原核蛋白表达纯化条件优化方案

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维真生物-原核蛋白的表达、分离和纯化

原核蛋白的表达、分离和纯化实验原理：携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在37℃，IPTG 诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。

蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

实验材料：大肠杆菌BL21试剂、试剂盒：LB液体培养基、氨苄青霉素、Washing Buffer、Elution Buffer、IPTG、蒸馏水、胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠仪器、耗材：摇床、离心机、层析柱、离心管、移液枪、枪头盒、烧杯、玻璃棒实验步骤：一、试剂准备1. LB液体培养基：Trytone 10 g，yeast extract 5 g，NaCl 10 g，用蒸馏水配至1000 mL。

2. 氨苄青霉素：100 mg/mL。

3. 上样缓冲液：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8M Urea，10 mM2-ME，pH8.0。

4. Washing Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mM Tris，8 M Urea，pH6.3。

5. Elution Buffer：100 mM NaH2PO4，10 mMTris，8M Urea，500 mM Imidazole，pH8.0。

6. IPTG：100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。

二、获得目的基因1. 通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

2. 通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。

可溶性GST-CRH蛋白原核表达条件的优化及纯化

可溶性GST-CRH 蛋白原核表达条件的优化及纯化郁硕1，陈锋2，刘英富3，霍景瑞2，李光宗2，张益2，丁辉2，樊毫军1△摘要：目的通过谷胱甘肽巯基转移酶（GST ）-促肾上腺皮质激素释放激素（CRH ）原核表达条件的优化及纯化，获得可溶性好、纯度高的重组GST-CRH 蛋白。

方法通过对GST-CRH 转化菌表达温度、菌液密度（OD 600）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG ）浓度以及诱导时间的摸索，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE ）检测可溶性GST-CRH 蛋白的表达情况，GST 琼脂糖凝胶进行GST-CRH 的纯化，Western Blot 对表达的目的蛋白进一步鉴定。

结果起始OD 6000.8、IPTG 工作浓度0.1mmol/L 、30℃诱导8h 为GST-CRH 最优诱导条件；融合蛋白经Western Blot 鉴定为表达的GST-CRH ，纯化后纯度＞95%。

结论建立了GST-CRH 的原核表达及纯化方法，获得了高纯度的GST-CRH 可溶性蛋白。

关键词：促肾上腺皮质素释放激素；谷胱甘肽巯基转移酶；原核表达；纯化中图分类号：R392-33文献标志码：ADOI ：10.11958/20161302Optimization of prokaryotic expression condition and purification of soluble GST-CRH proteinYU Shuo 1,CHEN Feng 2,LIU Ying-fu 3,HUO Jing-rui 2,LI Guang-zong 2,ZHANG Yi 2,DING Hui 2,FAN Hao-jun 1△1Respiratory Department,the Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Henan 453000,China;2Institute for Disaster and Emergency Rescue Medicine,the Affiliated Hospital of Logistics University of Chinese People ’s Armed PoliceForce;3Department of Cell Biology,Logistics University of Chinese People ’s Armed Police Force△Corresponding Author E-mail:fanhaojun999@Abstract:Objective To obtain the recombinant corticotropin releasing hormone (CRH)protein with soluble,highpurity protein through optimizing prokaryotic expression condition and purifying glutathione thiol transferase (GST)-CRH protein.MethodsTo detect the expression of soluble CRH protein through grope of the host strain GST-CRH temperatureof induction expression,the host strain concentration (OD 600),IPTG concentration and induction time,the purification of GST-CRH was performed by GST-CRH agarose gel.Western Blot assay was used for the expression identification of the target protein.ResultsThe optimal conditions for the induction of CRH protein were determined:temperature of 30℃,IPTG induced concentration 0.1mmol/L,bacteria density (OD 600)0.8,the induction time of 8hours,purified GST-CRH >95%fusion protein was obtained.ConclusionThe optimal expression conditions of GST-CRH are obtained,and thesoluble protein of high purity GST-CRH is also obtained.Key words:corticotropin-releasing hormone;glutathione s-transferase;prokaryotic expression;purification基金项目：天津市科技计划项目（14ZCDZSY00033）；全军重点实验室开放基金（JY1402）；武警后勤学院附属医院科研平台开放基金（WYFKFM201602、WYKFZ201603）作者单位：1河南新乡医学院附属医院呼吸内科（邮编453000）；2武警后勤学院附属医院救援医学研究所；3武警后勤学院细胞生物学教研室作者简介：郁硕（1988），男，硕士，住院医师，主要从事呼吸与危重症专业方面的研究△通讯作者E-mail ：fanhaojun999@促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropinreleasing hormone ，CRH ）能够刺激垂体促肾上腺皮质激素的释放［1］，是下丘脑-垂体-肾上腺轴的主要调节者［2］，在应激反应中发挥着重要的调节作用。

红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化

ＡｑｕａｔｉｃＥｃｏｎｏｍｉｃＡｎｉｍａｌｓｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＨｉｇｈｅｒＥｄｕｃａｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，Ｚｈａｎｊｉａｎｇ５２４０２５，Ｃｈｉｎａ；
达量最大，分子质量大小与预测值相符，该蛋白主要以包涵体形式存在。利用ＨｉｓＴｒａｐＨＰ亲和层析柱使ＴｄＴ蛋白
得到进一步纯化，最佳咪唑洗脱浓度为３００ｍｍｏｌ／Ｌ，Ｗｅｓｔｅｎｒｂｌｏｔ分析显示，该融合蛋白可与鼠抗Ｈｉｓ —ｔａｇ单克隆抗体发生特异性的结合，表明表达蛋白为目的蛋白。关键词：红笛鲷；ｔｄｔ基因；原核表达；优化；纯化；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析
２．ＺｈｏｎｇｋａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｙｔｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ５１０２２５，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｃｏｄｉｎｇｔｈｅｍａｔｕｒｅｐｅｐｉｆｄｅＬｕｔｊｎＵａＳｓａｎｇｕｉｎｅｕｓＴｅｒｍｉｎａｌ
第３３卷Байду номын сангаас
第１期
广东海洋大学学报
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｕａｎｇｄｏｎｇＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

原核表达条件的优化

【专题讨论】原核表达条件优化！会不会是蛋白质的表达量低，电泳并不能反映出来，典型的例子是干扰素，虽然电泳没有新生条带，但是裂解上清的活性却很高。

“疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白，42度发酵，可抑制宿主菌蛋白表达疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白?那条带也挂在亲合柱子上的，发酵的细菌蛋白却没有。

挂在亲合柱子上,也有可能是非特异性条带，如用HIS TAG亲合柱，加大米错量试一下。

胞内表达有生物活性蛋白的一些策略包涵体的形成仍然是胞内基因表达巨大障碍，考虑到易聚合蛋白质复性的艰辛以及收得率的问题,胞内直接表达有生物活性的蛋白质仍然有一定的意义，到现在为止，形成包涵体的理化因素仍然不清楚，统计分析的出的结论是六个因素与包涵体的形成有关：电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量（1）。

有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠，如低温培养（3、4、11）、宿主菌的选择（12）、某些氨基酸残基的取代（14）、共表达分子伴侣（17）、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达（18）和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌（2、16）等。

胞内的氧化还原势是另外的问题，细菌的胞内蛋白质半胱氨酸残基和二硫键较少，含有大量二硫键的蛋白质则被输送到胞浆以外。

这样那些依靠二硫键来稳定蛋白质四级结构的蛋白质在细菌的胞浆内因为缺乏形成二硫键的系统如DsbA/DsbB难以正确折叠。

有人分离到允许胞内二硫键形成的突变株，这些突变株使编码硫氧还蛋白还原酶的TrxB基因失活以及造成一定的还原势。

硫氧还蛋白本身对于二硫键的形成不是必需的（16），该作者认为胞内有其他的类似于硫氧蛋白的蛋白能被硫氧还蛋白还原酶还原，在硫氧还蛋白还原酶缺陷的情况下，处于氧化状态的这类蛋白质能促进二硫键的形成。

这些硫氧还蛋白还原酶缺陷菌被证实为在大肠杆菌中生产复杂蛋白质的很有价值的工具。

Novagen公司pET宿主菌系列中的AD494（DE3）和Origami B(DE3)都是TrxB基因突变菌株。

原核蛋白可溶性表达策略及方案

原核蛋白可溶性表达策略及实验方案可溶性表达策略大肠杆菌根据表达部位的不同可将蛋白表达的形式分为3种：第1种为胞外分泌，即目的蛋白被分泌到培养基中。

这种方式表达的蛋白容易纯化，不易降解，但通常只有少量的蛋白质可以分泌到细胞外；第2种为周质空间表达，这种方式表达的蛋白存在于周质间隙中，外周质的氧化环境有利于蛋白质的正确折叠，在向外周质转移的过程中，信号肽在细胞内剪切，更有可能产生目的蛋白的天然N末端；第3种为胞内表达，这种表达易形成无活性的包涵体，需要经过繁琐的变性、复性过程才能得到有活性的蛋白。

因为多数蛋白不能够进行分泌表达，且表达量较少，所以分泌蛋白表达方法很少被使用；现阶段实验科研中常用的方法是融合型蛋白表达，包括蛋白上清表达和包涵体复性，以上俩种方法均可获得大量的可溶性蛋白。

有关通过蛋白复性获得可溶性蛋白请参见《包涵体蛋白复性的方法操作》，这里主要从条件优化的角度讨论第一种方法。

降低重组蛋白合成的速率可溶性蛋白的产率取决于蛋白的合成速率，蛋白的折叠速率，以及聚集的速率。

高水平表达时，肽链聚集的速率一旦超过折叠速率，就会形成包涵体。

因此，降低重组蛋白合成的速率有利于提高重组蛋白的可溶性表达。

常用的方法有培养温度的优化、挑选合适的启动子、诱导剂和诱导条件的优化等。

密码子优化密码子的使用对外源基因的表达水平有重要的影响。

密码子优化就是根据表达系统对密码子的偏好性进行优化筛选。

经过优化的基因序列往往能提高mRNA二级结构的稳定性，有利于新生肽段的正确折叠，提高外源活性蛋白的表达。

值得注意的是，稀有密码子存在通常会对蛋白表达产生负面影响，在转录过程中稀有密码子的位置以及转录的速率都会影响密码子的翻译，但在某些基因中使用稀有密码子则能显著降低肽链的延伸速率。

启动子的选择需要从启动子强度、漏表达程度、诱导性及经济因素等方面考虑。

在胞内表达中，常采用T7、PL等强启动子，表达水平可达菌体总蛋白的70%。

若重组蛋白多以包涵体形式存在，可采用强度较弱的lac等启动子以达到一个与表达能力相匹配的翻译速率。

犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

１０ｍｌｍＬＩＴ诱导６ｈ时条件下蛋白表达量最高。ＳＳＰＧＥ电泳检测的纯化目的蛋白约为９Ｄ，预．ｍｏ／ＧＰＤ－Ａ０ｋａ与计大小一致。ＶＰ２基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。关键词：犬细小病毒；２基因；合蛋白；化与纯化ＶＰ融优
犬细小病毒ＶＰ２基因原核表达条件优化与蛋白纯化
陈胜男，素贞，翟少伦，子健马简
（疆农业大学动物医学学院，鲁木齐新乌８０５）３０２
摘
要：为了提高犬细小病毒ＶＰ２基因在大肠杆菌Ｅ．ｃｌＢＬ１（ｏｉ２ＤＥ３中的表达量，过改变诱导温度、导时）通诱
ｐａｍｉｃｅｉｈａｃｌ，Ｌ２ＤＥ３ｌｓｄＥｓｈｒｃｉｏｉＢ１（）ｗａｈｐｉａｅ．ｍｍｏ／ＰＴＧｒｎｕｅｏｔｓｔｅｏｔ１ｗｈｎ１０ｍｌｍＬＩｗｅｅｉｄｃｄｆｒ６ｈａ
３ ℃．５ＦｕｓｏｏｅｎｐｕｉｉｄｂｙＧｌｔｔｏｐｒｓＢｆｉｉｙｃｌｍｎｗａｂｏｕＤａｗｈｃｒｉｎｐｒｔｉｒｆｅｕａｈｉｎｅＳｅｈａｏｅ４ａｆｎｔｏｕｓａｔ９０ｋｉｈｗｅｅ
ｓｏｏｅｎｓｔｔｅｂｓｏｔｙｎｇｓ — ｎｉａｃｎｆＣＰＶ．ｉｎｐｒｔｉｅｈｙｗｏｒｓＣａｎｎｄ：ｉｅｐａｒｖｉｕｓ；ＶＰ２；ｆｉｎｐｒｔｉｏｔｍｉａｉｎｒｆｃｔｏｖｏｒｕｓｏｏｅｎ；ｐｉｚｔｏｎａｄｐｕｉｉａｉｎ

原核表达条件优化

原核表达条件优化E.coli中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素[58]。

由于V ector NTI suitor7.0软件模拟表达，可知mRNA结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。

本实验中重组表达质粒PrP-pET-32a（+）不稳定的原因可能是PrP对E.coli BL21（DE3）具有细胞毒性。

pET-32a（+）来源于pBR-322，pBR-322源于ColE1。

ColE1、pBR-322 、pET-32a（+）都失去了分配功能区par。

而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。

功能区par对质粒PrP-pET-32a（+）的稳定性是不可缺少的[4]。

缺少功能区par的pET-32a （+）质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去，无细胞毒性时约98% E.coli BL21（DE3）会带有质粒（见《pET System Manual》34页）。

表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的AMP。

【β-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的AMP（见《pET System Manual》33页）】。

这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。

本实验证实约60%以上的细菌无质粒。

鉴于以上原因，本实验将融合蛋白Trx-PrP C27-30表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达。

原核表达系统三大要素的选择及优化

原核表达系统三大要素的选择及优化(总4页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--原核表达系统是目前使用最广泛、最完善的重组蛋白表达系统，具有遗传背景清晰、表达周期快、表达量高、成本低等优势，缺点是无法进行蛋白的翻译后修饰，得到具有生物活性蛋白的几率较小。

原核表达系统适用于表达原核来源的蛋白或不需要翻译后修饰的真核来源蛋白。

在原核蛋白表达过程中，需要综合考虑表达菌株、质粒载体、表达条件三大因素，以获得最满意的表达效果。

下面为大家一一介绍这三大因素的选择和优化。

1. 表达菌株菌株的选择往往是大家最容易忽视的，大多数人会选择使用自己实验室有的或用过的表达菌株。

当蛋白表达效果不佳时，大多会在质粒载体或表达条件上找原因，而不会考虑菌株的选择是否合适。

但作为表达宿主，菌株一定会对外源基因表达蛋白产生影响。

图1 大肠杆菌原核表达系统常用的菌株包括大肠杆菌、芽孢杆菌和链霉菌。

其中运用最为广泛的就是大肠杆菌表达系统。

以下为大家列出了一些常用的大肠杆菌表达菌株，可根据不同的需求进行选择。

2. 质粒载体质粒表达载体上的重要元件包括启动子，多克隆位点，终止子，复制子，信号肽，融合标签，筛选标记等。

根据载体上这些元件的特性，有多种质粒可供选择。

图2 大肠杆菌表达质粒pET-22b(+)图谱启动子：根据启动子的强弱考虑，强启动子可以提高蛋白表达量；弱启动子可以降低本底表达、增加可溶表达、表达小量伴侣蛋白等。

根据启动子的作用方式考虑，组成型启动子使宿主不停的表达重组蛋白；诱导型启动子使宿主在特定诱导条件下表达重组蛋白。

终止子：终止子的作用在于保护mRNA在核外不被降解，延长mRNA的寿命，以提高重组蛋白表达量。

对于T7系统来说，由于T7 RNA聚合酶效率非常高，保证一直有充足的mRNA提供翻译，所以终止子对其影响不大，只有一些自身带有起始密码子的外源基因需要终止子。

复制子：复制子决定质粒载体拷贝数，拷贝数越高，重组蛋白表达量就越高。

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原核蛋白表达纯化条件优化方案
1，收菌每10ml一EP管，弃上清后-40度冻存。

（一）缓冲液PH的确定：
2，处理镍柱：（流速控制在30d/min, 5ml注射器）
1）用3-5ml去离子水洗柱；
2）1ml硫酸镍挂柱；
3）3-5ml去离子水洗去余镍；
3，取出菌体20管，每4管（40ml）为一组，分为5组。

菌体沉淀置于冰浴中解冻，分别用1ml PH6.0,6.5,7.0,7.5,8.0的PBS重悬，分别超声至澄清。

离心15000rpm,10min，弃沉淀。

4，纯化：
4）binding buffer 3ml平衡柱子；
5）上样，保留穿透液；
6）洗脱，使用100（or200 mM）咪唑洗2个柱体积；
7）3-5ml去离子水洗柱，再用另一PH缓冲液重复步骤4）-6）
洗柱：先用去离子水洗3-5个柱体积，用EDTA（50mM）洗去NI 3个柱体积，用去离子水洗3-5个柱体积；用NaOH（1M）洗5个柱体积，用去离子水洗3-5个柱体积，用20%乙醇洗3-5个柱体积，封柱于20%乙醇，4度保存；
5，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），变性/非变性对比。

找到Trimer含量最高的缓冲液PH，并进行后面的优化。

对照/全菌/各PH穿透/各PH样品。

6，该步骤中选定的缓冲PH固化用于以下纯化、透析、ELISA包被、筛选等各个步骤。

（二）咪唑浓度的选择
8，取出新1组，选用上一步骤确定的缓冲液超声；
9，上样后分别使用60/80/100/150/200mM咪唑洗脱，每次2个柱体积，
10，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），变性电泳，选用含量最高的咪唑浓度作为洗脱条件。

顺序：对照/全菌/穿透/各浓度咪唑洗脱样品；
（三）疏水抑制剂的选择
11，选用第一步确定PH值的缓冲液，取12组；
12，分别在体系中加入咪唑（10/20/40/50mM/L）/脲（<4M/L:1/2/4M/L）/吐温（<1%）/甘油(5%,10%,15%)/tritonX-100(0.1%)/不加；
13，重复步骤重复步骤4）-6），使用第二步选定的咪唑浓度洗脱；
14，结果用SDS-PAGE检测（配小孔15%胶），非变性电泳。

找到Trimer含量最高，同时背景最低的方案，并固化为后面的纯化条件。

顺序：对照/全菌/各条件穿透/各条件样品；
（四）依照确定好的条件进行大量纯化
---------------------------------------------------------------------------------------------------
pH 0.2mol/L NaH2PO4(ml) 0.2mol/L Na2HPO4(ml)
5.7 93.5
6.5
5.8 92.0 8.0
5.9 90.0 10.0
6.0 8
7.7 12.3
6.1 85.0 15.0
6.2 81.5 18.5
6.3 7
7.5 22.5
6.4 73.5 26.5
6.5 68.5 31.5
6.6 62.5 3
7.5
6.7 56.5 43.5
6.8 51.0 49.0
6.9 45.0 55.0
7.0 39.0 61.0
7.1 33.0 67.0
7.2 28.0 72.0
7.3 23.0 67.0
7.4 19.0 81.0
7.5 16.0 84.0
7.6 13.0 87.0
7.7 10.5 89.5
7.8 8.5 91.5
7.9 7.0 93.0
8.0 5.3 94.7
Na2HPO4•2H2O分子量= 178.05，0.2 mol/L溶液为85.61克/升。

Na2HPO4•2H2O分子量= 358.22，0.2 mol/L溶液为71.64克/升。

Na2HPO4•2H2O分子量= 156.03，0.2 mol/L溶液为31.21克/升。

来源出处：武汉戴安生物技术有限公司。