至染色体级、小至质粒DNA的有效分离。
4、时间转换梯度：有线性、非线性（凸形和凹形）两种脉冲时间梯度，非线性梯度可以提供更广泛的分离动态范围，使用户可以精确的确定分离片段的大小。
5、多状态功能：在一个Block中可以有15个电场矢量，每个电场矢量可以有自己的电压和转换时间，可有选择地对一定大小范围的片段进行更精细的分离，并且可以在同一次电泳中实现FIGE和CHEF两种技术。
6、二次脉冲功能：二次脉冲可加速DNA从琼脂糖凝胶中释放，从而有利于非常大的DNA片段的分离，并可提高分辨率。
7、技术应用：CHEF（钳式均衡电场）技术，产生均衡电场；PACE（程序自主控制电极）技术，根据片断大小的需要优化设定脉冲角度；FIGE（电场倒置）技术，为250KB以下小片断DNA提供快速分离；AFIGE（非对称场倒置）技术，精细分离小片断DNA，提高分辨率；以上技术的应用保证了科研人员在所有分子量范围内均能得到所最佳的线性分离。
8、性能指标：a. 电源输出：最高电压350V，0和0.6-9V/cm，0.1V/cm增量，连续可调b. 最大电流：0.5Ac. 延迟启动：最高72小时d. 电极调节能力：动态调节（反馈调整）±0.5％e. 程序储存：存储20个复杂实验程序，每个程序包含8个程序模块或99个简单程序f. 数据记录：键盘，条形码读取或RS-232接口g. 显示屏：2行×40字符/行，荧光显示h. 转换范围：50毫秒到18小时i. 转换角度：0-360°，0.5°增量j. 电泳时间：最高999小时/模块k. 脉冲中断设置：可以通过电压，频率，角度和持续时间设定二、设备产地：国外三、参考品牌及型号：无四、资质要求：4.1投标人需在中华人民共和国境内注册，持有合法有效的企业法人营业执照。
BIO-RAD脉冲场电泳介绍
﹡这一独具的高分辨力使PFGE的应用范围已涉及到几乎所有生 物基因组结构的研究。
脉冲场电泳（PFGE）的原理
PFGE的原理
PFGE的基本原理是对琼脂糖凝胶外加交变的脉冲电场,其方向 、时间和电流大小交替改变,每当电场方向发生改变时,大分子DNA 便滞留在凝胶孔内,直至沿新的电场轴重新定向后,才能继续向前泳 动,DNA分子越大,这种重新定向需要的时间就越长,当DNA分子改 变方向的时间小于脉冲时间时,DNA就可以按照其分子量大小分开, 经EB染色后在凝胶上出现按DNA大小排列的电泳带型。
一、PFGE在分子分型方面的应用 通过微生物分型可以鉴定菌株是否一致、比较它们的亲缘
关系,对于细菌性传染病的监测、传染源追踪、传播途径的调查 和识别有着非常重要的意义。
传统的微生物分型技术主要是基于表型特性分类,如生化分 型(biotyping)、血清学分型(serotyping)、耐药谱测定(antmi icrobial susceptibility testing)、噬菌体分型(bacterialphage typing) 等。由于微生物易受环境的影响,很容易改变其表达性状,使得表 型分类很不准确。
CHEF-DR III
脉冲场电泳系统的配件
脉冲场电泳（PFGE）的实验流程
Cultured Cells
Unicellular Organisms
Harvest Cells
Tissues
Dissociate
Wash Cell Suspension
Determine Cell Concentration Resuspend to needed Concentration
质粒DNA的提取纯化与电泳检测
法、羧基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放
法、酸酚法等。
1 .碱裂解法提取质粒DNA
1.1原理
共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓
扑学上的差异来分离它们。
在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线
性的DNA双螺旋结构解开而被变性，共价闭合
接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60μg/ml Amp抗生素
的LB 液体培养基
37℃摇培过夜（10~12h）12000rpm,
3min
弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。
加100μl Ⅰ液，涡旋震荡，充分混匀
配制适量的Ⅱ液
加200μl Ⅱ液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜），
电泳介质相同（电泳液和凝胶）：
• 分子在电场中迁移的速度主要取决于
分子本身的大小和形状。
• 形状相似的分子的迁移速度主要与分
子量相关: 分子量越大，移动越慢。
凝胶板
（二）琼脂糖凝胶电泳介绍
琼脂糖:
是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物
琼脂中提取而来。
琼脂糖凝胶:
琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点
电泳缓冲液的组成。
5.溴化乙锭染料
Biblioteka EB:溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐
Ethidium Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基
对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫
外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的
射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。
离子交换层析法
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
青黄散治疗骨髓增生异常综合征DNA磷硫酰化探析
青黄散治疗骨髓增生异常综合征DNA磷硫酰化探析张姗姗;全日城;杨晓红;许勇钢;胡晓梅;刘锋;麻柔【摘要】目的:研究硫化砷制剂青黄散对骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndromes,MDS)患者DNA双链结构的影响,硫元素是否可加入DNA骨架,是否有DNA结构的硫酰化修饰.方法:以持续服用青黄散6个月以上并有血液学改善的MDS患者骨髓DNA样本10例,以琼脂糖包埋,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测骨髓细胞DNA降解表型.利用BIO-RAD CHEF-DRⅢSystem脉冲电泳进行分析.结果:经过硫修饰后DNA构象发生变化,这种硫修饰结构对电泳过程阳极积累的Tris 过酸衍生物敏感而遭到位点特异性攻击,引发DNA的双链切割反应出现DNA降解现象.电泳后标本DNA结构完好,在Tris缓冲液下未出现DNA降解现象.结论:青黄散治疗有效的患者骨髓细胞DNA骨架中没有磷硫酰化修饰现象,说明青黄散疗效机制不通过硫修饰系统.【期刊名称】《中国中医基础医学杂志》【年(卷),期】2015(021)010【总页数】2页(P1278-1279)【关键词】骨髓增生异常综合征;青黄散;DNA磷硫酰化【作者】张姗姗;全日城;杨晓红;许勇钢;胡晓梅;刘锋;麻柔【作者单位】中国中医科学院西苑医院血液科,北京 100091;中国中医科学院西苑医院血液科,北京 100091;中国中医科学院西苑医院血液科,北京 100091;中国中医科学院西苑医院血液科,北京 100091;中国中医科学院西苑医院血液科,北京100091;中国中医科学院西苑医院血液科,北京 100091;中国中医科学院西苑医院血液科,北京 100091【正文语种】中文【中图分类】R285.6青黄散是一种硫化砷制剂，对血液恶性肿瘤细胞表现出抑制、诱导凋亡、去甲基化作用。
本文主要研究青黄散对MDS患者DNA双链结构是否有影响，硫元素能否加入DNA骨架，有无造成DNA结构的硫酰化修饰。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳实验流程
脉冲场凝胶电泳实验流程一、准备样品1. 琼脂糖包埋的样品常用的DNA提取方法不能得到完整的大分子量DNA。
大分子量DNA很脆弱，在制备过程中容易因移液等操作造成机械剪切。
将完整细胞包埋入琼脂糖后再进行裂解，去除蛋白的操作，可防止大分子量DNA的断裂。
琼脂糖块包埋的DNA可以避免被机械剪切，并且是一种简单的操作方法。
处理过的包埋有DNA的琼脂糖块可以直接放入琼脂糖凝胶的点样孔。
在将细胞包埋入琼脂糖之前要先确定细胞浓度，尽管吸光度很常用，但是并不可靠。
单位吸光度对应的细胞浓度会因菌株不同或培养基不同而有差异。
这会影响琼脂糖块中DNA的含量，导致上样量过大或不足。
不论细菌、真菌还是哺乳动物细胞，使用血球计数板均可得到准确和高重复性的细胞浓度。
Bio-Rad提供一次性的样品模具（货号：170-3713）。
每个模具可制备50个10 x 5 x 1.5 mm的琼脂糖胶块。
样品制备过程中的酶可以快速有效的扩散进入胶块，用Bio-Rad标准梳子制胶，胶块不需要修剪就可直接放入点样孔。
2. 液体样品小于200kb的DNA片断可以不用琼脂糖包埋，可直接以液体形式加入点样孔。
当操作的DNA大于50kb时，必须用大开口的吸头。
如果只电泳液体样品，使用厚度0.75 mm的梳子可以获得更锐利的条带和更高的分辨率。
3. 制备琼脂糖包埋的哺乳动物DNA该方法中用到的缓冲液，酶和琼脂糖均包含于试剂盒CHEF Mammalian Genomic DNA Plug Kit （货号：170-3591）。
1)将细胞悬浮于等渗盐溶液或不含血清的培养基中并置于冰上。
用血球计数板对细胞计数，每毫升琼脂糖块需要5 x 107个细胞，每个10 x 5 x 1.5 mm的样品块需要0.1 mL琼脂糖。
2)准备2% CleanCut™琼脂糖（货号：170-3594），用微波炉融化并置于50 °C水浴。
3)1000g、4 °C离心细胞悬液5分钟，用琼脂糖块一半体积的细胞悬浮缓冲液（10 mM Tris, pH 7.2,20 mM NaCl, 50 mM EDTA）重悬细胞并置于50 °C水浴。
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CDC、CIQ定牌采购产品。 • 脉冲网介绍：1996年美国CDC系统和公共卫生实 验室合作，以Bio-Rad公司的脉冲场电泳系统作 为平台，创建了PulseNet（脉冲网）。PulseNet 的成员全部采用标准的设备、标准的电泳程序和 标准的样品制备方法，构建出从病人或食物中分 离的病原细菌的PFGE“指纹图谱”，进行病原菌 的分型鉴定。 • 目前中国的PulseNet包括中国CDC流行病所的 PulseNet和食品安全所的FoodNet两个功能单位。
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脉冲场电泳的应用
PFGE 技术在以下方面有广泛的应用 : 癌症研究, 应用脉冲场技术研究放、化疗的效果和细 胞程序性死亡的监测 食品安全和公共卫生, 细菌和真菌的传播可以通过脉 冲场技术来追踪 质量控制，啤酒厂、酒厂等利用酵母发酵的企业的质 量控制 基因做图，包括人类等许多生物的图谱，以及染色体 重排的研究。
方法的 前景。通 对 追踪、 于细菌性 发 传过 展成熟 播途径 分型可以 传 染病 为监测 调查 监测 鉴 和、 控制 定比 识别 传染源 细 较 等暴 菌的流行提供了广 菌株是否一致， 发调查有着非常重要的意 阔的 义。
• PFGE是一种非常有效的分子分型方法。在国外被广
泛应用于很多菌种的分子流行病学研究中。 • 1、研究菌株之间的遗传差异。 • 2、细菌分型还能对病人的诊断和治疗提供线索 • 3、用于抗生素敏感株和多重耐药菌株的分子分型， 如耐苯唑西林的金黄色葡萄球菌和耐甲氧苯青霉素金 黄色葡萄球菌(MRSA)。 • 4、对生活环境中分离的菌株和病人中分离菌株进行 相关性分析。 • 5、PFGE还可用于其他领域，如百日咳抗原性变异和 PFGE的相关性
CHEF-DR III 脉冲场电泳系统
仪器的外观如图所示：
仪器组成： 主机、电泳槽、循环泵和冷却器 。
CHEF-DR III 脉冲场电泳系统
• 自动化
能召回前一次分离条件，并把它作为默认的实验条件 ■能召回当前电泳条件和电泳程序，如果系统因电泳仪故障而 中断，能自动重新启动电泳 • 用户化 ■指导手册提供大量不同分离范围下的电泳条件样例 • 应用灵活 ■能在 90-120º 之间的任意角度编程，可分离 100 bp -10 Mb范 围内的 DNA 分子 ■可选择特定 DNA 分离范围的最佳电压梯度、转换时间及角度 ■可编程 3 个连续执行的电泳模块
在细菌中的应用
光学系统
细菌的变异分化的本质即DNA序列的改变，脉 冲场电泳发展成熟，是监测控制细菌的流行变异的 主要研究手段。 通过分型可以鉴定比较菌株是否一致，对于细 菌性传染病监测、细菌耐药性检测、传染源追踪、 传播途径调查和识别等暴发调查有着非常重要的意 义。 对于细菌耐药性研究，可以通过脉冲场凝胶电 泳技术对细菌进行基因型分型，结合血清学试验和 药物敏感试验进行分析。
BIO-RAD
CHEF-DR III 脉冲场电泳系统
2014年12月15日星期一
脉冲场电泳原理
在琼脂糖凝胶上外加交变的脉冲电场， 其方向、时间和电流大小交替改变。
每当电场方向发生改变时，大分子 DNA便滞留在凝胶孔内，直至沿新的方 向重新定向后，才能继续向前涌动。
Bio-Rad以及脉冲网
• Bio-Rad拥有脉冲场电泳的专利，是中国各级
脉冲场电泳在细菌耐药性中的应用实例
鸡源沙门菌的耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究 • 16株沙门菌经Xba I酶切，PFGE后，每个菌株产生10条～15条电 泳条带，大小在20 kb～1 200kb之间：
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脉冲场电泳在细菌耐药性中的应用实例
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禽源阿贡纳沙门氏菌耐药性及脉冲场凝胶电泳分型研究：
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ