脉冲场凝胶电泳实验流程
大肠杆菌、沙门氏菌和志贺杆菌PFGE标准操作
1、 确保电泳槽是水平的。如果不水平，调整槽底部的旋钮。 注：不要触碰电极。 2、 加入 2-2.2L 0.5×TBE,关上盖子。 3、 打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约 1L/分钟）和 缓冲液在管道中正常循环。
4、 打开冷凝机， 确保预设温度在 14℃ （缓冲液达到该温度通常约需要 20 分钟） 。 5、 打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶， 小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。 6、 设置电泳参数。 （1）沙门菌属以 XbaⅠ或 AvrⅡ（BlnⅠ）酶切，电泳条件相同。 CHEF Mapper: Auto Algorithm 30kb ——low MW（最小分子量） 700kb ——high MW（最大分子量） 按“enter”选择程度默认值 run time（电泳时间）改为 18-19h （默认值： initial switch time （初始转换时间） =2.16s； final switch time（终末转换时间）=63.8s） CHEF DR-Ⅲ： Initial switch time: 2.2s Final switch time: 63.8s Voltage: 6v Included Angle: 120° Run time：18-19h （2） 大肠杆菌 O157 和宋内志贺菌 XbaⅠ或 AvrⅡ （BlnⅠ） 酶切， 电泳条件相同。 CHEF Mapper: Auto Algorithm 30kb ——low MW（最小分子量） 600kb ——high MW（最大分子量） 按“enter”选择程度默认值 run time（电泳时间）改为 18-19h （默认值： initial switch time （初始转换时间） =2.16s； final switch time（终末转换时间）=54.17s） CHEF DR-Ⅲ：
PFGE实验的标准流程
大肠杆菌0157、沙门菌和痢疾杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的胰化大豆琼脂（TSA-SB）平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养14-18小时；用同一个接种针/环,穿刺或接种于小螺帽管中的TSA、HIA或相似培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。
同时接种标准株H9812。
第一天步骤1 细菌的包埋1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配方见附件）制备1%Seakem Gold:1%SDS琼脂糖.以配置25ml体积为例说明,方法如下:1)准确称取0.25g Seakem Gold agarose,放入250ml的蓝盖瓶中.2)加入22.5mlTE缓冲液,轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开.3)微松盖瓶,将玻璃瓶放入微波炉内搞活加热30秒,取出轻柔摇荡,再次加热30秒,重复操作直至琼脂彻底溶解(无颗粒物、悬浮物、透光均一，无明显异常折光，无气泡)4)将溶解的Seakem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml,置于56℃水浴箱备用.3、在Falcon2054管(或其他相当的管)上标记样品名称和空白对照;在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称.4、在Falcon2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB(配方见附件).注:使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同.5、用CSB湿润棉签，从培养皿上刮去适量细菌，均与悬浊于CSB中。
通过加入CSB稀释或增加菌量提高浓度，调整细胞悬液浓度至指定范围。
1）用比浊仪（bioMerieux Vitek colorimeter）测其浓度,并调整浓度至4.0-4.5麦氏单位.2）用分光光度计时,在610nm波长吸光度应在1.3-1.4.3）Dade Microscan Turbidity Meter:0.48-0.52(以Falcon2054管测量) 0.68-0.72(以Falcon2057管测量)注:在 4.0-4.5该范围内细菌的浓度都可得到较满意的实验结果,但过大的浓度差距会造成同一块胶上的条带亮度差异,影响条带的识别.6、取400ul细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中,置于37℃水浴中孵育5分钟.将剩余的细菌悬浊液置于冰上知道胶块制备完毕.7、从水浴箱中取出微量离心管,没管加入20ul蛋白酶K(储存液浓度20mg/ml)混匀,使其终浓度为0.5 mg/ml,蛋白酶K置于冰上备用.8、加入400ul的1%Seakem Gold:1%SDS到上述装有400ul细菌悬液的微量离心管内,用枪头轻轻混匀,避免有气泡产生.(此时1%Seakem Gold:1%SDS需置于56℃水浴中)9、迅速将混合物加入模具,避免气泡产生,在室温下凝固10-15分钟.为节省时间也可以在4℃下凝固5分钟.10、记录好模具内对应样品的名称。
凝胶电泳制胶
凝胶电泳制胶凝胶电泳制胶是一种常用的实验方法，用于分离和检测DNA、RNA或蛋白质等生物分子。
本文将介绍凝胶电泳制胶的原理、步骤和应用。
一、原理凝胶电泳制胶主要基于凝胶的特性。
凝胶是一种高分子物质，可以形成三维网络结构，使分子在其内部进行分离。
常用的凝胶材料有聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺复合凝胶等。
在凝胶电泳制胶过程中，首先将凝胶原液均匀地注入制胶模具中，然后在模具两侧固定导电板，使之与电源相连。
接着，待凝胶完全凝固后，取下模具，即得到凝胶板。
二、步骤凝胶电泳制胶的步骤如下：1. 准备制胶模具：选择适当的模具尺寸和形状，常见的有平板模和斜板模。
清洗模具并涂抹硅油，以便取出凝胶。
2. 制备凝胶原液：根据实验需求选择适当的凝胶材料，如聚丙烯酰胺凝胶。
根据所需凝胶浓度，称取凝胶原液和缓冲液，混合均匀。
3. 注入凝胶原液：将凝胶原液缓慢均匀地注入制胶模具中，注意不要产生气泡。
4. 固化凝胶：待凝胶原液完全凝固后，取下制胶模具。
可将凝胶板浸泡在缓冲液中，以去除残留的离子。
5. 凝胶电泳操作：将待测样品加入凝胶槽中的样品孔，接通电源进行电泳。
根据需要选择合适的电压和时间。
6. 凝胶染色和观察：电泳结束后，可以通过染色方法对分离的分子进行染色，如乙溴化乙锭染色。
然后使用透射式或反射式凝胶电泳成像仪观察和记录结果。
三、应用凝胶电泳制胶广泛应用于生物学、分子生物学、遗传学等领域，常见的应用有：1. DNA分离和检测：凝胶电泳制胶可用于分离不同长度的DNA片段，并通过染色或探针杂交等方法检测目标DNA。
2. RNA分析：通过凝胶电泳制胶，可以分离和检测不同长度的RNA 分子，用于研究基因表达和调控等方面。
3. 蛋白质分离和鉴定：凝胶电泳制胶可用于分离和检测不同大小和电荷的蛋白质，常用于蛋白质组学研究和蛋白质鉴定。
4. 分子标记和DNA测序：凝胶电泳制胶可用于分离和检测DNA分子标记，如DNA大小标记和DNA测序。
202X年脉冲场凝胶电泳(1)
2) 噬菌体载体DNA的分离
纯净病毒颗粒 病毒载体DNA
M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法
第十二页，共三十八页。
二、RNA的分离与纯化
1. 制备RNA的关键—防止内外源RNase的作用
1) RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围; 抗高温严寒 (0~65℃均具活性）；抗变性剂
单子叶植物 151（玉米）~182kb（浮萍） 藻类 132（裸藻）~191kb（衣藻）
第八页，共三十八页。
1) DNA分离纯化过程
破碎细胞 + DNA抽提液(EDTA、去污剂、还原剂) 65℃温育
20’
冰浴冷却 离心去细胞碎片 苯酚抽提法①
CsCl密度梯度离心②
1) 苯酚抽提法 上清液 缓冲液用水饱和苯酚抽提2~3次 上层液相用氯仿抽 至界面无蛋白变性物 上层液相用两倍体积冷乙醇沉淀 沉 淀物用70%冷乙醇洗涤,干燥 溶于缓冲液 加入RNAase处理 除去RNA 苯酚氯仿抽提 沉淀干燥
2) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶; 竖式/聚丙烯酰胺凝胶
3) 两种方法比较：分离效果和分离范围; 操作难易
2. 用途
琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规(chángguī)分析；聚丙烯酰胺凝胶常 用于小分子核酸分析。
3. 凝胶电泳的一般程序
制胶 点样 电泳 染色 观察
二、DNA电泳
1. DNA分子种类
288 kb
痘病毒
196 kb
质体 几~100以上kb
线粒体
藻类 线状
15kb
酵母 环状
19~78 kb
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%Brij58；0.2% 脱氧胆酸盐(Deoxycholate；0.5%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosyl。
（生物秀实验频道 ）4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
脉冲场凝胶电泳.
脉冲场凝胶电泳(PFGE实验原理、操作步骤和注意事项【实验原理】大分子DNA(一般长度超过20kb ，在某些情况下，超过40kb 在电场作用下通过孔径小于分子大小的凝胶时，将会改变无规卷曲的构象，沿电场方向伸直，与电场平行从而才能通过凝胶。
此时，大分子通过凝胶的方式相同，迁移率无差别(也称“极限迁移率”，不能分离。
脉冲场凝胶电泳技术解决了这一难题，它应用于分离纯化大小在10～2000kb 之间的DNA 片段。
这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的，DNA 分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间显著地依赖于分子大小，DNA 越大，这种构象改变需要的时间越长，重新定向的时间也越长，于是在每个脉冲时间内可用于新方向泳动的时间越少，因而在凝胶中移动越慢。
反之，较小的DNA 移动较快，于是不同大小的分子被成功分离。
在许多实用的PFGE 方法中，倒转电场凝胶电泳是最简单最常用的方法(FIGE。
通过把一个在不同电场方向有不同脉冲方式的脉冲电场加在样品上，倒转电场凝胶电泳(FIGE设备能把大小范围在10～2000kb 的DNA 片段分开。
FIGE 也可通过重新确定一个对准完全固定好角度的电场，这样会进一步扩展其分离极限达到10Mb 。
【仪器、材料与试剂】1. 制备DNA 样品所需材料1TEN 缓冲液(0.1mol/LTris，pH7.5；0.15mol/LNaCl；0.1mol/LEDTA。
2Seaplaque 琼脂糖(EC 缓冲液中浓度为2%。
3EC 缓冲液(6mol/LTris，pH7.5；lmol/L NaCl；0.5%4ESP 缓冲液(0.5mol/L EDTA，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/mL 蛋白酶K 。
5 溶葡萄球菌素(5mg/mL。
6RNase(10mg/mL。
7 胶模(由常规琼脂糖凝胶制得或购买成品。
8 苯甲基横酰氟(PMSF(17.4mg/mL 于乙醇中。
90.5μg/mL 溴化乙锭2. 分离、纯化大的DNA 片段所需材料1 紫外递质。
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳
脉冲场凝胶电泳（Pulsed Field Gel Electrophoresis，PFGE）是一
种常用于分析测定大分子量DNA分子种类、外源DNA同源度、DNA长度等
实验的灵敏度相当高的一种电泳技术。
该技术是利用 DNA 分子在脉冲场
条件下的电泳运动，将不同类型的 DNA 集合体根据其分子质量分离而得
到细菌的 DNA 指纹图谱，从而用于基因检测、基因定位、系统发育研究、菌种识别、菌群分析、植物起源及食品安全检测等领域。
其实验原理是在
原电泳的基础上，增加了两个梯度磁场，形成脉冲场条件下，DNA 分子会
从均匀电荷有序分布转变为非均匀电荷分布，在脉冲场条件下，它会产生
不均匀向偏冲，从而实现对 DNA 集合体的分离，再加上同时对 DNA 分子
进行大量的微量操纵，有效的分离了DNA分子，使它们能够产生端粒酶消
化片段，最终可以经过比较求得大分子量DNA分子种类，外源DNA同源度、DNA长度等实验结果。
鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳实验步骤
鲍曼不动杆菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序生物安全警告：所操作菌为条件致病菌，请按二级生物安全水平操作，转移和操作活菌时更要注意。
处理大量菌株，请在生物安全柜中进行。
以正确方式对接触培养物的塑料制品和玻璃制品进行消毒或丢弃。
开始操作之前，请阅读所有指导。
把所有接触过细胞悬液或凝胶块的塑料制品、玻璃制品、吸管、小铲等当作污染材料，按照实验室的生物要求丢弃或消毒。
可重复使用的制胶模具须在清洗前消毒；可丢弃的制胶模具及胶带和用来把凝胶块从样品孔中推出的小片，应该用10%漂白剂消毒30分钟以上，然后清洗和重复使用。
提前准备从检测培养基上挑取单菌落，接种于营养琼脂平板（或相当的培养基）上培养；用同一个接种针/环，穿刺或接种于小螺帽管中半固体培养基，以保证必要时重复检测同一个克隆。
37℃培养14-18小时。
第一天1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。
2、用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%Seakem Gold：1%SDS琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下：1）准确称取0.25g SeaKem Gold agarose, 放入250ml的蓝色瓶内。
2）加入22.5ml TE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。
3）微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。
4）将溶解的SeaKem Gold agarose放入56℃（55-60℃均可）水浴箱内至少15分钟，再加入预热到56℃的10%SDS溶液2.5ml，置于56℃水浴箱备用。
3、在Falcon 2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml微量离心管上标记好对应样品的名称。
4、在Falcon 2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液CSB（配制方法见附件）。
注：使用测定细菌浓度的容器不同加入CSB的量也不同。