原核表达条件优化

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链球菌溶血素O抗原的原核表达及条件优化

基础。
关键词：链球菌溶血素。抗原；包涵体；自诱导；蛋白纯化
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３ — ４１３０．２０１４．１９．００３文献标识码：Ａ文章编号：１６７３－４１３０（２０１４）１９－２５８１ — ０３
国检验医学杂志２０１４年１Ｏ月第３５卷第１９期
ＩｎｔＪＬａｂＭｅｄ，Ｏｃｔｏｂｅｒ２０１４，Ｖｏｉ．３５，Ｎｏ．１９
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２５８１・
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基础实验研究论著・
链球菌溶血素Ｏ抗原的原核表达及条件优化
ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎＯａｎｔｉｇｅｎａｎｄｉｔｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
ＨｕＸｉｌｉｎ，ＨｕａＨｕａｎ，ＤｅｎｇＱｕｎｙｉｎｇ
胡锡林，花欢，邓群英
（南京军区鼓浪屿疗养院检验科，福建厦门３６１００２）
摘要：目的构建链球菌溶血素Ｏ抗原（ＳＬＯ）的重组表达质粒，并优化其在大肠杆菌中的最佳表达条件。方法以Ａ群
ｉｔｓｂｅｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅＤＮＡｆｒａｇｍｅｎｔｅｎｃｏｄｉｎｇＳＬＯｗａｓａｍｐｌｉｆｉｅｄｆｒｏｍｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌｇｅ — ｎｏｍｉｃＤＮＡｔｅｍｐｌａｔｅｂｙＰＣＲ，ａｎｄｔｈｅｎｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄｉｎｔｏｐＥＴ一３２ａ（＋）ｖｅｃｔｏｒｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｐＥＴ一３２ａ（＋）一ＳＬＯｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓ —

红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化

ＡｑｕａｔｉｃＥｃｏｎｏｍｉｃＡｎｉｍａｌｓｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＨｉｇｈｅｒＥｄｕｃａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ５２４０２５，Ｃｈｉｎａ；
达量最大，分子质量大小与预测值相符，该蛋白主要以包涵体形式存在。利用ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和层析柱使ＴｄＴ蛋白
得到进一步纯化，最佳咪唑洗脱浓度为３００ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｗｅｓｔｅｎｒｂｌｏｔ分析显示，该融合蛋白可与鼠抗Ｈｉｓ —ｔａｇ单克隆抗体发生特异性的结合，表明表达蛋白为目的蛋白。关键词：红笛鲷；ｔｄｔ基因；原核表达；优化；纯化；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析
２．ＺｈｏｎｇｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｙｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｃｏｄｉｎｇｔｈｅｍａｔｕｒｅｐｅｐｉｆｄｅＬｕｔｊｎＵａＳｓａｎｇｕｉｎｅｕｓＴｅｒｍｉｎａｌ
第３３卷Байду номын сангаас
第１期
广东海洋大学学报
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

【关于优化原核表达的一些总结】

我认为，进行原核表达条件优化主要应注意以下几方面：1．密码子最优化（codon of optimization）：大肠杆菌某些核糖体蛋白质中的使用频率不同，有最佳密码子（optimal codons）或偏爱密码子（preferred codons），稀有或利用率低的密码子（rare or low-usage codons）。

大肠杆菌稀有密码子主要有ATA，CTA，CCC，ACG，CGA，CGG，AGG，GGA，GGG等。

另外，大肠杆菌偏爱的终止密码子为UAA，而哺乳动物偏爱的终止密码子为UGA。

同时，终止密码子的下游碱基对翻译有效终止有影响，大肠杆菌中UAAN，N的影响力次序为：U>G>A，C；哺乳动物中UAGN，N的影响力次序为：A，G>>C，U。

我用的pET-43.1，先用宿主菌BL21（DE3），没有目的带出现，后改用RosettaBlueTM（DE3），目的蛋白表达效率达50%以上，并且是可溶的。

2．启动子是DNA链上RNA聚合酶的识别位点和结合位点，外源基因表达的理想启动子是可以指导高效转录，保证目的基因高效表达的启动子。

乳糖启动子是最常用的启动子，但容易引起外源基因的渗漏表达，对细胞的生长产生毒害作用；其他从乳糖启动子构建而来的启动子，多用IPTG诱导，IPTG对菌体也有毒害作用。

若IPTG对宿主菌有毒，可以同时加入IPTG和乳糖诱导表达，这样可减少IPTG的浓度。

若目的蛋白有毒，可用Invitrogen公司的pLEX系统等。

3．培养基的成分：用M9ZB和NZCYM培养基培养细菌，增加细菌质粒拷贝数；用LB培养基表达外源蛋白，提高蛋白表达量。

【毒性较大蛋白表达条件优化】：１）一般发酵时高温、高浓度诱导剂（ＩＰＴＧ）有利于表达表达包涵体形成，减少毒性。

２）加大氨苄的浓度（可达400mｇ／ｍｌ）并提高培养基中葡萄糖浓度（可达0.5％）有利于稳定表达，并要及时补充葡萄糖使其浓度维持在0.5％。

原核表达条件的优化

【专题讨论】原核表达条件优化！会不会是蛋白质的表达量低，电泳并不能反映出来，典型的例子是干扰素，虽然电泳没有新生条带，但是裂解上清的活性却很高。

“疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白，42度发酵，可抑制宿主菌蛋白表达疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白?那条带也挂在亲合柱子上的，发酵的细菌蛋白却没有。

挂在亲合柱子上,也有可能是非特异性条带，如用HIS TAG亲合柱，加大米错量试一下。

胞内表达有生物活性蛋白的一些策略包涵体的形成仍然是胞内基因表达巨大障碍，考虑到易聚合蛋白质复性的艰辛以及收得率的问题,胞内直接表达有生物活性的蛋白质仍然有一定的意义，到现在为止，形成包涵体的理化因素仍然不清楚，统计分析的出的结论是六个因素与包涵体的形成有关：电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量（1）。

有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠，如低温培养（3、4、11）、宿主菌的选择（12）、某些氨基酸残基的取代（14）、共表达分子伴侣（17）、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达（18）和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌（2、16）等。

胞内的氧化还原势是另外的问题，细菌的胞内蛋白质半胱氨酸残基和二硫键较少，含有大量二硫键的蛋白质则被输送到胞浆以外。

这样那些依靠二硫键来稳定蛋白质四级结构的蛋白质在细菌的胞浆内因为缺乏形成二硫键的系统如DsbA/DsbB难以正确折叠。

有人分离到允许胞内二硫键形成的突变株，这些突变株使编码硫氧还蛋白还原酶的TrxB基因失活以及造成一定的还原势。

硫氧还蛋白本身对于二硫键的形成不是必需的（16），该作者认为胞内有其他的类似于硫氧蛋白的蛋白能被硫氧还蛋白还原酶还原，在硫氧还蛋白还原酶缺陷的情况下，处于氧化状态的这类蛋白质能促进二硫键的形成。

这些硫氧还蛋白还原酶缺陷菌被证实为在大肠杆菌中生产复杂蛋白质的很有价值的工具。

Novagen公司pET宿主菌系列中的AD494（DE3）和Origami B(DE3)都是TrxB基因突变菌株。

猪繁殖候选基因 Lhx8的原核表达及条件优化

猪繁殖候选基因 Lhx8的原核表达及条件优化王晶晶;毛慧;陈琳;何闪;潘雪男【摘要】以猪卵巢组织的总 rNA 为模板，采用 rT-PCr 方法扩增猪 Lhx8基因完整的开发阅读框，将该基因克隆到原核表达载体 pET28a （＋）中，构建了原核重组质粒 pET28a （＋）-Lhx8。

将重组质粒转化 rosetta（DE3）菌株，经 IPTG 诱导表达及 SDS-PAGE 检测后，发现1条特异的蛋白表达条带，分子量为37 kD 左右。

通过对 IPTG浓度和诱导时间的优化，结果显示融合蛋白的最佳诱导浓度为0.4 mmol/L IPTG，最佳诱导时间为37℃诱导12 h。

%Using total rNA of pig ovary as PCr template,the full open reading frame (OrF)of pig Lhx8 gene was obtained by rT-PCr and then cloned into pET28a (+)vector.The pET28a (+)-Lhx8 vector was con-structed and confirmed by restriction enzyme digestion and sequence analysis.The recombinant plasmids were transformed into rosetta(DE3)cells and induced by IPTG.The recombinant fusion protein with MW 37 kD was detected by SDS-PAGE.The recombinant fusion protein reached the peak expression after the transformants cul-tured for 12 h at 37 ℃.The optimal concentration of IPTG was 0.4 mmol/L.【期刊名称】《上海农业学报》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】4页(P54-57)【关键词】猪;Lhx8基因;原核表达;条件优化【作者】王晶晶;毛慧;陈琳;何闪;潘雪男【作者单位】上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106;上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106;上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106;上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106;上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106【正文语种】中文猪繁殖候选基因Lhx8的原核表达及条件优化王晶晶，毛慧，陈琳，何闪，潘雪男（上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106）作者简介：王晶晶（1982—），女，博士，助理研究员，研究方向为猪的遗传育种与繁殖通信作者：潘雪男（1966—），男，本科，高级畜牧师，主要从事畜牧兽医技术的研究与推广。

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

１０ｍｌｍＬＩＴ诱导６ｈ时条件下蛋白表达量最高。ＳＳＰＧＥ电泳检测的纯化目的蛋白约为９Ｄ，预．ｍｏ／ＧＰＤ－Ａ０ｋａ与计大小一致。ＶＰ２基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。关键词：犬细小病毒；２基因；合蛋白；化与纯化ＶＰ融优
犬细小病毒ＶＰ２基因原核表达条件优化与蛋白纯化
陈胜男，素贞，翟少伦，子健马简
（疆农业大学动物医学学院，鲁木齐新乌８０５）３０２
摘
要：为了提高犬细小病毒ＶＰ２基因在大肠杆菌Ｅ．ｃｌＢＬ１（ｏｉ２ＤＥ３中的表达量，过改变诱导温度、导时）通诱
ｐａｍｉｃｅｉｈａｃｌ，Ｌ２ＤＥ３ｌｓｄＥｓｈｒｃｉｏｉＢ１（）ｗａｈｐｉａｅ．ｍｍｏ／ＰＴＧｒｎｕｅｏｔｓｔｅｏｔ１ｗｈｎ１０ｍｌｍＬＩｗｅｅｉｄｃｄｆｒ６ｈａ
３ ℃．５ＦｕｓｏｏｅｎｐｕｉｉｄｂｙＧｌｔｔｏｐｒｓＢｆｉｉｙｃｌｍｎｗａｂｏｕＤａｗｈｃｒｉｎｐｒｔｉｒｆｅｕａｈｉｎｅＳｅｈａｏｅ４ａｆｎｔｏｕｓａｔ９０ｋｉｈｗｅｅ
ｓｏｏｅｎｓｔｔｅｂｓｏｔｙｎｇｓ — ｎｉａｃｎｆＣＰＶ．ｉｎｐｒｔｉｅｈｙｗｏｒｓＣａｎｎｄ：ｉｅｐａｒｖｉｕｓ；ＶＰ２；ｆｉｎｐｒｔｉｏｔｍｉａｉｎｒｆｃｔｏｖｏｒｕｓｏｏｅｎ；ｐｉｚｔｏｎａｄｐｕｉｉａｉｎ

原核表达条件优化

原核表达条件优化E.coli中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素[58]。

由于V ector NTI suitor7.0软件模拟表达，可知mRNA结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。

本实验中重组表达质粒PrP-pET-32a（+）不稳定的原因可能是PrP对E.coli BL21（DE3）具有细胞毒性。

pET-32a（+）来源于pBR-322，pBR-322源于ColE1。

ColE1、pBR-322 、pET-32a（+）都失去了分配功能区par。

而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。

功能区par对质粒PrP-pET-32a（+）的稳定性是不可缺少的[4]。

缺少功能区par的pET-32a （+）质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去，无细胞毒性时约98% E.coli BL21（DE3）会带有质粒（见《pET System Manual》34页）。

表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的AMP。

【β-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的AMP（见《pET System Manual》33页）】。

这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。

本实验证实约60%以上的细菌无质粒。

鉴于以上原因，本实验将融合蛋白Trx-PrP C27-30表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达。

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化陈立明;庞欢瑛;简纪常;吴灶和【摘要】根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度.结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37C、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2014(034)003【总页数】6页(P52-57)【关键词】溶藻弧菌;dtd;基因克隆;原核表达;条件优化【作者】陈立明;庞欢瑛;简纪常;吴灶和【作者单位】广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088;广东省教育厅水产经济动物病害控制重点实验室,广东湛江524088;仲恺农业工程学院,广东广州510225【正文语种】中文【中图分类】S941溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)属于弧菌科(Vibrionaceae)，弧菌属(Vibrio)，又名藻朊酸弧菌、解藻酸弧菌、解藻朊酸内克氏菌[1]，是一种嗜盐嗜温、兼性厌氧的海生革兰氏阴性短杆细菌。

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原核表达条件优化
影响E.coli中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素[58]。

由于Vector NTI suitor7.0软件模拟表达，可知mRNA结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。

本实验中重组表达质粒PrP-pET-32a（+）不稳定的原因可能是PrP对E.coli BL21（DE3）具有细胞毒性。

pET-32a（+）来源于pBR-322，pBR-322源于ColE1。

ColE1、pBR-322 、pET-32a（+）都失去了分配功能区par。

而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。

功能区par对质粒PrP-pET-32a（+）的稳定性是不可缺少的[4]。

表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的AMP。

【β-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的AMP（见《pET System Manual》33页）】。

这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。

本实验证实约60%以上的细菌无质粒。

在温度、AMP浓度、培养基等诸多影响质粒PrP-pET-32a（+）稳定性的因素中，以温度影响最为明显。

实验结果显示，37℃条件下约60%以上的细菌无质粒PrP-pET-32a（+），25℃条件下失去质粒PrP-pET-32a（+）的细菌在约10%以内。

其他条件不变，AMP浓度在100 ug/ml以上细菌质粒PrP-pET-32a（+）基本稳定。

随AMP浓度增加平板上的菌落逐渐变小，表明AMP可抑制细菌生长。

不同培养基对
PrP-pET-32a（+）的稳定性无明显影响，但TB培养基可提高蛋白表达量。

实验发现TB培养基比LB提高蛋白表达量约在5-10%之间。

本实验中PrP-pET-32a（+）稳定性高则融合蛋白Trx-PrP C27-30表达量高。

温度因素是影响本实验融合蛋白表达量最为明显的因素。

如图2-9，37℃条件下，其他条件不管如何改变，都未见融合蛋白Trx-PrP C27-30有明显表达。

图2-9 37℃不同诱导条件下融合蛋白Trx-PrP C27-30表达量的影响
Fig.2-9 Expression of Trx-PrP C27-30 fusion protein treated with different condition
at 37℃（12％ SDS-PAGE）
1２ pET-32a（+）control
３ induce at 37℃，AMP 50 ug/ml，IPTG 1 mM，1h
4 induce at 37℃，AMP 50 ug/ml，IPTG 1 mM，3h
5 induce at 37℃，AMP 50 ug/ml，IPTG 1 mM，12h
6 induce at 37℃，AMP 50 ug/ml，IPTG 5 mM，12h
7 induce at 37℃，AMP 100 ug/ml，IPTG 1 mM，12h
8 induce at 37℃，AMP 200 ug/ml，IPTG 1 mM，12h
9 induce at 37℃，AMP 50 ug/ml，IPTG 1 mM，12h
10 induce at 37℃，AMP 50 ug/ml，lactose 1%，12h
带ColE1复制起点的质粒，在加入氯霉素以后可以抑制细菌蛋白的生长，但不抑制质粒拷贝数的增加。

虽然没有文献可以解释这一现象，我们仍可以推测导致质粒拷贝数增加的蛋白合成系统是独立于细菌蛋白合成系统的，这个系统以一种相对稳定速度合成质粒。

所以降低细菌生长速度可增加细菌质粒拷贝数（并间接增加质粒稳定性）
从而增加融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达量。

本实验在37℃条件下，诱导前OD
600
为
0.6时开始诱导，4 h诱导培养，菌液的OD
600
值可达5，未见融合蛋白Trx-PrP C27-30
的明显表达；25℃条件下，诱导前OD
600
为1.5，更换等体积新鲜TB诱导4h，菌液的
OD
600
值可达2.3，融合蛋白Trx-PrP C27-30的最高表达量接近50%。

变化如此之大，出乎意料。

AMP浓度是继温度条件以后，影响融合蛋白表达量的另一个重要因素。

当其他条件不变，AMP浓度在50 ug/ml以下时，融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达量在20%以下；AMP浓度在200-500 ug/ml条件下，Trx-PrP C27-30呈高表达，表达量接近50%。

但AMP 浓度加到500 ug/mlAMP时则会使细菌的生长速度下降。

说明一定的选择压力可以提高质粒的稳定性从而提高融合蛋白表达量，200 ug/ml的AMP浓度为最适表达浓度。

不同IPTG浓度对融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达量无明显影响，0.1 mM的IPTG即可达到38%的表达量，1 mM IPTG可达最高表达量；乳糖诱导条件下融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达量随乳糖浓度增加而逐渐增加，但乳糖诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30的最高表达量（39.6%）比IPTG诱导的最高表达量（45.7%）低。

可能是由于乳糖提高了细菌的生长速度，间接降低了质粒的拷贝数，导致表达量下降。

乳糖浓度太低时，细菌在诱导表达早期已将乳糖消耗干净，造成诱导不足；乳糖浓度太高，细菌的生长速度过快，降低了质粒的拷贝数，融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达量又有所下降。

所以乳糖诱导表现为融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达量，随乳糖浓度增加由低到高，然后又略有下降。

当其他条件不变时，用3%乳糖诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30可达最高表达量，而8%乳糖诱导表达量有所下降。

随诱导时间的增加融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达量均匀增加，3 h以后接近最
高表达量，过夜诱导最高表达量可达47%，甚至接近50%。

诱导过程中细菌OD
600
变化不大，由 1.5上升为 2.0-2.5。

与此不同的是，37℃诱导条件下，无融合蛋白
Trx-PrP C27-30表达时，细菌OD
600值变化很大，诱导4 h，细菌OD
600
值由0.6上升为5，
表明细菌分裂并不是表达融合蛋白所需，甚至可导致蛋白表达量下降。

细菌生长接近饱和以后，更换等体积新鲜培养基诱导，可获得高的蛋白表达量。

2-2，表2-5）。

图2-2不同诱导时间对融合蛋白Trx-PrP C27-30表达量的影响（12% SDS-PAGE，IPTG 1 mM , AMP
200 ug/ml）
Fig.2-2 Expression of Trx-PrP C27-30fusion protein treated with different culture time（12% SDS-PAGE，IPTG 1 mM , AMP 200 ug/ml）
1，2 pET-32a（+）control pET-32a（+）对照
3 uninduced bacterior 诱导前菌体
M protein marker（KD）蛋白分子量标志
4—8 2 h、3 h、4 h、5 h、overnight induction 2、 3、4、5小时、过夜诱导
在培养或者是发酵的培养基中常需要加入一些一些无机盐，比如：氯化钠、磷酸二氢钾、硫酸氢二钾、硫酸亚铁、硫酸镁、碳酸钙、硫酸氨、硝酸钾等，它们起着不同的的作用。

1.Nacl平衡渗透压，在培养基中起调节渗透压作用；
2.Mgso4：mg2+是EMP 、TCA途径及赖氨酸产生重要的酶激活剂；
3.磷酸盐：（1）P是蛋白质、核酸的组成部分。

（2）、ADP 、ATP的组成部分,提供能量（3）、磷是细胞膜的组成部分。

（4）、在培养基中起缓冲作用。

4.FeSO4：组成细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化氢酶的活性基团。

Fe2+还是是电子呼吸传递链的重要成员之一。

5.(NH4)2so4：供无机氮源。

6.氨水：起着调发酵液的PH值作用
7.碳酸钙：起着调发酵液的PH值作用
8.KHPO4/KH2PO4中。

的K+是某些酶（果糖激酶、磷酸丙酮酸转磷酸酶等）的辅因子；维持电位差和渗透压；而且还是起着重要的PH值缓冲作用。