犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化

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犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化_陈胜男

新疆农业大学学报2011,34(1):59~61Journal of Xinj iang Agricultural U niversity文章编号:1007-8614(2011)01-0059-03犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化陈胜男,马素贞,翟少伦,简子健(新疆农业大学动物医学学院,乌鲁木齐830052)摘要:为了提高犬细小病毒VP2基因在大肠杆菌E.coli BL21(D E3)中的表达量,通过改变诱导温度、诱导时间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响,以SDS-P AG E电泳分析证明V P2基因蛋白表达的最佳条件,并通过Glutathio ne Sepha rose4B亲和层析柱法纯化目的蛋白。

结果表明,重组质粒E.coli BL21(DE3)在35e,1.0mmol/mL IP T G诱导6h时条件下蛋白表达量最高。

SDS-P AG E电泳检测的纯化目的蛋白约为90kDa,与预计大小一致。

VP2基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。

关键词:犬细小病毒;V P2基因;融合蛋白;优化与纯化中图分类号:S851.659.2文献标识码:AOptimization and Purification of Prokaryotic Expression ofCanine parvovirus VP2GeneCH EN Sheng-nan,M A Su-zhen,ZH AI Shao-lun,JIAN Z-i jian(Colleg e of Anim al M edicine,Xinjiang Ag ricultur al University,U rumqi830052,China) Abstract:In or der to impr ove the expressio n level of Canine p arv ovir us(CPV)VP2gene in Escher ichia coli,optimal conditions for expression level of GST-VP2fusio n protein w er e analy zed by SDS-PAGE at dif-ferent concentratio n,temperature and tim e of employed inducer(IPTG).T he protein w as purified by gluta-thione sephar ose4B affinity column.T he results sho wed that the fusion pr otein ex pr ession of r ecombinant plasmid Escher ichia coli,BL21(DE3)w as the optimal w hen1.0mmo l/mL IPT G w ere induced for6h at 35e.Fusion protein purified by Glutathio ne Sepharo se4B affinity column w as about90kDa w hich w ere consistent w ith the ex pected size by SDS-PAGE.T he optim ized expressio n and purificatio n of VP2gene fu-sion protein set the base for study ing sub-unit v accine of CPV.Key words:Canine p ar vov ir us;VP2;fusion protein;optimization and purification犬细小病毒(Canine p avovir us,CPV)属于细小病毒科,细小病毒亚科,细小病毒属[1],于1978年首次发现[2,3]。

犬细小病毒VP2主要抗原表位区的原核表达载体构建及诱导表达

也被叫做ＣＶ一１而将后来发现的病毒命名为Ｐ）
ＣＶ一２因此，Ｐ只有一个抗原型，ＣＶ一２Ｐ，ＣＶ即Ｐ。
高，染性强，传死亡率高，病是我国养犬业较严重该
的传染病，泛的传播蔓延，成了严重的经济损广造
ｔｉＯｓｒｅｔｅｄａｎｓｓｏＶ，ｔｅｆａｍｅｔｏＶ一２ｅｎｔｅｖｈｉｇｏｉｆＣＰｈｒｇｎｆＣＰｂＶＰ２ｇｎｓｃｏｅｒｍｌｎｄｖｃｏｙＰｅｅｗａｌｎｄｆｏｃｏｅｅｔｒｂＣＲ．Ｔｈｎｅ，
Ｖｏ．２Ｎｏ２Ｉ３．
Ｍａ１２ｙ２０
犬细小病毒Ｖ２主要抗原表位区的Ｐ原核表达载体构建及诱导表达
马辉，赵绪永
（州牧业工程高等专科学校生物工程系，河南郑州４０１）郑５０１
ｒｃｅｏｍｂｎｎｔＥ．ｃｌｓｒｉＢＬ一２１ｗａｎｄｅＯｅｐｒｓｈｅｆｉｏｔｉｖＩｉａｏｔａｎｓｉｕｃｄｔｘｅｓｔｕｓｏｎｐｒｅｎｂＰＴＧ．Ｔｈｘｐｅｓｄｐｏｄｔｏｒｅｅｒｓｅｒｕｃｉｎｓｗｅｅ
犬细小病毒病是由犬细小病毒（ａｉｅｐｒｏＣｎｎａｖ —
微小病毒（ｎｔｉｓｏａｉｅＭｉｕｅｖｒｆｃｎｎ，ＭＶＣ）习惯上ｕ（

犬细小病毒NY株VP2蛋白的原核表达及反应原性鉴定

ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ购自美国Ｎｏｖａｇｅｎ公司；Ａｎｔｉ — Ｈｉｓ单抗和ＨＲＰ－Ｇｏａｔａｍｔｉ — Ｍｏｕｓｅ酶标二抗购自武汉三鹰
生物技术有限公司；犬五联多抗购自西诺洁普公司；
减少及心肌炎为主要特征ｎ］，该病发病率高，传染性强，病死率高，成为危害犬和猫健康的重要传染病之
一
＿ｌ２］
。
该病的病原是犬细小病毒（Ｃａｎｉｎｅｐａｒｖｏｖｉｒ —
１材料与方法
中图分类号：￥８５２．６５５文献标识码：Ａ文章编号：１００７ — ５０３８（２０１５）０６ — ００２４ — ０６
犬细小病毒病以出血性肠炎、剧烈呕吐、白细胞
株高效表达菌株，表达的重组蛋白具有良好的反应原性，为进一步研究相应的抗体检测试剂盒和基因工程亚单位疫苗奠定了基础。
１．１材料
ＵＳ，ＣＰＶ），该病毒属于细小病毒科（Ｐａｖｏｖｉｒｉｄａｅ），细小病毒属（Ｐａｖｏｖｉｒｕｓ）。该病毒基因组为单股、负链、线形ＤＮＡ，全长５３２３ｂｐ，编码３个结构蛋白ＶＰ１、ＶＰ２和ＶＰ３，其中，ＶＰ２基因全长１７５５ｂｐ，编
载体ｐＥＴ２８ａ为Ｎｏｖａｇｅｎ公司产品；大肠埃希菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞购于北京天根生化科技

犬细小病毒VP2基因

分类号：单位代码：10019 密级：学号：S0*******硕士学位论文北京地区犬细小病毒VP2基因序列分析和流行病学调查Sequence analysis of VP2 gene and epidemiological survey ofcanine parvovirus in Beijing研究生：宋永奇指导教师：吕艳丽副教授合作指导教师：申请学位门类级别：农学硕士专业名称：预防兽医学研究方向：兽医微生物学与免疫学所在学院：动物医学院2008年 5 月独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。

研究生签名：时间：年月日关于论文使用授权的说明本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。

(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月摘要犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）感染是目前危害养犬业的最严重传染病之一。

为了了解CPV的变异情况，本研究在2006-2007年间不同时间采集CPV感染患犬粪便样本20份，经PCR方法从中扩增出了CPV VP2基因，并对该基因进行了序列测定与分析；为了了解本病的流行状况，本研究对临床上常用的CPV检测方法的可靠性进行了评估，并在此基础上对2005-2007年到中国农业大学动物医院诊治的所有有呕吐、腹泻和呕吐或腹泻症状的犬粪便样本的CPV检测结果进行了统计分析，获得如下结果：VP2基因全长1755bp，编码585个氨基酸。

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

表达载体ｐＥＴ—ＶＰ２，转化至大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态细胞中，在不同ＩＰＴＧ浓度、诱导温度和诱导时间条件下进
行原核表达，确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后，利用镍柱对重组蛋白进行纯化５
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７１－７２３６（２０１８）０３—０６４３—０７
ＰｒｏｋａｒｙｏｔｉｃＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＶＰ２ＰｒｏｔｅｉｎｏｆＣａｎｉｎｅＰａｒｖｏｖｉｒｕｓ
ＬＯＮＧＤａｎｄａｎ，ＪＩＸｉｎｑｉｎ，ＤＵＡＮＺｈｉｑｉａｎｇ。，ＲＵＡＮＹｏｎｇ。，ＣＨＥＮＱｉａｎｇ，ＬＥＩＹｕｎ一，ＷＡＮＢｉａｏ，ＨＵＹａｎ
形式存在；纯化后获得的重组蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ双重鉴定，均在６４ｋｕ处出现条带，说明纯化
后的蛋白为重组蛋白ｐＥＴ—ＶＰ２。本试验通过对ＣＰＶＶＰ２蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ进行双重鉴定。结果显示，重组质粒ｐＥＴ—ＶＰ２经双酶切鉴定分别获得大小为
５９００ｂｐ左右的载体条带和１７５５ｂｐ左右的目的基因条带，成功构建了ｐＥＴ—ＶＰ２重组质粒；重组ＶＰ２蛋白的分子

一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用[发明专利]

专利名称：一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用
专利类型：发明专利
发明人：吴晓杰,金继祖,吴银飞
申请号：CN202010646022.0
申请日：20200707
公开号：CN111875677A
公开日：
20201103
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种犬细小病毒VP2蛋白重组抗原、其编码基因及其表达和应用，包括一种犬细小VP2蛋白重组抗原基因、由该基因编码的一种犬细小VP2蛋白重组抗原、一种表达犬细小VP2蛋白重组抗原的方法及其在制备胶体金中应用。

本发明在大肠杆菌表达系统中重组表达了VP2蛋白，具有生产周期短，产量高，成本低，特异性好的优点；重组蛋白上的His标签有利于一步纯化达到较高的纯度，并且不需酶切即可表现较好地活性；以重组抗原可作为犬细小病毒胶体金检测试剂条的一部分，敏感性高，特异性好，稳定性好，操作简便，适合作为常规检测手段。

申请人：杭州傲锐生物医药科技有限公司
地址：311100 浙江省杭州市余杭区文一西路1500号1号楼209室
国籍：CN
代理机构：杭州杭诚专利事务所有限公司
代理人：尉伟敏
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犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化

犬细小病毒VP2基因的原核表达及纯化张坤;马丽娟;李刚;黄伟;李伟;贾凤琴【期刊名称】《中国动物保健》【年(卷),期】2009(011)012【摘要】参照GenBank中犬细小病毒VP2基因序列设计了一对添加EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点的引物,对CPV VP2基因进行PCR扩增,克隆至pGM-T载体,获得重组质粒pGM-T-VP2,将重组质粒亚克隆到表达载体pET-32a上,获得表达重组子pET-32a-VP2,经EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定后,序列分析确定该重组子YM株VP2基因ORF正确,转化至E.coli Rosetta(DE3)中,获得了基因工程菌株E.coilRosetta(CVP2),并对重组菌进行了诱导表达,鉴定及纯化.结果表明纯化样品中含有87 kDa目的蛋白,Western blot检测发现该蛋白与犬细小病毒多克隆抗体发生反应,出现特异条带.E.coil Rosetta(CVP2)以包涵体形式表达出了CPV-YM株VP2,从而为进一步制备检测抗体效价的胶体金检测试剂盒的开发研究打下了良好的基础.【总页数】6页(P46-51)【作者】张坤;马丽娟;李刚;黄伟;李伟;贾凤琴【作者单位】中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;西南大学动物科技学院,重庆,北碚,400715;吉林大学畜牧兽医学院,长春,130062;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;动物营养学国家重点实验室,北京,100094;西南大学动物科技学院,重庆,北碚,400715;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;动物营养学国家重点实验室,北京,100094;中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京,100094;动物营养学国家重点实验室,北京,100094【正文语种】中文【相关文献】1.犬细小病毒VP2基因原核表达载体的构建与分析 [J], 颜文卿;吴德峰;黄印尧;林永利;戴亚东;颜江华2.犬细小病毒VP2基因原核表达条件优化与蛋白纯化 [J], 陈胜男;马素贞;翟少伦;简子健3.犬细小病毒SH14株VP2基因原核表达及免疫原性分析 [J], 唐井玉;李传峰;宫晓华;李琦;丁明洋;陈宗艳;王桂军;刘光清4.犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析 [J], 卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平5.犬细小病毒VP2基因的原核表达及间接ELISA方法的建立 [J], 李慕瑶;姜骞;刘家森;司昌德;韩凌霞;曲连东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析

犬细小病毒VP2基因克隆及原核表达分析卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【摘要】试验旨在了解河北与甘肃地区犬细小病毒流行情况,并通过原核表达系统获得犬细小病毒VP2蛋白,制备该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究犬细小病毒致病机理和治疗方法奠定基础.从10份疑似感染犬细小病毒犬的病料中提取病毒基因组DNA,并以其作为模板进行VP2基因的PCR扩增,将目的片段进行测序和分析后克隆至原核表达载体pET-30a中,阳性质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达,诱导产物经SDS-PAGE鉴定表达后切割目的蛋白条带免疫豚鼠制备多克隆抗体.序列分析结果显示成功克隆VP2基因,10株分离株中CPV-2a型占80％,CPV-2b型占20％.本试验检测的毒株与部分中国毒株形成了一个分支,与韩国、美国分离株呈现一定差异,与意大利分离株同源性较低.Western blotting分析证实了通过原核表达系统成功获得的大小为70 ku左右的重组蛋白具有反应原性和免疫原性.该试验初步表明河北与甘肃地区以CPV-2a型为主,原核表达的VP2蛋白具有良好的抗原性,本试验结果为犬细小病毒的防控提供科学依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)004【总页数】9页(P870-878)【关键词】犬细小病毒;VP2;基因型;原核表达【作者】卫巧林;张韵;甄士伟;殷相平【作者单位】中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046;廊坊市动物疾病预防控制中心,廊坊065000;中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病实验室,兰州730046【正文语种】中文【中图分类】Q785犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)感染引起的一种急性烈性传染病[1]，临床上以急性出血性肠炎、呕吐为主要特征[2]。

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１０ｍｌｍＬＩＴ诱导６ｈ时条件下蛋白表达量最高。ＳＳＰＧＥ电泳检测的纯化目的蛋白约为９Ｄ，预．ｍｏ／ＧＰＤ－Ａ０ｋａ与计大小一致。ＶＰ２基因融合蛋白的优化表达和纯化为研究犬细小病毒亚单位疫苗奠定了基础。关键词：犬细小病毒；２基因；合蛋白；化与纯化ＶＰ融优
犬细小病毒ＶＰ２基因原核表达条件优化与蛋白纯化
陈胜男，素贞，翟少伦，子健马简
（疆农业大学动物医学学院，鲁木齐新乌８０５）３０２
摘
要：为了提高犬细小病毒ＶＰ２基因在大肠杆菌Ｅ．ｃｌＢＬ１（ｏｉ２ＤＥ３中的表达量，过改变诱导温度、导时）通诱
ｐａｍｉｃｅｉｈａｃｌ，Ｌ２ＤＥ３ｌｓｄＥｓｈｒｃｉｏｉＢ１（）ｗａｈｐｉａｅ．ｍｍｏ／ＰＴＧｒｎｕｅｏｔｓｔｅｏｔ１ｗｈｎ１０ｍｌｍＬＩｗｅｅｉｄｃｄｆｒ６ｈａ
３ ℃．５ＦｕｓｏｏｅｎｐｕｉｉｄｂｙＧｌｔｔｏｐｒｓＢｆｉｉｙｃｌｍｎｗａｂｏｕＤａｗｈｃｒｉｎｐｒｔｉｒｆｅｕａｈｉｎｅＳｅｈａｏｅ４ａｆｎｔｏｕｓａｔ９０ｋｉｈｗｅｅ
ｓｏｏｅｎｓｔｔｅｂｓｏｔｙｎｇｓ — ｎｉａｃｎｆＣＰＶ．ｉｎｐｒｔｉｅｈｙｗｏｒｓＣａｎｎｄ：ｉｅｐａｒｖｉｕｓ；ＶＰ２；ｆｉｎｐｒｔｉｏｔｍｉａｉｎｒｆｃｔｏｖｏｒｕｓｏｏｅｎ；ｐｉｚｔｏｎａｄｐｕｉｉａｉｎ
ｃｓｓｅｉｈｔｅｅｐｅｔｄｓｚｏｎｉｔｎｔｗｔｈｘｃｅｉｅｂｙＳＤＳＰＡＧＥ．ｈｅｏｉｉｅｘｅｓｏｎｒｆｃｔｏＰ２ｇｎｕ — ＴｐｔｍｚｄｅｐｒｓｉｎａｄｐｕｉｉａｉｎｏｆＶｅｅｆ —
间及诱导剂浓度等条件对表达量产生影响，ＳＳＰＥ电泳分析证明ＶＰ以Ｄ－ＡＧ２基因蛋白表达的最佳条件，通过并
ＧｌｔｔｉｎｅｈｒｓＢ亲和层析柱法纯化目的蛋白。结果表明，组质粒Ｅ．ｃｌＢＩ２ＤＥ３ｕａｈｏｅＳｐａｏｅ４重ｏｉ１（）在３ ℃ ，５
ＡｂｔａｔＩｒｒｔｍｐｏｖｈｅｅｒｓｉｎｌｖｌｏｎｉｓｒｃ：ｎｏｄｅＯｉｒｅｔｘｐｅｓｏｅｅｆＣａｎｅｐａｒｏｉｕｓ（ｖｖｒＣＰＶ）ＶＰ２ｇｅｅｉｃｅｉｈａｎｎＥｓｈｒｃｉｃｌ，ｐｔｍａｏｏｉｏｉｌｃｎｄｉｉｎｓｆｘｅｓｏｅｅｔｏｏｒｅｐｒｓｉｎｌｖＩＧＳＴ— ｏｆＶＰ２ｆｉｎｐｒｔｉｒｎｌｚｄｂｕｓｏｏｅｎｗｅｅａａｙｅｙＳＤＳ— ＰＡＧＥｔｄｆａｉ— ｆｒｎｔｃｎｃｎｒｔｏｔｍｐｅａｕｒｎｄｔｍｅｏｍｐｌｙｄｉｕｃｒ（ＰＴＧ）Ｔｈｒｔｉｓｐｕｉｉｄｂｙｇｕａｅｅｏｅｔａｉｎ．ｅｒｔｅａｉｆｅｏｅｎｄｅＩ．ｅｐｏｅｎｗａｒｆｅｌｔ —
中图分类号：￥５．５．８１６９２文献标识码：Ａ
ＯｐｉｉａｉｎａｄＰｕｉｉａｉｎｏｏａｙｔｃＥｘｅｓｏｆｔｍｚｔｏｎｒｆｃｔｏｆＰｒｋｒｏｉｐｒｓｉｎｏＣａｎｅｐａｖｖｒｓＶＰ２Ｇｅｅｎｉｒｏｉｕｎ
新疆农业大学学报
２１，４１：９６０１３（）５～１
ＪｕｎｌｆＸｉｊａｇＡｇｉｕｔｒｌＵｉｅｓｔｏｒａｎｉｎｒｃｌｕａｎｖｒｉｏｙ
文章编号：１０ — ６４２１）ｌ０５ — ３０７８１（０１Ｏ一０９０
ｔｏｎｅｈｉｅｓｐｈａｏｓａｆｎｉｙｃｌｎ．Ｔｈｅｒｓｔｈｏｅｈｔｔｅｆｉｎｐｏｔｉｘｐｅｓｏｎｏｅｏｂｎｎｔｒｅ４Ｂｆｉｔｏｕｍｅｕｌｓｓｗｄｔａｈｕｓｏｒｅｎｅｒｓｉｆｒｃｍｉａ
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