USP6非无菌产品地微生物检查微生物地计数检查
USP微生物限度检查 中文
USP微生物限度检查中文61）微生物限度检测（MICROBIAL LIMIT TESTS）此章提供方法来检测可能存在的好氧微生物其他制药过程中可能出现的微生物的数量，包括原材料和成品中的。
如果经过验证确认可以得到相同或更好的检测结论，也允许采用自动化的检测方法。
在样品检测过程中须进行无菌操作。
若无特别说明，则“培养（incubate）”一词指在30—35℃的培养箱内培养24至48小时；“生长（growth）”一词用于专门的判定，说明“存在和可能存在活的微生物”。
准备实验 (Preparatory Testing)本章涉及实验结果的有效性取决于：提供的被检测样品本身在实验条件下，被充分证明不会抑制可能存在的微生物的生长。
因此，在准备样品时，需要正规的实验操作和符合要求的实验条件，接种稀释样品到含有以下（微生物）培养物的培养基：金黄色（奥里斯）葡萄球菌（Staphylococcus aureus）,大肠埃希氏菌（Escherichia coli）, 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa), 和沙门氏菌（Salmonella）。
方法如下：将用肉汤培养基培养24小时后的（微生物）不小于10-3稀释的微生物培养物，加1 ml（微生物）培养液到磷酸(盐)缓冲液(pH 7.2)，液体大豆酪蛋白消化物培养基（Fluid Soybean-Casein Digest Medium），或者液体乳糖培养基（Fluid Lactose Medium）。
相应培养基培养失败则需要采取以下方法更改检测程序：（1）增加稀释液体积，检测样品加入量仍维持不变；或者（2）中和一定数量的干扰因子；或者（3）结合（1）、（2）得出适当条件，使接种物得以生长。
以下是一些物质的成分和浓度，该物质及浓度可用于加入培养基、阻止物质发挥抑菌作用：大豆卵磷脂（soy lecithin, 0.5%）或者聚山梨醇酯20（polysorbate 20, 4.0%）。
USP6非无菌产品地微生物检查微生物地计数检查
＜61＞微生物试验（61）非无菌产品的微生物检查：微生物计数试验序言后面描述的试验对可在好氧条件下生长的嗜温细菌和真菌进行定量计数。
设计此试验主要是为了确定一种原料药和制剂的微生物质量是否符合已建立的质量标准。
作此用途时，遵循下面给出的说明，包括采样编号，并按照下面的说明判定结果。
此方法不适用于以活的微生物作为活性成份的产品。
也可以使用其它的微生物规程，包括自动化方法，只要它们和已经证明的药典方法等效。
通用规程在设计好的条件下进行检定，避免供试品受到外部微生物的污染。
避免污染所采取的预防措施必须不影响试验中出现的任何微生物。
如果供试品中含有抑菌活性，那么应当尽可能的将其去除或中和。
如果用灭活剂来达到此目的，那么必须证明其有效性以及对微生物不具有毒性。
如果表面活性剂用于样品制备，那么必须证明其对微生物的无毒性及与所用灭活剂的相容性。
计数方法如下所示，使用膜过滤法或平板计数法其中一种。
通常微生物计数用最大几率计数（MPN）法是最不精确的；但是，对生物负荷极低的特定产品组，它可能是最为适宜的方法。
选择方法取决于这些因素，如产品性质及要求的微生物限度。
选择的方法必须允许对足量的样品量进行试验，从而判断是否符合质量标准。
必须建立所选方法的适用性。
促生长试验和计数方法的适用性一般考虑必须建立实验检出供试品中所含微生物的能力。
如果试验操作或产品方面引入了可能影响试验结果的变更，则必须确认适用性。
试验菌株的制备使用标准化的稳定试验菌悬液，或者按下述说明制备。
使用种子批培养保存技术（生产菌种系统）以便从原始主种子批中取出用于接种的活菌传代不超过5次。
每种细菌和真菌试验菌株的生长情况在表1中分别详细说明。
使用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH 7.2的磷酸盐缓冲液制备试验悬液；为了悬浮黑曲霉孢子，可加入0.05%的聚山梨醇酯80（吐温80）。
在2小时内使用悬液，如果在2°到8°保存，可在24小时内使用。
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法(15版中国药典公示稿)
胰酪大豆胨 琼脂培养基 和胰酪大豆 胨液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时间不超过 3 天，接种 量不大于 100cfu
胰酪大豆胨 琼脂培养基 / 胰酪大豆 胨液体培养 基 （ MPN 法），培养 温 度 30 ～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 3 天，接种量 不大于 100cfu
计数培养基适用性检查 计数方法适用性试验
试验菌株
试验菌液 的制备
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
需氧菌总数 计数
霉菌和酵 母菌总数
计数
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus
aureus) 〔CMCC(B)26 003)〕
胰酪大豆 胨琼脂培 养基或胰 酪大豆胨 液体培养 基，培养温 度 30 ～ 35℃，培养 时 间 18 ～ 24 小时
获得丰富
的孢子
注：当需用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌和酵母菌总数时，应进行培养基适用性检查，
检查方法同沙氏葡萄糖琼脂培过 5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌
种为第 0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学
特性。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表 1。
胰酪大豆胨 琼脂培养基 （ MPN 法 不 适用），培 养温度 30～ 35 ℃ ， 培 养 时间不超过 5 天，接种量 不大于 100cfu
沙氏葡萄 糖琼脂培 养基，培养 温度 20～ 25℃，培养 时间不超 过 5 天，接 种量不大 于 100cfu
沙氏葡萄 胰酪大豆胨 沙 氏 葡 萄 胰酪大豆胨 沙氏葡萄
糖琼脂培 琼 脂 培 养 糖 琼 脂 培 琼脂培养基 糖琼脂培
黑曲霉
养基或马 基，培养温 养基，培养 （ MPN 法 不 养基，培养
中国药典2020微生物限度检查
中国药典2020微生物限度检查摘要：1.2020 版《中国药典》微生物限度检查概述2.非无菌产品微生物限度的检查要点3.微生物限度计数及其应用4.药典委发布的相关国家标准草案5.中药饮片微生物限度检查法6.美国药典USP 微生物限度检查对比正文：2020 版《中国药典》微生物限度检查概述2020 版《中国药典》对微生物限度检查进行了详细的规定，涵盖了非无菌产品、生物制品以及中药饮片等多个领域。
微生物限度检查是评估药品在生产、储存和使用过程中微生物污染程度的重要手段，对保证药品质量和患者安全具有重要意义。
非无菌产品微生物限度的检查要点非无菌产品的微生物限度检查主要包括以下几个方面：1.菌种及菌液制备：需要对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌等菌种进行培养，制备成菌液。
2.培养条件：将菌液接种在胰酪大豆腺琼脂培养基上，在35℃条件下培养24 小时。
3.菌落计数：将培养后的琼脂平板按区域划分，对每个区域进行菌落计数，以评估样品中的微生物污染程度。
微生物限度计数及其应用微生物限度计数是评估非无菌产品微生物污染程度的重要方法，其主要包括以下几个方面：1.耐胆盐革兰阴性菌：此类菌对胆盐具有较强的耐受性，是药品中常见的微生物污染菌。
2.大肠埃希菌：作为肠道常见菌，大肠埃希菌可能导致肠道感染等疾病。
3.沙门菌：沙门菌是一种常见的食源性病原菌，可能导致食物中毒等疾病。
药典委发布的相关国家标准草案国家药典委员会发布了《凡例》、《微生物限度检查法》等5 份国家标准草案，以规范药品微生物限度检查的方法和要求。
其中，《生物制品》分包装及贮运管理、《鼠源性病毒检查法》等文件对药品微生物限度检查进行了详细规定。
中药饮片微生物限度检查法中药饮片微生物限度检查法用于检查中药材及中药饮片的微生物污染程度。
检查项目包括需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、耐热菌总数、耐胆盐革兰阴性菌、大肠埃希菌、沙门菌。
中药饮片微生物限度检查的试验环境应符合微生物限度检查的要求，全过程必须严格遵守无菌操作。
微生物检测方法-USP
<61>非无菌产品微生物检查：微生物计数检查简介：下述方法能够对在有氧条件下生长的嗜温性细菌和真菌进行定量计数。
该检查主要是为了确定某种物质或剂型是否符合既定的微生物质量标准。
当以此为目的时，按照下面给出的规定进行，包括所需的样品数量以及按照下文规定的要求对结果进行描述。
此方法不适用于用活微生物作为活性成分的产品。
若使用了其他的微生物程序，包括自动方法，则应提供其等同于药典方法的证明。
一般程序为了避免外来微生物的影响，必须在设定的条件下进行微生物检查。
为避免此污染所采取的预防措施必须不影响所要进行检查的微生物。
如果待测样品具有抗微生物活性，则在可能的情况下，移除或中和这种抗微生物活性。
如果因此而是用了钝化剂，则必须证明其有效性及对微生物无毒性。
如果在处理样品时使用了表面活性剂，必须证明其对微生物无毒性及与证明其所使用的钝化剂的兼容性。
计数方法用薄膜过滤法和平皿计数法。
最大机率法（MPN）一般来说最不准确的微生物计数方法。
但是对于生物负荷非常小的确定的产品来说可能是最适合的方法。
对检查方法的选择是基于像产品的本质和微生物的限度这样一些因素。
所选择的方法必须能够用足够的样品来判断出其是否符合标准规定。
必须证明所选择的方法的适用性。
生长促进试验、计数方法的适用性和阴性对照一般原则必须证明检测方法能够从携带微生物的样品中检测出此微生物。
如果在检测过程中有了改变或会影响检测结果的产品的改变，则必须证明其适用性。
测试菌株的准备用标准化的测试菌株的稳定混悬液或用下述规定的方法准备测试菌株。
使用菌种培养维护技术（菌种系统），以使从原始主菌株中移除的用于接种的微生物不大于5个片段。
按照表1中所描述的方法分别对细菌和真菌的测试菌株进行培养。
用PH 7.0 的氯化钠-蛋白胨缓冲液或PH 7.2 磷酸盐缓冲液来配制测试混悬液；制备A. brasiliensis 孢子混悬液，可加入0.05%的聚山梨酯80。
在2小时内使用该混悬液或如果在2°－8°储存则在24小时内使用。
非无菌制剂的微生物限度检查法：微生物计数法
困难或不确定,可将该管培养物转接种至胰蛋白大豆肉汤培养基或胰蛋 白大豆琼脂培养基,在同一温度条件下培养1~2天,在进行结果判断。根 据生长管数从表3查对每1g或每1mL供试品中最大可能的菌落数。
试验菌株 试验菌的制 备 培养基促生产试验 总需氧菌细 菌数测定 金黄色葡萄球 菌ATCC 6538 NCIMB 9518 CIP 4.83 NBRC 13276 胰蛋白大豆 琼脂或胰蛋 白大豆肉汤 30~35℃ 18~24小时 胰蛋白大豆 琼脂或胰蛋 白大豆肉汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 胰蛋白大豆 琼脂或胰蛋 白大豆肉汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 胰蛋白大豆 琼脂或胰蛋 白大豆肉汤 ≤100 cfu 总酵母菌和 霉菌数测定 供试品计数方法的适用性试 验 总需氧细菌 数测定 胰蛋白大豆 琼脂/MPN胰 蛋白大豆肉 汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 胰蛋白大豆 琼脂/MPN胰 蛋白大豆肉 汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 胰蛋白大豆 琼脂/MPN胰 蛋白大豆肉 汤 总酵母菌和 霉菌数测定
供试品计数方法的适用性确认试验
供试液制备
根据供试品的理化特性选择供试液的制备方法，若下列制备方法经 确认均不适宜，应采用适宜的替代方法。 水溶性产品 取规定量，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH7.2磷 酸盐缓冲液或胰蛋白大豆肉汤培养基溶解或稀释，一般制成1：10供试 液。如果需要，调节供试液pH值至6~8。必要时，用同一稀释液将供试 液进一步稀释。 水不溶性非油脂类产品 取规定量，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓 冲液、pH7.2磷酸盐缓冲液或胰蛋白大豆肉汤培养基制成1：10的混悬 液。引湿性较差的供试品，可在稀释剂中加入表面活性剂助悬，如1g/L 的聚山梨酯80。如果需要，调节供试液pH值至6~8。必要时，用同一稀 释液将供试液进一步稀释。 油脂类产品 取规定量，溶解于经过滤除菌的无菌十四烷酸异丙酯 中，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性表 面活性剂充分混合，必要时可采用不超过40℃的热的稀释剂，特殊情况 下最多不超过45℃，若需要乳化可在水浴中进行，然后加入预热的稀释 剂使成1：10供试液，保持温度，小心混合，并在最短时间内形成乳液 状。必要时，用含适宜浓度的无菌聚山梨酯80或其他非抑制性无菌表面 活性剂的稀释剂进一步10倍系列稀释。 液体或固体的气雾剂 取规定量容器数，从每一供试品容器中取全量 或一定剂量的样品无菌转移至薄膜过滤器或无菌容器中进一步取样检 查。 贴剂 取规定数量贴剂，去除贴剂保护层（释放内衬），将具有黏 性的一面朝上置无菌玻璃板或塑料垫上。用适宜的无菌多孔材料（如无 菌纱布）覆盖在黏性面上，防止贴剂相互粘连，然后将其置于适宜体积 并含有灭活剂（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀释剂中，剧烈振摇至少 30分钟。
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查
【2020版中国药典】通则-非无菌微生物限度检查1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
学习：将旧版的“相应”更换为“规定”，更便于按照1107进行判定执行。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
学习：将旧版的“单向流空气区域”更换为“洁净空气区域”。
计数方法
……供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
……
提示：后文增加了对于“贵重药品、微量包装药品”的检验量的更全面的表述，因注意结合此处的要求。
计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验
……菌液制备……取黑曲霉的新鲜培养物加人适量含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或……
学习：此处改动同无菌检查法，将“3~5ml”的具体量调整为“适量”，便于根据孢子的量灵活掌握菌液制备方法。
培养基适用性检查
微生物计数用的商品化的预制培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
学习：类似于无菌检查法，此处将“成品培养基”修改为“商品。
〈61〉非无菌产品的微生物检测：微生物计数法
〈61〉非无菌产品的微生物检测：微生物计数法简介下文所述的试验都是用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的定量计数。
设计这个实验旨在确定药物或制剂是否符合既定的微生物质量标准。
当用于此类目的时，可参考以下的说明，包括所取样品的量，以及结果的解释。
本方法不适用于将微生物作为有效成分的产品。
本检查法可采用包括自动检测方法在内的替代微生物检查法，但要求已被证明等效于药典方法。
通用方法在拟定的条件下进行试验，以避免被检查产品的外在微生物污染。
避免污染所采取的预防措施必须确保它们不会影响测试物中任何微生物的检出。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，则必须证明其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，则必须证明其对微生物无毒性以及与所使用灭活剂的相容性。
计数方法根据指示，使用薄膜过滤法或平皿计数法之一。
最可能数法（MPN）通常是微生物计数最不准确的方法；但是，对于某些生物负载量非常低的产品，它可能是最合适的方法。
方法的选择取决于产品的性质和微生物所需的限度等因素。
选择的方法必须允许对足够大的样本进行测试，以判断是否符合标准。
必须确定所选方法的适用性。
促生长试验、计数方法的适用性和阴性对照总则必须建立在待测产品中检测存在微生物的试验能力。
如果引入了可能影响测试结果的测试性能变化或产品变化，则必须确认其适用性。
试验菌液的制备使用标准稳定的测试菌株悬浮液或按以下说明进行制备。
采用种子批培养维护技术（种子批系统），使接种用活菌与原种子批传代不超过5代。
如表1所述，分别培养每种细菌和真菌测试菌株。
表1 试验菌液的制备和使用液；若要悬浮巴西曲霉孢子，可向缓冲液中添加0.05%的聚山梨酯80。
在2小时内使用悬浮液，如果储存在2°~8°之间，则在24小时内使用。
作为制备和稀释巴西曲霉或枯草杆菌营养细胞新鲜悬浮液的替代方法，制备稳定的孢子悬浮液，然后使用适当体积的孢子悬浮液进行试验接种。
非无菌产品微生物检查微生物计数法
2021/12/29
31
微生物计数方法
主要内容
格式变化 通用要求 计数方法 试验菌液的制备和试验 培养基适用性检查 供试液的制备 计数方法适用性试验 供试品检查 结果判断
格式变化
修订前：一个通则 修订后：三个通则
微生物限度检查法
非无菌产品微生物检查：微生物计数法
非无菌产品微生物检查：控制菌检查法 药品微生物限度标准 标准部分合并一部和二部内容 结果报告问题：【微生物限度】
判断标准 与对照培养基比较，菌数比值在0.5-2(50％-200％)范围内,且菌落大小、形态一致。
注：如用于控制菌白色念珠菌的检查时，同时需要满足控制菌项下培养基适用性检查要求。
含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂：培养基适用性检查同沙氏葡萄糖琼脂。
计数方法的增修订内容
修订前 1、平皿法： 倾注法 2、薄膜过滤法 修订后
修订后 需氧菌总数测定：胰酪大豆胨琼脂和胰酪大胨肉汤（30-35℃ ） 霉菌和酵母菌总数测定：沙氏葡萄糖琼（20-25℃ ） 、 玫瑰红钠琼脂。
培养基适用性检查
目的：确定培养基质量是否符合检验用要求。 培养基的无菌性试验 培养基的灵敏度试验 培养基适用性检查 -促生长试验 -抑制性试验 -指示能力
计数方法适用性试验—试验菌株
修订前 细菌计数：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。（营养琼脂）。 霉菌和酵母菌计数：白色念珠菌、黑曲霉。（玫瑰红钠琼脂）。 修订后 好氧菌总数测定 平皿法、薄膜过滤法： 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉。（胰酪大豆 胨琼脂）。 MPN法： 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌（胰酪大豆胨肉汤）。 霉菌和酵母菌总数测定: 白色念珠菌、黑曲霉（ 沙氏葡萄糖琼脂）。
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法汇总
非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法汇总湖南湘大兽药有限公司工作标准文件题目非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法标准操作规程编号ZLJG F-046-00修定质检部审核批准修定日期2016.12 审核日期批准日期颁发部门GMP办公室颁发数量 2 份生效日期分发部门质检部、档案室文件页数共11页一、目的：为规定非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的检测方法和操作要求，特制定本操作规程。
二、引用标准：中华人民共和国兽药典（2015年版一部附录P179）。
三、适用范围：适用于本公司检品采用非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法的质量检测。
四、责任者：理化分析员对本标准的实施负责。
五、正文：1简述：微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检查。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
2.计数方法计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-Number Method，简称MPN 法）。
MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。
供试品检查时,应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
3.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
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＜61＞微生物试验（61）非无菌产品的微生物检查：微生物计数试验序言后面描述的试验对可在好氧条件下生长的嗜温细菌和真菌进行定量计数。
设计此试验主要是为了确定一种原料药和制剂的微生物质量是否符合已建立的质量标准。
作此用途时，遵循下面给出的说明，包括采样编号，并按照下面的说明判定结果。
此方法不适用于以活的微生物作为活性成份的产品。
也可以使用其它的微生物规程，包括自动化方法，只要它们和已经证明的药典方法等效。
通用规程在设计好的条件下进行检定，避免供试品受到外部微生物的污染。
避免污染所采取的预防措施必须不影响试验中出现的任何微生物。
如果供试品中含有抑菌活性，那么应当尽可能的将其去除或中和。
如果用灭活剂来达到此目的，那么必须证明其有效性以及对微生物不具有毒性。
如果表面活性剂用于样品制备，那么必须证明其对微生物的无毒性及与所用灭活剂的相容性。
计数方法如下所示，使用膜过滤法或平板计数法其中一种。
通常微生物计数用最大几率计数（MPN）法是最不精确的；但是，对生物负荷极低的特定产品组，它可能是最为适宜的方法。
选择方法取决于这些因素，如产品性质及要求的微生物限度。
选择的方法必须允许对足量的样品量进行试验，从而判断是否符合质量标准。
必须建立所选方法的适用性。
促生长试验和计数方法的适用性一般考虑必须建立实验检出供试品中所含微生物的能力。
如果试验操作或产品方面引入了可能影响试验结果的变更，则必须确认适用性。
试验菌株的制备使用标准化的稳定试验菌悬液，或者按下述说明制备。
使用种子批培养保存技术（生产菌种系统）以便从原始主种子批中取出用于接种的活菌传代不超过5次。
每种细菌和真菌试验菌株的生长情况在表1中分别详细说明。
使用pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH7.2的磷酸盐缓冲液制备试验悬液；为了悬浮黑曲霉孢子，可加入0.05%的聚山梨醇酯80（吐温80）。
在2小时内使用悬液，如果在2°到8°保存，可在24小时内使用。
制备并稀释黑曲霉或枯草芽孢杆菌的营养细胞新鲜悬液的替代选择，是制造一个稳定的孢子悬液，然后将适量的孢子悬液用于试验接种。
稳定的孢子悬液可在2°到8°保存，保存时间是一个经过验证的时间。
表1.试验微生微的制备和使用文案大全文案大全文案大全文案大全阴性对照为了验证试验条件，用所选稀释液代替试验样品作为阴性对照。
其中不得有微生物生长。
培养基的促生长对每批现成的培养基及每批由脱水培养基或描述成分制备的培养基进行试验。
将表1中所列出的少量（不超过100cfu）微生物接种到大豆-酪蛋白消化肉汤和大豆-酪蛋白琼脂份/平板上，每次使用单独的培养基份/平板。
将表1中说明的少量（不超过100cfu）微生物接种到沙氏葡萄糖琼脂平板上，每次用一个单独的培养基平板。
按照表1中描述的条件进行培养。
对于固体培养基，获得的生长值与标准化的接种物所计算的值的差值不得超过2。
对于新配制的接种物，其微生物生长情况与过去使用原来经过试验并获批准的培养基得到的结果相当。
如果可见明显微生物生长与早先用过去试验过并获批准的培养基得到的结果相当，则液体培养基适合。
产品存在情况下计数方法的适用性样品制备制备样品的方法依据于供试品的物理特性。
如果证实下述规程无一令人满意，那么必须建立一个适当的可供选择的规程。
水溶性产品—将供试品溶解或稀释（通常1比10倍制备稀释液）于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH 7.2的磷酸盐缓冲液或大豆-酪蛋白消化肉汤中。
如果有必要，将pH值调整到6到8。
必要时，用同样的稀释液进一步稀释。
不溶于水的非脂肪产品—将供试品（通常1比10倍制备稀释液）悬浮于pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH 7.2的磷酸盐缓冲液或大豆-酪蛋白消化肉汤中。
可加入表面活性剂，如1g/L的聚山梨醇酯80来促进溶湿差的物质悬浮。
如有必要，将pH 值调整到6到8。
必要时，用同样的稀释液进一步稀释。
脂肪产品—将其溶解于已过滤灭菌的十四酸异丙酯中，或将供试品和最小必需量的无菌聚山梨醇酯80或其它非抑制性无菌表面活性剂混合，如需加热，不要超过40°，特殊情况下不超过45°。
小心混合，必要时可在水浴中保持温度。
将足量已加热的精选稀释剂加入其中，制成原始产品1比10倍的稀释液。
小心混合，维持温度以缩短形成乳浊液的必要时间。
可以用所选择的稀释剂（含有适当浓度的无菌聚山梨醇酯80或其它非抑制性无菌表面活性剂）来制备另外的10倍系列稀释的稀释液。
烟雾剂中的液体或固体—将产品无菌转移到一个膜过滤器或无菌容器中以备进一步取样。
使用每个试验容器中的总内含物或规定的剂量。
透皮贴剂—取下透皮贴剂的保护盖片（“释放背衬”），将它们粘面向上放到无菌玻璃或塑料托盘上。
用适当的无菌多孔材料（如无菌纱布）盖在粘面上，防止多片粘在一起，将其移入所选的含有如聚山梨醇酯80和/或卵磷脂之类灭活剂的适量稀释剂中。
剧烈摇晃制备品至少30分钟。
接种与稀释将足够体积的微生物悬液加入到如上述制备的样品和对照（不含试验材料）中制成不大于100cfu的接种物。
接种悬浮液的体积应当不超过稀释后产品体积的1%。
为了证明从产品中回收微生物的可接受性，必须用制备样品中可能低的稀释因子进行试验。
由于抑菌活性或可溶性差而不可能时，必须开发更加适当的方案。
如果样品中的生长抑制性无法避免，那么可在中和、过滤或稀释后加入部分微生物悬浮液。
抑菌活性的中和/去除将按接种和稀释中所述规程稀释并按在产品存在情况下的微生物回收中所述规程接种制备的样品中回收的微生物数量，和从对照制备品中回收的微生物数量做比较。
如果生长受到抑制（由一个因子大于2引起减少），那么修正特定的计数试验规程以确保结果的可靠性。
比如，修正规程可能包括：(1) An increase in the volume of the diluent or culture medium;增加稀释剂或培养基的体积；(2) Incorporation of a specific or general neutralizing agents into the diluent;在稀释剂中加入特定或通用中和剂；(3) Membrane filtration; or薄膜过滤；或(4) A combination of the above measures.联合上述措施中和剂—中和剂可以用来中和抗菌剂的活性（见表2）。
最好能在灭菌前将其加到所选的稀释剂或培养基中。
如果使用它们，必须进行一个有中和剂无产品的空白试验来证明其对微生物的有效性和无毒性。
表2. 干扰物的常用中和剂/中和方法抗菌活性。
此信息可以说明本品或许没有被给出类型的微生物污染。
但是，也有可能是产品仅抑制此处说明的某些微生物，但是并不抑制其它菌株，而这些菌株并不包括在试验菌株。
那么，则用与微生物生长和规定的验收标准相容的最高稀释因子进行试验。
药品中微生物的回收对列出的每种微生物进行分离试验。
只对所加的试验菌株进行计数。
薄膜过滤—使用标称孔径不超过0.45 um的薄膜过滤器。
选择过滤材质的类型，其截留细菌能力应不被供试品的组份所影响。
对于列出的每种微生物，使用一个薄膜过滤器。
将按样品的制备、接种与稀释和抑菌活性的中和/去除所述制备的适量样品移入薄膜过滤器中，立即过滤，并用适当体积的稀释剂冲洗薄膜过滤器。
为了确定好氧微生物的总数（TAMC），将薄膜过滤器的移到大豆-酪蛋白消化琼脂表面上。
为了确定酵母菌和霉菌总数（TYMC），将薄膜转移到沙氏葡萄糖琼脂表面上。
按表1所述培养平板，进行计数。
平板计数法—对每种培养基执行平板计数法时至少重复一次，使用平均计数结果。
平板计数法—在直径9cm的培养皿中，加入按照样品的制备、接种与稀释和抑菌活性的中和/去除所述制备的样品1mL，以及15到20mL的大豆-酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，保持两种培养基温度均不超过45°。
如果使用更大的培养皿，则相应增加培养基的量。
对于表1中列出的各种微生物，至少使用两个培养皿。
按表1所述培养平板。
采用每种培养基计数的算数平均值，并计算原始接种物的cfu数。
表面铺展法—对于直径9cm的培养皿，在每个培养皿加入约45°的15到20mL的大豆-酪蛋白消化琼脂或沙氏葡萄糖琼脂，使其凝固。
如果使用更大的培养皿，相应增加琼脂的量。
在层流柜或培养箱中使平板干燥。
表1中列出的每种微生物，至少用两个培养皿。
将已测体积，不少于0.1mL的样品铺展到培养基表面上，样品是按照样品的制备、接种与稀释和抑菌活性的中和/去除所述制备的。
按倾注培养法所述培养并计数。
最大机率（MPN）法—MPN法的精密度和准确性要比薄膜过滤法或平板计数法低。
计霉菌数得到的结果尤其不可信。
因此，保留MPN法仅在无其它可用方法时对TAMC 计数。
如果所用方法判定，按如下进行。
制备一系列，至少三个10倍系列稀释的按照样品的制备、接种与稀释和抑菌活性的中和/去除所述制备的样品。
从每个级别的稀释液中，取1g或1mL接种到三个含有9到10mL的大豆-酪蛋白消化肉汤的试管中。
如有必要，可以在培养基中加入类似聚山梨醇酯80的表面活性剂或抑菌因子灭活剂。
因此，如果制备了三个稀释度，就要接种9个试管。
所有试管在30°到35°培养不超过3天。
如果由于供试品特性而导致读出结果困难或不确定，则在同种肉汤或大豆-酪蛋白消化琼脂上以相同的温度再次培养1到2天，并使用此次结果。
从表3中，确定每克或每毫升供试品中微生物的最可能数。
表3 . 微生物的最可能数值验证薄膜过滤法或平板计数法的适用性时，任何试验菌计数的平均值与接种与稀释中定义的不含产品的对照值不得有大于2的差值。
验证MPN法的适用性时，接种物的计算值必须在用对照得到结果的置信限度的95%内。
如果用所述任一方法检测的多个微生物中有一个达不到以上标准，那么使用更接近于标准的方法和试验条件来测试产品。
产品检测用于试验的数量除非特别指定，否则取10或10mL供试品按上面所述小心进行检测。
对于烟雾剂中的液体或固体，抽取10个包装的样品。
对于透皮贴剂，取10贴样品。
对于将在下述条件下按配方制造的活性成分，试验量可以减少：每个剂量单位（如片剂、胶囊、注射剂）中（活性成分）的数量小于或等于1mg的，或者每g或每ml（对于不用剂量单位表示的制剂）的量小于1mg。
在这些情况下，检测样品的量不能小于10个剂量单位，或10g或10mL的产品。
在样品量有限或批量非常小（例如小于1000mL或1000g）时，用作活性成分的物质的试验量应当是批量的1%，除非规定或者经过证明和批准用更少的量。
对于一批总数小于200的产品（如，用于临床试验的样品），取样量可以减少到2个单位，数量少于100的可为1个单位。