pET载体原核表达鉴定与条件优化
pET表达载体
表达载体pETA.pET系统是有史以来在E.coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
尽管该系统极为强大，却仍能很容易地通过降低诱导物的浓度来削弱蛋白表达。
降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分产量。
该系统的另一个重要优点是在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态而不转录。
用不含T7 RNA聚合酶的宿主菌克隆目的基因，即可避免因目的蛋白对宿主细胞的可能毒性造成的质粒不稳定(详见I. F.部分)。
如果用非表达型宿主细胞克隆，可以通过两种方法启动目的蛋白的表达：用带有受λpL 和pI 启动子控制的T7 RNA聚合酶的λCE6噬菌体侵染宿主细胞，或者将质粒转入带有受lacUV5 控制的T7 RNA聚合酶基因的表达型细胞。
在第二种情形下，可以通过在细菌培养基中加入IPTG 来启动表达。
尽管有时(例如非毒性目的蛋白) 可以直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用做法。
两种T7启动子以及多种拥有不同抑制本底表达水平的宿主细胞共同构成了一个极为灵活而有效的系统，使各种目的蛋白得以最优化表达。
所有pET载体以及相关产品均以试剂盒形式提供，用户可以很方便地进行克隆、表达检测以及纯化目的蛋白的所有操作。
pET 表达系统包括质粒和宿主菌。
您可参考系统组成部分，选择符合具体需要的载体/宿主菌最佳组合。
B.使用许可及协议Novagen的T7表达系统，包括细菌、噬菌体和带有T7 RNA 聚合酶基因的质粒，均依照非商业用户应用声明相应条款有条件提供。
详情请垂询。
C. 系统组成pET表达系统提供目的基因克隆和表达所需的核心试剂。
PET系统_原核表达详细总结
抗生素抗性
pET载体常用的两种筛选标记是Ampr+和Knar+ 因为内酰胺酶的消化和PH的降低，Ampr+的选择 性易于丢失。某种情况下使用Knar+更为有利。 Ampr+和Knar+的另一个不同是两种基因的转录 方向不同 。Ampr+位于T7启动子下游，与其方向 相同。除了pET5系列，T7转录终止序列位于内酰 胺酶基因前面，但是这个终止序列只有70%的有 效性。因此，T7聚合酶能够通读，导致内酰胺酶 的积累。相反Knar+的转录方向与T7启动子方向 相反，诱导时并没有Knar+基因的增加。
lacUV5 Promoter
与野生型lac启动子相比，控制T7RNA聚合 酶表达的 lacUV5启动子对 cAMP/CRP的刺 激并不敏感。然而，最近研究发现rDE3宿 主菌在缺少葡萄糖的培养基生长到稳定期 时，cAMP同样对lacUV5产生了去阻遏作用。 尽管宿主菌长到稳定期并不推荐，菌体培 养过夜（16h）后转入含有1%的葡萄糖的 培养基中，可以有效避免去阻遏作用，因 为glucose可以cAMP的产生。
BL21(DE3)
BL21(DE3)是应用最广泛的表达宿主菌。是 lon蛋白酶和ompT膜外蛋白酶（纯化过程可 以降解蛋白）缺陷型。目的蛋白BL21中更 加稳定。 因为BL21(DE3)对利福平敏感，如果有必要 可以用利福平来限制宿主RNA和蛋白质的 背景合成。
应该注意一些7启动子 而没有额外的lac阻遏子基因的载体并不适 合。这些载体上的多拷贝lac操纵 子（用于 蓝白斑筛选）会结合lac抑制因子，使pet菌 株中同样受lac抑制因子控制的基因部分表 达。。结果基本的T7RNA聚合酶活性升高， 使目的基因的稳定性受到影响。
原核表达
pET原核表达金标准（转）pET, 原核, 表达转自网络pET，原核表达金标准（转）pET 载体中，目标基因克隆到T7 噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过在宿主细胞提供T7 RNA 聚合酶来诱导表达。
Novagen 的pET 系统不断扩大，提供了用于表达的新技术和选择，目前共包括36 种载体类型、15 种不同宿主菌和设计用于有效检测和纯化目标蛋白的许多其它相关产品。
优点•是原核蛋白表达引用最多的系统•在任何大肠杆菌表达系统中，基础表达水平最低•真正的调节表达水平的“变阻器”控制•提供各种不同融合标签和表达系统配置•可溶性蛋白生产、二硫键形成、蛋白外运和多肽生产等专用载体和宿主菌•许多载体以LIC 载体试剂盒提供，用于迅速定向克隆PCR 产物•许多宿主菌株以感受态细胞形式提供，可立即用于转化阳性pFORCE TM 克隆系统具有高效克隆PCR 产物、阳性选择重组体和高水平表达目标蛋白等特点。
pET 系统概述pET 系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的最强大系统。
根据最初由Studier 等开发的T7 启动子驱动系统，Novagen 的pET 系统已用于表达成千上万种不同蛋白。
控制基础表达水平pET 系统提供6 种载体- 宿主菌组合，能够调节基础表达水平以优化目标基因的表达。
没有单一策略或条件适用于所有目标蛋白，所以进行优化选择是必要的。
宿主菌株质粒在非表达宿主菌中构建完成后，通常转化到一个带有T7 RNA 聚合酶基因的宿主菌（λDE3 溶原菌）中表达目标蛋白。
在λDE3 溶原菌中，T7 RNA 聚合酶基因由lacUV5 启动子控制。
未诱导时便有一定程度转录，因此适合于表达其产物对宿主细胞生长无毒害作用的一些基因。
而宿主菌带有pLysS 和pLyE 时调控会更严紧。
pLys 质粒编码T7 溶菌酶，它是T7 RNA 聚合酶的天然抑制物，因此可降低其在未诱导细胞中转录目标基因的能力。
pLysS 宿主菌产生低量T7 溶菌酶，而pLysE 宿主菌产生更多酶，因此是最严紧控制的λDE3 溶原菌。
原核表达条件的优化
【专题讨论】原核表达条件优化！会不会是蛋白质的表达量低，电泳并不能反映出来，典型的例子是干扰素，虽然电泳没有新生条带，但是裂解上清的活性却很高。
“疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白，42度发酵，可抑制宿主菌蛋白表达疑为降解条带”会不会是宿主菌蛋白?那条带也挂在亲合柱子上的，发酵的细菌蛋白却没有。
挂在亲合柱子上,也有可能是非特异性条带，如用HIS TAG亲合柱，加大米错量试一下。
胞内表达有生物活性蛋白的一些策略包涵体的形成仍然是胞内基因表达巨大障碍，考虑到易聚合蛋白质复性的艰辛以及收得率的问题,胞内直接表达有生物活性的蛋白质仍然有一定的意义，到现在为止，形成包涵体的理化因素仍然不清楚，统计分析的出的结论是六个因素与包涵体的形成有关：电荷的分布、转型氨基酸残基的含量、半胱氨酸的含量、脯氨酸的含量、亲水性和总氨基酸数量（1）。
有多种手段用于减少包涵体的形成以及促进蛋白质的折叠，如低温培养（3、4、11）、宿主菌的选择（12）、某些氨基酸残基的取代（14）、共表达分子伴侣（17）、硫氧还蛋白的融合表达或与目标蛋白共表达（18）和利用硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株作为宿主菌（2、16）等。
胞内的氧化还原势是另外的问题，细菌的胞内蛋白质半胱氨酸残基和二硫键较少，含有大量二硫键的蛋白质则被输送到胞浆以外。
这样那些依靠二硫键来稳定蛋白质四级结构的蛋白质在细菌的胞浆内因为缺乏形成二硫键的系统如DsbA/DsbB难以正确折叠。
有人分离到允许胞内二硫键形成的突变株，这些突变株使编码硫氧还蛋白还原酶的TrxB基因失活以及造成一定的还原势。
硫氧还蛋白本身对于二硫键的形成不是必需的（16），该作者认为胞内有其他的类似于硫氧蛋白的蛋白能被硫氧还蛋白还原酶还原，在硫氧还蛋白还原酶缺陷的情况下，处于氧化状态的这类蛋白质能促进二硫键的形成。
这些硫氧还蛋白还原酶缺陷菌被证实为在大肠杆菌中生产复杂蛋白质的很有价值的工具。
Novagen公司pET宿主菌系列中的AD494（DE3）和Origami B(DE3)都是TrxB基因突变菌株。
丹参SmJAZ1蛋白原核表达及条件优化
丹参SmJAZ1蛋白原核表达及条件优化作者：张利华,吴文燕,黄璐琦,申业来源：《中国中药杂志》2012年第24期[摘要] 目的：在前期克隆丹参SmJAZ1基因的cDNA全长基础上，为研究丹参SmJAZ蛋白的功能，在大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达丹参SmJAZ1蛋白，并对其表达条件进行优化。
方法：利用分子克隆的方法将丹参JAZ1基因构建到原核表达载体pET32a上，转化到大肠杆菌BL21（DE3）宿主菌中进行诱导表达。
结果：对影响重组蛋白表达的4个因素，即诱导温度、诱导时间、IPTG浓度、及IPTG添加时间进行优化，确定丹参SmJAZ1重组蛋白最适表达条件。
IPTG浓度对目的蛋白的表达量没有显著影响；随诱导时间和诱导温度增加，SmJAZ蛋白的表达量增加；而IPTG添加时间对蛋白的表达量有明显影响。
结论：丹参JAZ1蛋白在30 ℃温度条件下，重组菌生长2 h（A600=0.9），加入0.1 mmol·L-1浓度的IPTG，诱导20 h后，表达条件最合适。
[关键词] 丹参；JAZ1；原核表达；条件优化[稿件编号] 20120927008[通信作者] *申业，Tel：（010）64014411-2956，E-mail：shenye@；*黄璐琦，E-mail： huangluqi@ 茉莉酸（JA）和它的衍生物（JA-Ile）是植物体内广泛存在的一种植物激素，参与植物生长发育、生物胁迫和非生物胁迫和次生代谢调控。
JAZ（jasmonate ZIM-domain）转录抑制蛋白是JA信号通路重要成分，在茉莉酸信号传导途径中起着重要的调控作用。
通常，植物体内JAZ蛋白与MYC2等转录因子结合，从而抑制了JA早期反应基因的表达；当植物受到环境胁迫时，体内具有生物活性的JAs积累，比如JA-Ile[1]，JA-Ile促进SCF COI1与JAZ二聚体的结合，形成COI1-JA-Ile-JAZs复合体，随即JAZ被多聚泛素化，进入到26S蛋白酶体降解，使得有活性的MYC2被释放，从而启动了茉莉酸响应基因的转录[2]。
PET系统_原核表达详细总结
04
应用前景展望
在生物制品领域的应用前景
1 2
疫苗生产
利用PET系统进行原核表达，可实现疫苗抗原的 高效制备，降低生产成本和时间。
抗体药物生产
通过PET系统表达抗体，能够简化抗体药物的生 产流程，提高生产效率和产品质量。
3
生物制品质量控制
PET系统可用于生物制品质量控制，如蛋白质结 构鉴定、功能检测和残留物质检测等。
疾病机制研究
PET技术可用于研究疾病的发 生机制、发展过程和治疗方法 ，有助于深入了解疾病的本质
。
医学影像诊断
PET技术能够提供高灵敏度和特异 性的医学影像，有助于肿瘤、神 经系统疾病等疾病的早期诊断。
生物医学材料研究
通过PET技术对生物医学材料进行 标记和检测，能够提高材料的安全 性和有效性。
05
培养基
提供实验菌种生长和繁殖所需的营 养成分。
试剂和仪器
包括各种分子生物学试剂和细胞培 养设备，用于实验操作。
实验方法
活性检测
通过生物学活性检测，评估目的蛋白的功 能和效果。
目的基因克隆
将目的基因从染色体或质粒上克隆到表达 载体中。
表达载体转化
将克隆好的表达载体转化到实验菌种中。
蛋白纯化
采用各种纯化技术，将目的蛋白从细胞中 分离出来。
诱导表达
通过添加诱导剂或其他方法，启动目的基 因的表达。
02
实验结果
pet系统表达的蛋白质量分析
总结词
在利用PET系统进行原核表达的过程中，需要关注蛋白的质量和产量。
详细描述
通过SDS-PAGE和Western Blot分析，可以检测到目标蛋白的分子量标准，同时利用定量蛋白试剂盒可以测定 其浓度。
融合表达载体 pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化
融合表达载体 pET22b-SUMO-FGFR4的构建及其在大肠杆菌中表达条件的优化刘微;姚杨;马萧萧;邓裕宣;梅迪;刘磊;王会岩【摘要】目的：设计合成小泛素修饰物-成纤维细胞生长因子受体4（SUMO-FGFR4）基因，构建 pET22b-SUMO-FGFR4表达载体，并对其表达条件进行优化。
方法：采用 Overlap PCR 方法制备 SUMO-FGFR4融合基因，并连接到原核表达载体 pET22b 中，获得 pET22b-SUMO-FGFR4重组表达载体。
以乳糖为诱导剂，观察乳糖浓度、诱导时机、诱导温度、诱导时间和乳糖的添加方式等因素对SUMO-FGFR4蛋白表达量的影响，确定最佳诱导条件，并进行重组蛋白的可溶性分析。
结果：pET22b-SUMO-FGFR4表达的融合蛋白在相对分子质量40000处显示目标条带，并与 FGFR4抗体特异性结合。
融合蛋白在乳糖终浓度为1.0 g·L－1、诱导时间为3 h、诱导时机 A （600）值为0.8、诱导温度为37℃时表达量最高，乳糖的添加方式对 SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量无明显影响。
乳糖作为诱导剂比传统诱导剂 IPTG 诱导 SUMO-FGFR4融合蛋白的表达量高7.5％，融合蛋白以包涵体形式为主。
结论：以乳糖作为诱导剂，成功表达了 SUMO-FGFR4融合蛋白，确定了融合蛋白的最佳表达条件。
%Objective:To design the small ubiquitin modification-fibroblast growth factor receptor 4 (SUMO-FGFR4) fusion gene and construct the expression vector pET22b-SUMO-FGFR4, to optimize the expression conditions. Methods:The SUMO-FGFR4 fusion gene was obtained by Overlap PCR and was connected to pET22b;the recombinant expression vector pET22b-SUMO-FGFR4 was obtained. The influence of lactose concentration, induction time,induction temperature,induction point and adding mode of lactose in the expressionlevels was observed,and the best induction condition was determined; then the solubility of recombinant protein was analyzed.Results:The SUMO-FGFR4 fusion protein was highly expressed,the molecular weight of the fusion protein was about 40 000 and it could bind with FGFR4 specific antibody.When the lactose concentration was 1.0 g·L-1 ,the induction time was 3 h,the induction temperature was 37℃,the value of A (600)was 0.8,the expression level was highest;but adding mode of lactose had no remarkable effect on the protein expression.The expression level of recombinant protein induced by lactose was higher than IPTG.SUMO-FGFR4 protein existed in a form of inclusion body.Conclusion:The SUMO-FGFR4 fusion protein is expressed successfully in this study while lactose is used as inducer and the best expression conditions are confirmed.【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(042)004【总页数】6页(P642-647)【关键词】小泛素相关修饰物;成纤维细胞生长因子受体 4;重组融合蛋白类【作者】刘微;姚杨;马萧萧;邓裕宣;梅迪;刘磊;王会岩【作者单位】吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013;吉林医药学院检验学院生物技术教研室，吉林吉林 132013【正文语种】中文【中图分类】Q78;R73-3小泛素相关修饰物 (small ubiquitin-like modifier，SUMO)是由约100个氨基酸组成的保守多肽家族，作为融合标签和分子伴侣可提高重组蛋白的可溶性和稳定性[1]，有利于重组蛋白的正确折叠。
原核表达条件优化
原核表达条件优化E.coli中蛋白表达量的因素除载体启动子结构以外，还有质粒拷贝数、质粒稳定性、mRNA结构、密码子的偏爱性和宿主菌的生长状态等因素[58]。
由于V ector NTI suitor7.0软件模拟表达，可知mRNA结构和密码子的偏爱性两个影响因素不会造成表达困难，所以本实验的工作主要针对载体拷贝数、载体稳定和宿主菌的生长状态。
本实验中重组表达质粒PrP-pET-32a（+）不稳定的原因可能是PrP对E.coli BL21（DE3）具有细胞毒性。
pET-32a（+）来源于pBR-322，pBR-322源于ColE1。
ColE1、pBR-322 、pET-32a（+）都失去了分配功能区par。
而天然质粒具有功能区par，可以保证质粒在每次细胞周期中准确的进行分离，并均等的分配到子代细胞中去。
功能区par对质粒PrP-pET-32a（+）的稳定性是不可缺少的[4]。
缺少功能区par的pET-32a （+）质粒在每次细胞周期中随机分配到子代细胞中去，无细胞毒性时约98% E.coli BL21（DE3）会带有质粒（见《pET System Manual》34页）。
表达有细胞毒性蛋白的E.coli BL21（DE3）不具有生长优势，而且随细菌培养时间的增加β-内酰氨酶将逐渐释放到溶液中去，破坏溶液中的AMP。
【β-内酰氨酶功能强大，细菌培养稀释1000倍以后还能破坏几乎所有的AMP（见《pET System Manual》33页）】。
这样本不具有生长优势的表达菌又失去了选择压力，造成大部分新生细菌无质粒，表现为表达困难。
本实验证实约60%以上的细菌无质粒。
鉴于以上原因，本实验将融合蛋白Trx-PrP C27-30表达分成两个阶段，前一个阶段为质粒生长阶段，主要保证质粒的稳定性和提高质粒的拷贝数；后一个阶段为融合蛋白表达阶段，待细菌生长达饱和以后，诱导融合蛋白Trx-PrP C27-30的表达。
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pET28a-sumo载体原核表达鉴定与条件优化
一、是否表达
从-80℃去除冻存菌，以10ul接种5ml 含Kan+LB培养液的试管中，置摇床中37℃，220rmp复苏12h。
再以复苏菌接种到新的试管中，置细菌震荡培养箱37℃培养至OD=0.6（菌液刚开始变浑）加入终浓度至1mMIPTG 37℃诱导过夜，收集菌液。
取pet28a-sumo 载体1mM诱导对照，pet28a-sumo未诱导和1mM诱导菌液进行SDS-PAGE鉴定。
如在预期位置出现条带，则进行WB鉴定是否表达。
二、感受态
可以尝试BL21，BL21(DE3)还原型，Rossta对6种稀有密码子优化以及BL21(DE3)ply促可溶表达菌株。
三、IPTG浓度
向试管中加入4ml Kan+培养液，接种20ul测序正确的表达菌。
置细菌震荡培养箱37℃培养至OD=0.6（菌液刚开始变浑）。
向双份中的其中一份诱导菌和空载体对照菌中加入IPTG至终浓度为0.1,0.25,0.5,0.75和1mM的，37℃诱导过夜。
取各梯度进行
SDS-PAGE电泳，取诱导量大的最低稀释度进行下一步诱导。
四、诱导时间
以诱导量大的最低稀释度进行诱导，分别在15℃、30℃及37℃诱导过夜，取样进行SDS-PAGE鉴定。
五、上清or包涵体
取复苏菌100ul加至30ml Kan+LB培养液中培养，以上述条件进行诱导，8000rpml离心15min收集菌体,至冰上以工作6s停9s超声20min,再次以8500rpm离心20min,取上清80ul, 80ulPBS重悬沉淀+20ul 4XSDS-PAGE煮样进行电泳检测。
六、附注操作详细：
取1ml菌液12000rpm离心后3min，用PBS涮洗一次后，取80ulPBS重悬菌体+20ul 4XSDS loadingbuffer煮样10min，12000rpm离心10min取上清上样。
SDS-PAGE电泳：取上层10ul 跑两份SDS-PAGE电泳，80V 20min后换120V继续电泳，直至胶板下沿。
取其中一块胶进行考马斯亮蓝染色30-40min。
回收染液后加入脱色液，稍微脱色30min，放微波炉加热加速脱色，2min/次。
反复几次，直至胶基本脱干净。
WB: 取另一份胶进行转膜，剪取同样大小的0.22um的PVDF膜，放入甲醇侵泡5min。
将剪好的吸水海绵放入1X转膜缓冲液浸湿。
按海绵-膜-胶-海绵的顺序放置（视转膜仪而定），赶完气泡后15V转40min。
将转好的膜放入配好的5%的脱脂乳37℃2h；再放入1:2000稀释的抗His单克隆抗体孵育过夜，PBST洗4次，5min/次；加入到1:5000稀释好的HRP标记的抗鼠二抗进行室温孵育1h，PBST洗4次，10min/次最后一次用PBS 洗；最后进行ECL显色。