家蝇Defensin基因原核表达条件的优化及其抑菌活性
・２４５８・ 广东医学２０１３年８月第３４卷第１６期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ａｕｇ．２０１３．Ｖｏ１．３４．Ｎｏ．１６
家蝇Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因原核表达条件的优化及其
抑菌活性
许琴英 ，朱家勇 ，金小宝。，徐建华
。广东医学院寄生虫学暨临床寄生虫检验学教研室（广东湛江５２４０２３）； 广东省生物活性药物研究重点实验室
（广州５１０００６）
【摘要】 目的优化家蝇Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因原核表达条件，并初步研究其抑菌活性。方法Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因成熟肽
被克隆入ｐＧＥＸ一４Ｔ一１原核表达载体中，构建重组质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ，并转化宿主菌后诱导表达，表达
过程中对茵液起始浓度、ＩＰＴＧ浓度、诱导温度和时间进行优化。采用亲和层析法分离纯化融合蛋白．ＳＤＳ—ＰＡＧＥ
鉴定目的蛋白的表达情况和分子量。用凝血酶切除谷胱甘肽标签，并通过体外抑茵实验检测其抗茵活性。结果
成功构建重组质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ，目的基因能够在大肠埃希菌内高效表达，分子量为４ ｋＤ，与预期值
一致，表达量约达４０％。抑茵实验显示其对大肠埃希茵Ｋ Ｄ 生长有一定的抑制作用。结论 本实验为家蝇
Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因功能的深入研究奠定了工作基础。
【关键词】抗茵肽；表达；活性；Ｄｅｆｅｎｓｉｎ
昆虫防御素（Ｄｅｆｅｎｓｉｎ）是一类碱性小分子多肽，具
有热稳定性强、诱导源的非专一性和抗菌谱广等特点，
有望开发成一类新型的多肽抗生素 。由于其在组
织中含量低，分离获得大量的天然产物很困难，而人工
合成多肽的成本高，限制了其应用前景。因此，利用基
因重组技术克隆表达基因是获取昆虫抗菌肽的理想途
径。大肠埃希菌表达系统是最常用的基因工程表达系
统，研究者已利用该系统表达了多种蛋白。２００５年１
月至２００７年１２月，本研究在实验室已构建的含有家
蝇幼虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因的重组质粒ｐＵＣｍ—Ｔ／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ
的基础上 ，将家蝇幼虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因克隆入原核表
达载体，对其表达条件进行优化，并对表达产物进行抑
菌活性的研究。
１材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 受体菌与载体 大肠埃希菌ＤＨ５ｃ￣、ＢＬ２１
（ＤＥ。）和ｐＵＣｍ—Ｔ／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ重组质粒为广东省生物
活性药物研究重点实验室保存，原核表达载体ｐＧＥＸ一
４Ｔ一１购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司。
１．１．２主要试剂 本实验所用分子生物学相关试剂
均购自ＴａＫａＲａ公司；ＰＶＤＦ膜、蛋白质标准分子质量
为华美生物公司产品；丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ 一亚甲叉双丙
烯酰胺、考马斯亮蓝、氨苄青霉素和卡那霉素、羊抗小
鼠ＩｇＧ２过氧化物酶、小鼠抗ＧＳＴ单抗等为北京鼎国生
物工程有限公司产品；ＧＳＴｒａｐ。。 ＦＦ和ＨｉＴｒａｐ Ｂｅｎｚａｍｉ．
ｄｉｎｅ ＦＦ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）为Ａｍｅ￣ｈａｍ公司产品。
１．２ 方法
１．２．１ 引物的设计与合成根据Ｇｅｎｂａｎｋ公布的家
蝇成虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因（登陆号：ＡＹ２６０１５２），设计特异
△通信作者。Ｅ—ｍａｉｌ：ｚｈｕｊｙ＠ｇｄｐｕ．ｅｄｕ．ｃａ 弓Ｉ物Ｐｍｌ（５ 一ｃｇｃｇｇａｔｃｃｇｃｔａｃｔｔｇｃｇａｔｔｔｇｔ一３ ，含ＢａｍＨ Ｉ
酶切位点）和Ｐｍ２（５ 一ｃｇｃｔｃｇａｇａｃａｃｃｔｃａｇｔｔａｃｇｇｃ一３ ，含
Ｘｈｏ Ｉ酶切位点），拟扩增家蝇幼虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因的编
码序列。引物由北京三博合成。
１．２．２ 家蝇Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因原核表达质粒构建 以
ｐＵＣｍ—Ｔ／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ重组质粒为模板，以Ｐｍｌ、Ｐｍ２为引
物进行ＰＣＲ，扩增家蝇幼虫Ｄｅｆｅｎｓｉｎ基因的序列；扩增
产物纯化后以ＢａｍＨ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ对其进行酶切；此酶
切产物再与经ＢａｍＨ Ｉ和Ｘｈｏ Ｉ酶切后的ｐＧＥＸ一
４Ｔ一１原核表达载体连接，构建重组质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一
１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ。此重组质粒经测序正确后转化大肠埃希
菌ＢＬ２１（ＤＥ ），筛选阳性表达菌。
１．２．３ ｐＧＥＸ一４Ｔ一１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ重组质粒表达条件的优化
参照文献［４］的方法，挑取含有重组质粒ｐＧＥＸ一４Ｔ一
１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ的ＢＩ２１（ＤＥ ）单菌落进行培养，检测目的
基因在不同条件的表达水平。（１）菌液的起始浓度不
同（０Ｄ 为０．４、０．６、０．８、１．０）。（２）ＩｌＹＦＧ的诱导终浓
度不同（０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２ ｍｍｏｌｆＬ）。（３）在
同一ＩＰＴＧ的浓度下，培养温度不同（２８℃、３０℃、３５℃、
３７￣Ｃ）。（４）在同一ＩＰＴＧ的浓度下，培养时间不同（２、
４、６、８ ｈ）。对上述实验菌液各取１ ｍＬ经１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ
离心去上清处理后，进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，分析目的
蛋白的表达量，以确定最佳原核载体的表达条件。具
体操作参照文献［４］：４％浓缩胶，１５％分离胶。
１．２．４表达产物的的可溶性分析挑取一个ｐＧＥＸ一
４Ｔ一１／Ｄｅｆｅｎｓｉｎ单菌落加入到５ ｍＬ ＬＢ液体培养基中，
３７℃，２８０ ｒ／ｍｉｎ振摇８～１２ ｈ。将此菌液按１：１００比例
接种到新鲜的抗性ＬＢ液培中，在以上筛选优化的诱导
条件下表达后，用化学和超声方法裂解细菌，对表达产
物进行可溶性分析。将诱导前后对照、上清液和沉淀
物样品处理后进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，
检测融合蛋白的 广东医学２０１３年８月第３４卷第１６期 Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ ＪｏｕｒｎＭ Ａｕｇ．２０１３，Ｖｏ１．３４，Ｎｏ．１６
Ｄｅｆｅｎｓｉｎ在ＢＩ２１（ＤＥ ）内的表达量的最佳条件，但表
达蛋白大部分形成包涵体。为防止表达蛋白形成包涵
体，对诱导表达时的条件作了调整，发现较低的ＩＰＴＧ
浓度（０．４ ｍｍｏｌ／Ｌ）、低温（３０￣Ｃ左右）诱导表达时间６ ｈ
的重组蛋白主要在破菌后的上清中，以可溶性形式表
达，薄层扫描分析的结果表明重组蛋白约占菌体总蛋白
的４０％。发现在高表达量的同时可得到大量高效表达
的可溶性蛋白，这为蛋白的纯化带来很大的方便。
本研究可溶形式存在的表达产物可用ＧＳＴｒａｐ ＦＦ
进行亲和层析柱纯化，其成分Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ
是由载体琼脂糖一４Ｂ与配基ＧＳＴ偶联而成的，配基
ＧＳＴ可以特异性结合带有ＧＳＴ标记的融合蛋白，最后
用还原型的ＧＳＴ可以温和地把带ＧＳＴ标记的融合蛋
白洗脱下来。ＳＤＳ—ＰＡＧＥ分析，显示纯化获得较满意
效果。融合蛋白在较高的浓度下，表现出对大肠埃希
菌生长的抑制，说明融合蛋白具有部分抗菌活性，可利
用该特性，在体内检测Ｄｅｆｅｎｓｉｎ的活性。但ＧＳＴ标签
分子量大，对目的蛋白理化性质影响大，采用凝血酶酶
切ＧＳＴ，去除可获得天然的目的蛋白。而抑菌活性试 ・２４６１・
验表明，纯化后的Ｄｅｆｅｎｓｉｎ蛋白具有一定的抑菌活性。
参考文献
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Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ，２０１０，３９３（２）：２９０—２９６．
（收稿日期：２０１３—０４—２６编辑：朱绍煜）
血液透析治疗老年硬膜下出血尿毒症患者１例
范立明，钟先阳，童俊容，张虹
广州军区广州总医院肾脏内科（广州５１００１０）
患者，男，８３岁，因发现血肌酐升 高２年余，突发左侧肢体乏力４ ｄ于 ２０１２年９月１２日入院。２０１０年发现
血肌酐升高，一直服用中药治疗，血肌
酐波动在２００～２５０￣ｍｏｌ／Ｌ之间；２０１２
年７月人我科住院治疗，查肾功能提示 ＢＵＮ ２２．７ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｓｃｒ ３７８ ｐ．ｍｏｌ／Ｌ，ＣＣｒ
１３．２ ｍｌＭｍｉｎ，诊断为慢性肾功能衰竭，
给予护肾排毒、降压等处理，并行左前
臂动静脉内瘘术后出院，未行透析治
疗；２０１２年９月８日出现左侧肢体乏
力，伴头痛，自行服药效果差。发病以
来患者尿量正常，双下肢无水肿；体格 检查：ＢＰ １６５／７０ ｍｍＨｇ，慢性病容，心
肺无明显异常，口角左歪，左侧肢体肌
力＋＋＋，右侧肢体肌力＋＋＋＋；病理
征未引出。检查结果：’肾功能：ＢＵＮ：
４０．０ ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｓｃｒ ６４１￣ｍｏｌ／Ｌ，电解质：
Ｋ：６．９ ｍｍｏｌ／Ｌ，血常规提示：ｌｉｂ ６９ ｇ／Ｌ，
Ｐｌｔ：９５×１０ ・Ｌ～；颅脑ＣＴ提示右侧颞
顶部硬膜下出血。诊断（１）慢性肾功能
不全尿毒症期；（２）右侧颞顶部硬膜下
出血；（３）高钾血症。经与患者及家属 沟通并征得同意签字后，给予行血液透
析治疗，同时给予降压、纠正贫血及对
症处理。透析方案：予碳酸氢盐透析
液，左前臂动静脉内瘘为血管通路，无
肝素透析，先安排３次诱导透析，诱导
透析期间血流量波动在１５０—２５０ ｍＬ／ ｍｉｎ之问，未脱水，诱导透析３次后改
行规律血透，透析过程中嘱患者避免情
绪激动。
诱导透析第３次时，患者出现四肢
抽搐，牙关紧闭，持续约５０ Ｓ，立即给予
停止透析，静脉滴注甘露醇等处理，之
后多次发作四肢抽搐，请神经内科会
诊，急诊复查颅脑ＣＴ硬膜下出血与前
大致相仿；请神经外科医生会诊，考虑
硬膜下出血量少，脑组织无明显受压，
中线居中，脑室脑池未见受压，暂无手
术指征。神经内科会诊后考虑症状性
癫痫，给予口服卡马西平、肌肉注射苯
巴比妥钠等处理后症状逐渐好转；之后 继续无肝素透析，患者未再发作癫痫，
１１月５日复查颅脑ＣＴ提示硬膜下出
家蝇Actin-5 C基因启动子的生物信息学分析及载体构建
第
495年第月期 贵州医科大学学报
Vol.4
4 No.3
年'月 JOURNAL OF GUIZHOU MEDICAL UNIVERSITY
2778.3
-基础研究•
家蝇
Actig-CC基因启动子的生物信息学分析及载体
构建
* *
* 7
基金项目］国家自然科学基金（
1560253）
* *通信作者
E-maii: 1gmxP27@ sina. com王蓝晨，王昱，王颖，杨仕赛，朱贵明…
(贵州医科大学生物与工程学院实验中心，贵州贵阳
550025)
［摘 要］
目的 运用生物信息学分析家蝇(Musco domestico
L.)肌动蛋白2C(Actig-bC)基因，构建Actig-bC启
动子双荧光素酶报告基因表达载体。方法 使用伯克利果蝇基因组计划(
BDGP)在线分析软件
'Promoter 2.0和
在线比对启动子网站
(FPROM)等多种启动子预测工具，分析、预测家蝇肌动蛋白A
c0
c-
5C基因
5,端上游非编码
区，根据预测结果构建截短式启动子萤火虫荧光素酶报告基因重组质粒，转染草地贪夜蛾卵巢细胞系
ee细胞，
并使用反转录聚合酶链反应
(RT-PCR)进行萤火虫荧光素酶报告基因的检测。结果Aetm-5C基因
5,端上游的
-2 609 - -94 bp,预测有启动活性，且分值达
0 8分以上，其中
-2 198〜
-2 109 bp分值最高、达
0 98分;在
-
220 bp和
-1 444 bp处分别检测到
CAAT和
TATA盒信号，经比较取最有可能的
1 156 bp(
- 1 236 --80 bp)、
1 745 bp(
- 1 825 - -80 bp)及
2 555 bp(
-2 139 - -80 bp)截断启动子片段，构建 pGL3P156、
pGL3-t745 及
pGL3-2459质粒
.RT-PCR检测到
3种重组质粒中的萤火虫荧光素酶报告基因转录成功。结论 生物信息学预测
工具研究家蝇AiSC基因启动子可以简化认知基因的过程，根据预测结果构建了家蝇ActibC基因萤火虫荧
蝇蛆抗菌肽的抑菌活性及其理化特性的探究
绿洲农业科学与工程2卷
收稿日期院2016-01-18基金项目院国家自然科学基金资助项目渊31060281冤曰石河子大学校级资助项目渊SRP2016035冤联系方式院王旭东渊1994-冤袁男袁汉族袁本科生曰王志涛(1989-)袁男袁汉族袁硕士研究生.通讯作者院申红袁蒙古族袁教授袁研究方向为动物生理与生化袁E-mail院shenhong98@.王俊刚袁汉族袁教授袁研究方向为农业昆虫与害虫防治袁E-mail院
jungangwang98@蝇蛆抗菌肽的抑菌活性及其理化特性的探究
王旭东1袁王志涛1袁王菲1袁王振1袁申红1袁王俊刚2
渊1石河子大学动物科技学院袁新疆石河子832003曰2石河子大学农学院袁新疆石河子832003冤
摘要院为了获得具有较高抑菌活性的蝇蛆抗菌肽袁并将其作为抗生素替代品应用于畜牧养殖业袁本研究通过G-25和G-50凝胶柱层析对蝇蛆抗菌肽粗提液进行纯化得到抗菌活性较高蝇蛆抗菌肽组分袁测定其抑菌活性的同时开展其热稳定性尧反复冻融稳定性及不同pH对其活性影响研究遥结果显示院蝇蛆抗菌肽粗提液对大肠杆菌尧金黄色葡萄球菌尧沙门氏菌均有显著的抑制作用曰利用SDS-PAGE技术袁鉴定纯化的蝇蛆抗菌肽的蛋白质分子量约为10kD曰蝇蛆抗菌肽具有较好的热稳定性曰反复冻融对其抗菌活性的影响无显著差异袁超过8次后抑菌活性受到抑制袁但仍具有抑菌活性曰用不同pH作用蝇蛆抗菌肽测定其酸碱稳定性袁当pH为4.0要9.0的范围内袁蝇蛆抗菌肽的抑菌活性间差异不显著渊P跃0.05冤袁pH达到10.0时袁抑菌活性明显降低袁说明强碱性条件会影响蝇蛆抗菌肽的抑菌活性遥本研究对蝇蛆抗菌肽作为绿色抗生素替代品用于畜牧养殖业的进一步开发与利用提供了科学依据遥关键词院蝇蛆曰抗菌肽曰纯化曰抑菌活性
PhysicalandChemicalCharacteristicsandAntibacterialActivityof
家蝇几丁质酶基因的序列分析、克隆和诱导表达
５７０ 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ２０１２， ２８ （６） ＤＯＩ：１０ ３９６９／ｃｊｚ．ｊ ｉｓｓｎ １００２—２６９４ ２０１２．０６ ０１１ 家蝇几丁质酶基因的序列分析、克隆和诱导表达 国 果，吴建伟，吴沁怡，付 萍，张 勇 ＊ 摘 要：目的 对ＥＳＴ筛选得到的家蝇几丁质酶Ｉ（ＭＤＣ Ｉ）基因进行序列分析，克隆其ｃＤＮＡ序列并在大肠杆菌中表 达。方法 采用ＥＳＴ测序技术从已构建的家蝇幼虫ｃＤＮＡ质粒文库中筛选到ＭＤＣ Ｉ基因，对其进行序列测定和分析。以 该基因的ｃＤＮＡ文库质粒为模板，通过ＰＣＲ方法对ＭＤＣ Ｉ基因进行扩增，以ｐＥＴ ２８ａ（＋）为载体构建重组质粒，再转化到表 达宿主菌大肠杆菌ＢＩ ２１（ＤＥ３）中，ＩＰＴＧ诱导表达。表达产物通过十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳（ｓＤ ＰＡＧＥ）进行 鉴定。结果 ＭＤＣ Ｉ基因全长７５ｌ ｂｐ，编码２５１个氨基酸，理论分子量２８．６２家ｋＤａ；等电点５．７８，有１个ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｌ８家族 的活性位点。构建了具有正确基因序列的ＭＤＣ Ｉ重组表达质粒，重组蛋白在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中表达。结论 ＭＤＣ Ｉ 基因可在原核表达系统中表达，为进一步研究该蛋白的生物学、免疫学活性奠定了基础。 关键词：家蝇；几丁质酶；序列分析；基因克隆；表达 中图分类号：Ｒ３７ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２—２６９４（２０１２）０６—０５７０—０４ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ，ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ Ｉ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｏｕｓｅｆｌｙ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ） ＧＵＯ Ｇｕｏ，ＷＵ Ｊｉａｎ—ｗｅｉ，ＷＵ Ｑｉｎ—ｙｉ，ＦＵ Ｐｉｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｙｏｎｇ （Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５０００４，Ｃｈｉｎａ） ＡＢＳＴＲＡＣＴ：Ｔｈｅ ａｉｍ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｉｓ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ＭＤＣ Ｉ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ Ｉ），ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈａｔ ｇｅｎｅ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｅｄ ａ ２５１－ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ａｎ ＮＨ ２ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （１—２２）．Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｉｎｓｅｃｔ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｗａｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ６Ｏ ａｎｄ ７０ ．Ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｉｔｈ ａ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕ— ｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ２８．６２ ｋＤａ ａｎｄ ｐＩ ｏｆ ５．７８，ｈａｄ ｏｎｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｏｆ ｆａｍｉｌｙ １８ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ．Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ＭＤＣ １ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）。ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗａｓ ｉｎｓｅｒｔｅｄ ｉｎｔｏ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ ２８ａ（＋）ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ．Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＳＤＡ ＰＡＧＥ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｃｔ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＩ ２ ｌ（ＤＥ３）．Ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｃｏｒｒｅｃｔｌｙ，ａｎｄ ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｏｕｌｄ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈｅｓ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｉｎ ｈｏｕｓｅｆｌｙ． ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ；ｃｈｉｔｉｎａｓｅ；ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ；ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（Ｎｏ．８１ １６０２０４，３０９６０３４３），ｔｈｅ Ｆｕｎｄ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ（Ｎｏ．［２０１０］３１６０），ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｏｃｔｏｒａｌ Ｐｒｏ— ｇｒａｍ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ（Ｎｏ．２０１０５２１５１２０００１）． 几丁质是构成大多数真菌细胞壁的主要成分， 同时也广泛存在于节肢动物外壳和软体动物中。它 不仅是昆虫的重要结构组织，也是昆虫防止机械损 伤和生物危害的屏障。几丁质酶（ｃｈｉｔｉｎａｓｅ）是几丁 ＊国家自然科学基金（８１１６０２０４，３０９６０３４３）；贵州省科技厅基金（黔 科合［２ＯｌＯ］３１６０）；高校博士点学科专项科研基金 （２０１０５２１ ５１ ２０００１） 作者单位：贵阳医学院寄生虫学教研室，贵阳 ５５０００４； Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｇ６１６＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｒｌ 质降解酶系重要成员，属于糖苷水解酶１８家族 ＧＨ１８，能够将几丁质聚合物分解成壳糖乙糖苷和 乙酰葡糖胺糖苷两个部分［１］。该酶广泛存在于各种 真菌、植物、昆虫和鱼类等生物中。催化水解昆虫几 丁质的酶主要是几丁质酶，通过阻断几丁质酶，可以 阻止昆虫蜕皮和围食膜再生，以达到杀灭昆虫的目 的［２ ］。因此，研究获取昆虫来源的几丁质酶可以作
家蝇几丁质酶基因的序列分析、克隆和诱导表达 2
家蝇几丁质酶基因的序列分析、克隆和诱导表达
国果;吴建伟;吴沁怡;付萍;张勇
【摘 要】The aim of this study is to analyze and predict the structure and
characteristics of genes and encoding proteins of MDC Ⅰ (Musca
domestica chitinase Ⅰ ), with the methods of cloning and expressing that
gene. Sequence analysis revealed that the open reading frame of the
cDNA encoded a 251-amino acid protein, which contained an NH2-terminal signal sequence (1-22). The sequence identified with other insect
chitinase was between 60% and 70%. The protein, with a predicted
molecular weight of 28. 62 kDa and pi of 5. 78, had one active site of
family 18 chitinase. The gene coding for MDC I was amplified by
polymerase chain reaction (PCR), and then was inserted into vector pET
28a ( + ) and induced with IPTG. The recombinant protein in the
expression vector was analyzed by SDA-PAGE. Results indicated that the
果蝇防御素在毕赤酵母中的表达及活性检测
果蝇防御素在毕赤酵母中的表达及活性检测
金珊;张黎;曾庆韬
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2008(000)0z1
【摘 要】抗菌肽是昆虫感染细菌后,由血细胞及脂肪细胞在瞬时分泌的抗菌物质.具有广谱抗菌活性和抑杀耐药菌株等优点.抗菌肽不仅抗菌谱广,而且对某些真菌、原虫、病毒及肿瘤有一定的杀灭和抑制作用,还能加速免疫和伤口愈合过程.防御素是一类在自然界中广泛存在的、具有微生物抗性的小分子抗菌肽.利用PCR技术,以果蝇总DNA为模板,扩增出两端加入了连接接头的防御素基因,将接头处理成粘性末端,将防御素基因与分泌型酵母表达载体pHBM905B重组,构建重组酵母表达载体pHBM905B/defensin,经"三明治"夹心平板筛选及菌落PCR鉴定证明目的基因已整合入酵母染色体中.挑选阳性克隆经甲醇诱导表达,以SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,证明表达蛋白的相对分子量约为10kD,与预期结果一致.用琼脂糖扩散法检测上清液的生物学活性.可以观察到明显的抑菌圈,显示其具有较强的抗菌活性.同时表达产物有极强的热稳定性,展示了诱人的应用前景,为进一步的开发研究奠定了基础.
【总页数】6页(P456-461)
【作 者】金珊;张黎;曾庆韬
【作者单位】湖北大学生命科学学院,武汉,430062;湖北大学生命科学学院,武汉,430062;湖北大学生命科学学院,武汉,430062
【正文语种】中 文 【相关文献】
1.鼠防御素基因Crp4在大肠杆菌中的表达及活性检测 [J], 陈宝玉;宋德光;宋斯伟;查云峰;邓旭明;曾凡勤
2.鸡γ-干扰素在毕赤酵母中的表达及其生物活性检测 [J], 李亚玲;秦乐;张小荣;吴艳涛
3.猪β-防御素-2基因在大肠杆菌中的融合表达及抑菌活性检测 [J], 谢飞;吴雅琨;冯秋月;陈慧鑫;王安如;彭子欣
4.家蝇幼虫防御素基因MddⅠ在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性鉴定 [J], 傅小蒙;万玲;唐艳;孔令聪;裴志花;刘树明;马红霞
家蝇抗药性的分子遗传机制
家蝇抗药性的分子遗传机制
李梅;何凤琴;邱星辉
【期刊名称】《寄生虫与医学昆虫学报》
【年(卷),期】2005(012)004
【摘 要】综述了近年来家蝇抗药性分子机制的研究进展.脂族酯酶基因(MdaE7)在位置137(Gly)和251(Trp)的氨基酸突变可能与家蝇对有机磷抗性有关;谷胱苷肽-S-转移酶(GSTs)超量表达在家蝇对有机磷农药的抗性中起重要作用;有机磷抗性家蝇的AChE基因普遍存在Gly262Ala和Phe327Tyr突变.击倒抗性(kdr)和P450介导的代谢抗性是家蝇对DDT和拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的重要机制,电压门控钠离子通道的L1041F突变产生Kdr,而M918T和L1041F双突变导致超击倒抗性(super-kdr);P450介导的代谢抗性表现出进化可塑性的特点.有关家蝇抗性机制的阐明,可为抗性的检测和监测提供准确和方便的手段.
【总页数】7页(P238-244)
【作 者】李梅;何凤琴;邱星辉
【作者单位】中国科学院动物研究所,农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京,100080;中国科学院动物研究所,农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京,100080;中国科学院动物研究所,农业虫害鼠害综合治理研究国家重点实验室,北京,100080
【正文语种】中 文
【中图分类】Q96 【相关文献】
1.家蝇抗药性的分子机制:乙酰胆碱酯酶介导的抗药性 [J], 邱星辉
2.恶性疟原虫抗药性的分子遗传学机制 [J], Well.,TE;向选东
3.家蝇拟除虫菊酯抗药性的分子生物学监测 [J], 江毅民;黄炯烈;吴瑜
4.家蝇对高效氯氰菊酯抗药性机制的探索 [J], 胡文涛
5.害虫抗药性进化的遗传起源与分子机制 [J], 何月平;沈晋良
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家蝇抗菌肽基因Cecropin在COS-7细胞中的表达及产物活性初步研究
５６６ 中国人兽共患病学报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｚｏｏｎｏｓｅｓ ２００７．２３（６）
文章编号：１００２—２６９４（２００７）０６—０５６６—０３
家蝇抗菌肽基因Ｃｅｃｒｏｐｉｎ在ＣＯＳ一７细胞中的表达
及产物活性初步研究＊
金小宝，朱家勇，马 艳，刘雷山
摘 要：目的 初步研究家蝇抗菌肽Ｃｅｅｒｏｐｉｎ ｃＤＮＡ在非洲绿猴肾细胞株ＣＯＳ－７中的表达及其产物的抗菌作用。方法
以Ｃｅｅｒｏｐｉｎ基因为模板设计２条特异引物，扩增在Ｃ端含６×Ｈｉｓ标签的Ｃｅｃｒｏｐｉｎ开放阅读框序列，将此序列与真核表达
载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）进行重组，构建重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｃｅｃｒｏｐｉｎ－Ｈｉｓ＿６。以脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＴＭ ２ ０００为载体，对
ＣＯＳ－７细胞进行重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｃｅｅｒｏｐｉｎ－Ｈｉｓ＿６和空载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）的转染，７２ ｈ后收集细胞培养上清液，
表达产物经Ｈｉｓ－Ｔｒａｐ ＨＰ亲合层析柱分离纯化和Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤ ＰＡＧＥ电泳鉴定后，进行杀菌活性的初步检测。结果 转染了
重组质粒ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／Ｃｅｃｒｏｐｉｎ－Ｈｉｓ＿６细胞培养上清液的纯化物，行Ｔｒｉｃｉｎｅ－ＳＤ ＰＡＧＥ电泳得到与预期分子量大小相符 的单一目的条带，该纯化物对大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ 。Ｄ３ 具有一定的杀菌活性。结论 家蝇抗菌肽Ｃｅｅｒｏｐｉｎ ｅＤＮＡ在ＣＯＳ－７中
得到了正确表达。
关键词：天蚕素；真核表达；转染；杀菌活性
中图分类号：Ｒ３８４ 文献标识码：Ａ
Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ—ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｅｃｒｏｐｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎ ＣＯＳ－７ ｃｅｌｌｓ
ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｉｔｓ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ
ＪＩＮ Ｘｉａｏ—ｂａｏ，ＺＨＵ Ｊｉａ—ｙｏｎｇ，ＭＡ Ｙａｎ，ＬＩＵ Ｌｅｉ—ｓｈａｎ
家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)基因的克隆、序列分析及表达模式
家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)基因的克隆、序列分析及表达模式
魏川川;修江帆;胡亚;尚小丽;张迎春;吴建伟
【期刊名称】《环境昆虫学报》
【年(卷),期】2017(039)006
【摘 要】对家蝇3种丝氨酸蛋白酶抑制剂Serpin基因SP2、SP13和SP16进行克隆、序列分析和时空表达模式检测.运用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASy)和美国国家生物技术信息中心(NCBI)等有关的生物信息学分析工具,预测和分析3条Serpin基因编码蛋白质的结构与生物学功能.以RPS18(核糖体S18蛋白)为内参基因,采用实时荧光定量PCR(Real-Time PCR)技术检测3条Serpin基因在家蝇不同发育时期,以及家蝇3龄幼虫中脂肪体、唾液腺、中肠、马氏管和体壁的表达特征.SP2、SP13、SP16基因序列的开放阅读框ORF全长分别为1191 bp、1137 bp和1212 bp,分别编码含396、378和403个氨基酸残基的蛋白质,其理论分子量分别为45315.3 Da、43701.5 Da和45011.5 Da,等电点分别为9.01、5.98和6.04,蛋白质的N端都含有一段信号肽,并具有Serpin基因的保守结构域,属于Serpin家族.SP2和SP16在蛋白质的C端含反应中心环(Reactive center loop, RCL),而SP13 C端不含RCL.时空表达模式分析结果显示,SP2基因在2龄幼虫中的表达量最高,而雄蝇的表达量与卵期相比有所下调;SP13基因在蛹中的表达量最高,1龄幼虫和雌蝇中的表达量与卵期相近;SP16基因在2龄幼虫和3龄幼虫中的表达量最高,雄蝇与雌蝇的表达量与卵期相比有所下调.在家蝇3龄幼虫的各主要组织中,以体壁为参照,SP2基因在唾液腺表达水平最高,其次是脂肪体,中肠和马氏管均低于体壁;SP13基因在马氏管和脂肪体中的表达水平最高,中肠和唾液腺的表达量低于体壁;SP16基因在唾液腺、中肠、脂肪体和马氏管的表达量均低于体壁.推测Serpin基因在家蝇个体发育和免疫调节中起不同作用.%To probe into the cloning, sequence analysis and temporal expression
红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化
第30卷 第6期 广东海洋大学学报 Vol.30 No.6
2010年12月 Journal of Guangdong Ocean University Dec. 2010
收稿日期：2010-06-13 基金项目：国家自然科学基金“红笛鲷仔鱼抗菌免疫基因的克隆及表达时序研究”（40906073） 第一作者：魏世娜（1985－），女，硕士研究生，主要从事水产动物病害防治。Email : weishinazi@ 通讯作者：简纪常，教授，主要从事水产动物免疫学及病害控制。Email : jianjc@ 红笛鲷NCCRP-1基因原核表达条件的优化及纯化
魏世娜，王 蓓，鲁义善，吴灶和，简纪常
（广东海洋大学水产学院，广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室暨广东省高等学校水产经济动物病害控制重点实验室, 广东 湛江 524025）
摘 要：通过克隆编码红笛鲷（Lutjanus sanguineus）非特异性毒性细胞受体蛋白-1（nonspecific cytotoxic cell receptor
protein-1, NCCRP-1）成熟肽基因序列，然后与载体连接构建pET21a-NCCRP融合蛋白表达载体，将其转入大肠杆
菌BL21进行诱导表达并优化条件。SDS-PAGE分析表明，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度0.8 mmol/L、
37 ℃条件下培养3 h后表达量最大，分子大小与预期值相符，融合蛋白主要以包涵体形式高效表达，通过HisTrap HP
柱子使其得到进一步纯化；Western blot分析表明，该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合，说明
获得该表达产物。
关键词：红笛鲷；NCCRP-1基因；原核表达；条件优化； 纯化
中图分类号：S942.1 + Q344+.13 文献标志码：A 文章编号：1673-9159（2010）06-0025-06
人胰岛素基因在家蝇幼虫中的表达
人胰岛素基因在家蝇幼虫中的表达
夏平安;刘维全;崔保安;张红英
【期刊名称】《河南农业大学学报》
【年(卷),期】2006(040)004
【摘 要】构建了家蝇基因组文库,通过噬菌斑原位杂交技术从家蝇基因组文库中筛选出mdYP1克隆,并从mdYP1克隆中分离到含约1.7 kb 5'-上游区的家蝇卵黄蛋白-1基因组基因序列.PCR扩增出大小不同的4个启动子片段,分别插入到切除了CMV启动子的pCMV-GFP质粒中的绿色荧光蛋白报告基因上游,构建pMYP1-GFP,pMYP2-GFP,pMYP3-GFP和pMYP4-GFP 4个重组质粒,经电转移试验和荧光检测表明,P2(+684/+7),P3(+1165/+7)和P4(+1616/+7)3个启动子片段具有转录活性.将P2,P3分别插入到切除了CMV启动子的pCMV-ImINS重组质粒中的人胰岛素基因上游,构建pMYP2-ImINS和pMYP3-ImINS重组质粒,电转移新鲜家蝇卵,放射免疫分析法检测人胰岛素在蝇蛆中的表达水平.pMYP2-ImINS和pMYP3-ImINS组的人胰岛素表达量分别为29.6,22.1mU·L-1;阳性对照组为13.2
mU·L-1;阴性对照组为8.8 mU·L-1.结果说明P2启动子片段活性最强,同时又证明了内源性启动子能提高外源基因的表达效率.
【总页数】5页(P386-390)
【作 者】夏平安;刘维全;崔保安;张红英
【作者单位】河南农业大学牧医工程学院,河南,郑州,450002;中国农业大学生物学院,北京,100094;河南农业大学牧医工程学院,河南,郑州,450002;河南农业大学牧医工程学院,河南,郑州,450002 【正文语种】中 文
【中图分类】S969.453.1;Q785
【相关文献】
1.人胰岛素原基因在大肠杆菌中的可溶性表达及分离纯化研究 [J], 沈加斌;徐攀;李鑫雨;张立;郑海燕;雍彬