羧肽酶作用机理
羧肽酶A
7. 与锌离子配位 的水在Glu270的 帮助下进行质子 转移，电离为金 属离子键合的羟 基
＋
靠近
2.底物的疏水残基 落入疏水口袋中
3.底物肽 键的羰基 与锌离子 配位
5.由于锌离子和 精氨酸正电荷的 作用，肽键羰基 被极化和伸长， 使羰基的碳原子 1.多肽链进入活性部位， Arg145的侧链移动与带 呈正电性 负电的羧基端生成盐键
催化机理
Tyr248的羟基给予被裂 开的肽键的-NH一个质 子
羟基亲核进 攻羰基碳原 子，肽键断 裂
由于谷氨酸羰基端负电荷的静电 斥力与产物羧基端负电荷的静电 斥力，产物被驱出活性部位。
锌离子的作用
• 被裂解的肽键的羰基指向锌离子，锌离子起吸电 子的作用，使C=O键比正常的更为极化，使羰基 C原子更易接受亲核进攻 • 锌离子处在非极性环境促进了诱导偶极子的产生， 增加了它的有效电荷 • Glu270的负电荷的逼近也对羰基上产生一个大 的偶极子做出了贡献。 • 从而羧肽酶A诱导底物上的电子应变以加速催化。
• 存在于哺乳动物的胰脏 • 存在于牛胰脏的羧肽酶A为单一的多肽链，约有300个 氨基酸残基，分子量为34.5kDa • 每个酶分子含有一个 • 其前体为以亚基双聚体或三聚体形式存在的羧肽酶原A。 在胰蛋白酶的激活下释放出大约60个氨基酸残基的N末端裂解物成为羧肽酶A。
羧肽酶A的活性中心
羧肽酶A的活性中心
羧肽酶A
应化1003班 杨杰 李开成 庄原 刘漫
氨肽酶
肽链端解酶
肽 酶
肽链内切酶
羧肽酶A：水解由芳香族和中性脂肪族氨基酸形 成的羧基末端。比如酪氨酸，苯丙氨 酸，丙氨酸等。 羧肽酶
羧肽酶B：主要水解碱性氨基酸形成的羧基末端
。。。
羧肽酶A的特性及应用
羧肽酶A的特性及应用羧肽酶A（Carboxypeptidase A）是一种具有羧基末端肽酶活性的酶。
它能够识别肽链的C-末端，将C-末端的氨基酸一个一个地从肽链上切割下来，使肽链逐渐缩短。
羧肽酶A在生物体内广泛存在，包括人体、动物体以及微生物体内。
它参与了多种生物学过程，例如：消化系统中的食物分解、蛋白质合成和代谢等。
另外，羧肽酶A还能被广泛应用于工业生产、医学诊断和药物研究等领域。
首先，羧肽酶A在消化系统中起着重要的作用。
它存在于人体胃液和胰液中，能够降解蛋白质和多肽，将多肽分解为短肽或氨基酸。
这个过程是消化系统中蛋白质消化和吸收的关键步骤。
羧肽酶A能够将肽链中的末端氨基酸一个一个地切割下来，使得其中的氨基酸可以被肠道细胞吸收并转运到其他组织中，供能或者合成其他生物分子使用。
因此，羧肽酶A对于人体正常消化和吸收是非常重要的。
其次，羧肽酶A在工业生产中应用广泛。
由于其特殊的肽链切割能力，它能够用来制备生物活性肽和药物。
例如，在生产抗生素的过程中，羧肽酶A可以用来切割蛋白质链中的特定肽段，得到具有生物活性的药物分子。
此外，羧肽酶A 还可以用于食品工业中，用于加工肉制品和奶制品等，改善其口感和质地。
通过使用羧肽酶A，可以使肉类中的蛋白质分解为更小的肽段，使得肉质更嫩滑，更易消化。
第三，羧肽酶A在医学诊断中具有重要的应用价值。
由于其对肽链末端的特异性切割能力，羧肽酶A可以用来分析和检测多肽和蛋白质的结构和功能。
例如，在蛋白质组学研究中，羧肽酶A可以用来鉴定复杂混合样品中的蛋白质，并确定其序列和修饰。
此外，羧肽酶A还可以用于药物代谢动力学研究，通过分析药物中残留的肽段，了解药物在体内的代谢途径和代谢产物，为药物的研发和治疗提供科学依据。
最后，羧肽酶A还可以应用于蛋白质工程和药物研究中。
通过对羧肽酶A的结构和功能的研究，可以设计和合成新型的酶活性位点和底物结合位点，从而创造具有特殊功能和活性的蛋白质。
此外，羧肽酶A还可以用来合成多肽药物和蛋白质药物的前体，为药物的研发和生产提供技术支持。
羧肽酶研究进展
羧肽酶研究进展摘要:羧肽酶(Carboxypeptidase)是一类可水解肽链C末端氨基酸残基的蛋白酶,广泛存在于高等植物、动物组织及真菌中,主要分为丝氨酸羧肽酶、金属羧肽酶和半胱氨酸羧肽酶3个亚类。
本文综述了羧肽酶的研究进展,主要包括羧肽酶的应用、性质、来源分布、克隆表达及研究意义,并对其研究前景进行了展望。
关键词:羧肽酶;应用;来源分布;性质羧肽酶是一种专一性地从肽链的C端逐个降解、释放游离氨基酸的一类肽链外切酶。
在动物、植物的组织器官中,羧肽酶发挥着重要的生理功能,如胰腺羧肽酶A和B可用于消化食物,羧肽酶M(CPM)选择性地参与肽类激素的加工,羧肽酶D(CPD)和羧肽酶N(CP N)参与肽和蛋白质加工等。
如表1所示,羧肽酶广泛应用于医药、食品等工业领域。
在医药领域,由于羧肽酶广泛参与机体的生化反应,可通过体内羧肽酶的检测达到诊断和治疗疾病的目的;此外,在医药上还可用于体内不良物质(毒素等)的降解。
在食品工业,可用于制备高F值寡肽、食品和饲料中赭曲霉素的去除、用作脱苦味剂等。
在生物技术领域,羧肽酶可用于多肽的合成及多肽氨基酸序列测定,也可作为模式酶,对其他酶的研究提供帮助。
动物来源的羧肽酶主要存在于猪、牛等的胰脏中,如羧肽酶A/B,其数量非常有限、价格昂贵、导致其应用受到限制;微生物来源的羧肽酶存在于酵母、曲霉等真菌的液泡中,具有广阔的应用前景。
因此,借助基因工程策略采用微生物为宿主大量生产重组羧肽酶,有望克服羧肽酶生产过程所遇到的动植物原料来源限制等限制,进一步降低生产成本、提高产品质量、深化酶学性质研究、扩展应用范围。
本文综述了羧肽酶的种类、特点以及羧肽酶基因工程表达策略,主要包括羧肽酶的性质、来源分布、克隆表达,并对其研究前景和热点进行了展望。
关键字:羧肽酶;应用;来源分布;性质羧肽酶的种类及其特点根据羧肽酶活性中心含有丝氨酸残基、金属离子和半胱氨酸残基的不同,将羧肽酶分,将羧肽酶分为丝氨酸羧肽酶(EC3.4.16.-)、金属羧肽酶(EC3.4.17.-)和半胱氨酸羧肽酶(EC3.4.18.-)。
cpb酶切原理
CPB酶，即羧肽酶B，是一种能够从肽链的C端逐个降解并释放游离氨基酸的肽链外切酶。
CPB酶的工作原理是通过特异性地识别肽链的C端氨基酸残基，并催化水解该残基与相邻氨基酸之间的肽键，从而释放出一个游离氨基酸分子。
这个过程会持续进行，直到整个肽链被降解为单个氨基酸或短肽链。
在实际应用中，CPB酶常用于生物化学和分子生物学实验，尤其是在蛋白质分析和修饰研究中。
例如，在抗体电荷异构体的研究中，CPB酶可以用来确定赖氨酸对碱性异构体的贡献。
通过酶切反应，可以观察到由于赖氨酸修饰导致的电荷变化，这有助于研究者了解蛋白质的结构和功能。
总的来说，CPB酶是一种重要的工具酶，它通过特异性地切割肽链的C端氨基酸，帮助科学家研究蛋白质的结构和功能，以及在生物体内的作用机制。
羧肽酶法原理
羧肽酶法原理嘿，朋友们！今天咱来聊聊羧肽酶法原理呀！这羧肽酶啊，就像是个神奇的小助手，专门在蛋白质的世界里搞事情呢！你看啊，蛋白质就像一条长长的链子，上面有好多不同的“小珠子”，也就是氨基酸啦。
而羧肽酶呢，它的任务就是专门从这条链子的末尾开始，一个一个地把“小珠子”给揪下来。
这是不是很有意思？就好像我们吃串串，从最后那一串开始吃起。
羧肽酶为啥能这么精准地找到末尾的“小珠子”呢？这就得说说它的本事啦！它就像个聪明的小侦探，能识别出末尾那个氨基酸的特点。
一旦发现目标，嘿，就毫不留情地把它弄下来。
这就好像你在一堆玩具里，一下子就能找到你最喜欢的那个，然后紧紧抓住不放手。
咱再想想，如果没有羧肽酶，那会怎么样呢？那蛋白质的分解可就没那么顺利啦！就好像我们拆东西，如果没有合适的工具，那得费多大的劲啊。
羧肽酶就是这么个不可或缺的工具，让蛋白质的处理变得轻松又高效。
而且啊，羧肽酶可不是只有一种哦！就像不同的人有不同的本领一样，不同的羧肽酶也有自己独特的“技能”呢。
有的专门对付某些特定的氨基酸，有的则更加“全能”一些。
这多神奇呀！那羧肽酶在我们的生活中有啥用呢？哎呀，用处可多啦！在医学上，它可以帮助医生们了解一些疾病的机制，说不定就能找到治疗的新方法呢！在生物学研究中，更是少不了它的身影，能让科学家们更好地探索蛋白质的奥秘。
想想看，要是没有羧肽酶法原理的发现，我们得错过多少有趣的事情呀！我们怎么能更好地了解蛋白质呢？怎么能更好地推动医学和生物学的发展呢？所以说呀，这羧肽酶法原理可真是太重要啦！它就像是一把钥匙，打开了蛋白质世界的大门，让我们能看到里面丰富多彩的景象。
我们应该感谢那些发现和研究羧肽酶法原理的科学家们，是他们让我们对这个世界有了更深入的认识。
总之呢，羧肽酶法原理真的是很奇妙，很有趣，也很有用！大家是不是对它有了更深刻的了解呢？下次再听到羧肽酶这个词，可别陌生啦，要知道它可是个很厉害的小家伙呢！。
羧肽酶A
氨肽酶
肽链端解酶
肽 酶
肽链内切酶
羧肽酶A：水解由芳香族和中性脂肪族氨基酸形 成的羧基末端。比如酪氨酸，苯丙氨 酸，丙氨酸等。 羧肽酶
羧肽酶B：主要水解碱性氨基酸形成的羧基末端
。。。
羧肽酶 A
羧肽酶A
（Carboxypeptidase A CPA)
• 存在于哺乳动物的胰脏 • 存在于牛胰脏的羧肽酶A为单一的多肽链，约有300个 氨基酸残基，分子量为34.5kDa • 每个酶分子含有一个 • 其前体为以亚基双聚体或三聚体形式存在的羧肽酶原A。 在胰蛋白酶的激活下释放出大约60个氨基酸残基的N末端裂解物成为羧肽酶A。
催化机理
4.Tyr248的酚羟 基移动，与肽键 的酰胺基生成氢 键 6.酰胺和酪氨酸间的氢键 使得平面性的肽键因扭 曲而减弱
7. 与锌离子配位 的水在Glu270的 帮助下进行质子 转移，电离为金 属离子键合的羟 基
＋
靠近
2.底物的疏水残基 落入疏水口袋中
3.底物肽 键的羰基 与锌离子 配位
5.由于锌离子和 精氨酸正电荷的 作用，肽键羰基 被极化和伸长， 使羰基的碳原子 1.多肽链进入活性部位， Arg145的侧链移动与带 呈正电性 负电的羧基端生成盐键
酰胺和酪氨酸间的氢键使得平面性的肽键因扭曲而减弱与锌离子配位的水在glu270的帮助下进行质子转移电离为金属离子键合的羟羟基亲核进攻羰基碳原子肽键断tyr248的羟基给予被裂开的肽键的nh一个质由于谷氨酸羰基端负电荷的静电斥力与产物羧基端负电荷的静电斥力产物被驱出活催化机理
Tyr248的羟基给予被裂 开的肽键的-NH一个质 子
羟基亲核进 攻羰基碳原 子，肽键断 裂
由于谷氨酸羰基端负电荷的静电 斥力与产物羧基端负电荷的静电 斥力，产物被驱出活性部位。
羧肽酶A 终极版
分子量约为 34397D，由307 个氨基酸残基构 成一条肽链。 ρ =1.339/cm3， pI=6.0。
5
羧肽酶A（Carboxypeptidase A） 一级结构
2015-6-21
羧肽酶A（Carboxypeptidase A） 二级结构以及跟高级结构 （软件示意）
九个α-螺旋，占蛋白质结构35.83%； 呈现筒形包含在蛋白质外侧，且在螺旋中每相隔 1-2个氨基酸残基便出现一个赖氨酸或者是其他 的亲水性氨基酸；
羧肽酶A（Carboxypeptidase A）
16
Zn能否被同晶置换？
实验表明：Zn2+能够被Co2+、Fe2+置换而保持酶的活性。 被Co2+置换时，酶的活性得到进一步增强；被Mn2+、Cd2+ 置换时，酶的活性下降。Ni2+、Pb2+、Hg2+置换时仅仅保 持部分活性。 没有金属辅基的脱辅酶无活性。
九个β-折叠，占蛋白质结构14.66%，位于蛋白质 的内部；
一个二硫键，是半胱氨酸138和161位键合而成。
7
①更易于水解具有芳香族侧链和大脂肪侧
链的羧基端残基。比如酪氨酸、苯丙氨 酸等. ②释放除脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸和 赖氨酸之外的所有C末端氨基酸.
羧肽酶A（Carboxypeptidas一种消化酶。可专一性地从肽链 的C端开始逐个降解，释放出游离氨基酸的 一类肽链外切酶。以酶原形式存在于生物 体内。
羧肽酶
羧肽酶A ：切割C 端除Lys 、Arg、 Pro的氨 基酸
羧肽酶B ：可以 切割C端 的Lys或 Arg
羧肽酶C ：专门 水解C端 倒数第 二位是 Pro形成 的肽键
9
Zn2+与His196 ，Glu72和 His69结合。 还有一个留 给了水分子 或者羟基阴 离子。
羧肽酶在大豆蛋白水解中的脱苦作用
食品科技大豆蛋白的营养价值非常高，属于人类膳食中尤为重要的蛋白来源之一。
而大豆蛋白水解物的加工性能和营养特性对比大豆蛋白拥有明显的优势，进而呈现出非常广阔的应用前景，现如今，在营养保健、疗效和速溶饮料等食品中得以广泛运用。
除此之外，大豆蛋白水解物中的部分大豆多肽的生理和营养功能获得了人们的高度认可[1]。
但是，大豆蛋白酶在水解为低分子肽与胨时，将会无法避免的将会产生很多不良味道，尤其是苦味。
苦味的出现影响了食物中大豆蛋白水解物的具体应用，主要是因为水解物的苦味会造成产品出现味道缺陷。
从二十世纪中期至今，陆续有许多关于大豆蛋白水解物中苦肽及其降低或是消除的研究报道，且时至今日依旧在不断的研究中。
本文对苦味肽的呈味理论进行了论述，在此背景下，针对消除大豆蛋白水解物苦味的方式进行了探讨。
1 大豆蛋白水解的主要方法1.1 酸、碱水解法在适宜温度下，酸碱法是利用酸、碱等化学试剂让蛋白质分子的肽链断裂产生众多小分子的物质。
可因为碱法水解消旋了过多的氨基酸，没有了生物利用价值，所以，不适宜利用；而酸法一般会利用硫酸、盐酸等强酸在高温状态下发生反应，并且反应十分强烈，设备会受到严重的腐蚀，水解非常彻底，通常会生成氨基酸混合物，与此同时，在高温状态下，色氨酸被彻底破坏，现已逐渐被淘汰使用。
1.2 酶水解法对于酶法水解大豆蛋白的研究，最开始是利用酶进行蛋白质的降解，提高其分子内部或是分子之间的交联度或是连接特殊功能基团，改善蛋白质的功能，获取较好的加工特性。
随着酶制剂工业与食品工业的飞速发展，人们逐渐了解到，通过酶法改性，不但反应条件十分温和，产品颜色较浅，可靠安全，而且水解产物在味道、工艺、营养等多个方面都比酸、碱水解法存在明显优势。
因此，人们的注意力集中在了蛋白水解产物多肽方面。
美国与日本在大豆蛋白酶解工艺与酶解过程的感官特点、功能特点、改善营养价值的研究中获得重大突破以后，很多发展中国家也在陆续针对功能性大豆多肽开展研究。
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• Zn2+在无底物时为 5 个配位价，且第 5 个配体是一个水分 子 .当与底物结合时，被裂解的肽键羰基氧与 Zn2+形成第 6 个配位 Zn2+,附近的口袋正好容纳底物羧基末端的侧链 对底物结合.
• 羧肽酶Y 作用于任何一个 C-末端残基。
根据其催化机制： ★丝氨酸羧肽酶 (编号：EC 3.4.16.-) ★金属羧肽酶 (编号：EC 3.4.17.-) ★半胱氨酸羧肽酶 (编号：EC 3.4.18.-)。
活性中心
• 羧基,还有 Arg145 和 C 端氨基酸侧链的疏水性口袋 Zn2+对 酶的活性很重要.
Mock等他们通过对化合物 PhCONHCH2CONHCH2C(=S)NHCHBzlCO2H的研 究发现，天然CPA水解此化合物的速度很慢，然而如 果用cd2十取代活性中心的znZ+，该化合物很容易被 CPA水解，而对正常的底物则水解很慢.
软硬酸理论(仍属于一般碱催化机理) 证据与缺失（3）
• 他们认为这种现象可用软硬酸理论解释:软酸cdZ+ 易于与软碱s形成配位，而硬酸Znz+易于与硬碱(=O) 形成配位.
• suh等人于一2℃水解不 同的醋底物也发现有可能 是乙酞化酶的中间物存在.
• sander与wtize提供了直 接但少量的化学证据支持 有混合酸配中间物的存在. 然而采用捕捉试剂定量这 些中间物没有成功.
• 但在所有的这些研究 中，乙酞化酶都没有 通过化学方法捕捉到.
• Bresl等人采用180同位 素标记实验表明在典 型的肽底物合成或水 解时没有乙酸化酶中 间物.
• 其过渡态可用下实表示:
证据与缺失（1）
• Auld实验室已成功地分离出亚稳态Zn2+一结合中间物 • 但该中间物与捕捉试剂并不反应。
cPA一复合物晶体结构研究 证据与缺失（2）
• Christianson与Lipscomb 是这一方面的代表， 他们研究了很多CPA一 可逆抑制剂复合物的 晶体结构。
cPA一复合物晶体结构研究 证据与缺失（2）
• 根据复合物的晶体结构，他们对Zn2+与羧基直接 作用表示怀疑，认为模型化合物中位置合适原子 的赘合作用可能促进这种离子一偶极作用，或者 仅仅是其作用的结果。
• 他们提出的cPA催化水解机理可用下图表示。
软硬酸理论(仍属于一般碱催化机理) 证据与缺失（3）
• 亲核途径(nucleophilic pathway)，又名酸配途径(anhydride
• pathway) • 这种机理认为CPA活性中心的Glu-270与底物形成共价乙
酞化酶(酸配)，因而更容易水解. • 其过渡态可用下图表示:
证据与缺失
• Maknien等人于低温下对 某些酸底物进行研究时， 观测到有中间物的累积， 他们认为这种中间物就是 乙酞化酶.
• 分子量约为 35kD， • 由 307 个氨基酸残基构成
一条肽链。
• ρ为1.339/cm3， • 等电点pI二6.0.
分类
• 根据作用底物结构：
• 羧肽酶A 羧肽酶A可以切 割C端除了Lys、Arg、 Pro的氨基酸
• 羧肽酶B 可以切割C端的 Lys或Arg
• 羧肽酶C 专门水解肽链羧 基端（C端）倒数第二位 由Pro形成的的肽键
CPA简介
• 作用方式：一类肽链端解酶，作用于肽链的游离 羧基末端释放单个氨基酸
HHO
H
··· N
C R
C
N H
O CC CH2 O-
+H2O
羧肽酶
H N
H C R
O
C+
O-
H3+N
H O
CC CH2 O-
OH
OH
CPA简介
• 结构
外形紧密，是一个 5.0nm 4.2nm 3.8nm的椭圆形球体 ，大约含有 38%螺旋， 17%β- 折叠片。
软硬酸理论(仍属于一般碱催化机理) 证据与缺失（3）
Mock提出的CPA催化水解机理
研究方法
•
用酶的抑制剂或底物来研究酶催活，
•A抑制剂的设计也起到指导的作用 有助于CPA底物的研究和其应用 对其它三维结构未知的金属蛋白酶计具有重要的指导意义
Thank you ！
• 水促进途径(promoted-water pathway)，又名一般 碱催化(generalbase catalysis)
• 在一般碱催化机理中，认为cPA中的zn2+是典型 的亲电催化剂。过去一直认为存在zn2+一羧基作用 (极化肽键使之更容易受亲核试剂的进攻). 在Zn2+ 及底物的协同作用下，水分子直接进攻底物的肽 键。
• 另外他们根据抑制剂M(l对应体)抑制CPA的动力学 及计算机模拟的结果，认为亲核性基团只能从si面 进攻底物的肽键。
• 对抑制剂MZ的研究，提出了抑制剂抑制CPA时， 存在逆向质子化过程(ReverseProtonation)，可用下 面图示表示:
软硬酸理论(仍属于一般碱催化机理) 证据与缺失（3）