原核表达条件优化

【专题讨论】原核表达条件优化！之所以首先介绍Novagen公司的产品是因为用过它的pET系列载体，感觉很好用。

Novagen的母公司是德国默克（Merck）公司，它是国际著名的化学及制药公司总部位于德国的Darmstadt，已有300多年的历史。

已在全世界55个主要国家设立了分公司，其中在28个国家建有62个生产基地。

Novagen公司出品的pET系列载体是目前应用最为广泛的原核表达系统，已经成功地在大肠杆菌中表达了各种各样的异源蛋白。

pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。

T7噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。

T7噬菌体基因编码的T7RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。

它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。

并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。

在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。

T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。

噬菌体DE3是λ噬菌体的衍生株，一段含有lacⅠ，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的 DNA片段倍插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、 HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学信号诱导型，类似于Lac表达系统。

从开始涉及表达的时候可以根据是否要用基因本身的起始密码子进行选择，Novagen公司仅提供三个载体：pET-21(+)，pET-24(+)和pET-23(+)。

如果你打算利用载体的起始密码子，那么就有许多选择。

根据是否要可溶性表达，选择加有不同标记的载体。

一般说来在大肠杆菌中不加标记外源蛋白都会以不溶的包涵体形式表达。

为了让外源蛋白融合表达一般说来有三个策略：1. 与一个高度可溶的多肽联合一起表达，比如：谷胱甘肽S转移酶（glutathione S transferase, GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin, Trx）和N利用质A（N utilization substanceA, NusA）。

2. 转入一个酶催化二硫键的形成，如：硫氧还蛋白，DsbA，DsbC。

3. 插入一个定位到周质空间的信号序列。

不同载体提供不同的标记，有的可以同时带有多个标记。

如果你不希望在蛋白的N末端加入任何的多肽，你也可以选择用NdeⅠ直接从起始密码子后插入外源片断，或者在得到表达产物后利用蛋白氨基酸的酶切位点把多余的多肽切除。

在重组技术上，Novagen除了传统的酶切、连接方式外，还有不需要连接的克隆方式：Ligation-Independent cloning，简称LIC。

采用LIC方法的pET载体是线性化的，在末端有12-15个突出的碱基以在退火时和目的片断互补。

在设计PCR扩增引物时加入与LIC载体互补的序列，PCR产物用3’→5’的内切酶消化出单链与载体互补的序列。

通过这种方式就可以把目的片断定向、高效地插入LIC 载体上。

一般的pET载体是先在不含DE3片段的菌株中进行克隆筛选，之后再把阳性克隆转化进入表达菌株，如BL21（DE3）中，通过IPTG诱导进行表达。

而pETcoco载体它引入了低拷贝控制元件，F附加体上的oriS 和 repE元件与parABC共同作用下使质粒在细菌中保持单拷贝，这样即可以使质粒在细菌内稳定存在又可以减少外源蛋白对细胞的毒害作用。

当我们需要大量表达时加入树胶醛醣诱导trfA基因表达，质粒在细胞内的拷贝数就可以增加到25-50。

pETcoco载体同时兼容了DE3调控模型，在加入IPTG后诱导表达量达升高2500倍。

在保证质粒稳定性这一点上除了pETcoco的方法还有另一种方法就是将重组质粒转化进入含有T7 RNA聚合酶抑制剂的T7溶菌酶表达基因的菌株中，在含有pLysS的pLysE宿主菌内重组质粒的本底表达被进一步抑制，质粒可以更稳定地存在。

Novagen提供多种表达使用的菌株，为了提高表达量做出了各种改造，它们大致分为以下几个种类：1. 蛋白酶缺陷型所有B菌株的衍生株都是lon蛋白酶和ompT蛋白酶缺陷型的，这包括有B834, BL21, BLR, Origami™ B, Rosetta™和Tuner™。

因此在纯化时可以保持蛋白的稳定不被降解。

BL21(DE3)是应用最多的表达的表达菌株。

另外它的衍生株BLR(DE3)是recA－，RecA是大肠杆菌中介导同源重组的重要蛋白之一。

它的缺失，可以保证质粒的稳定。

2. 保证所有细胞以同样量进行表达Tuner™株及它的衍生株（Origami™ B和Rosetta™）是BL21菌株的lacY1缺失突变型，在这些菌株中可以使蛋白以同样水平在所有细胞中表达。

Lac渗透酶的突变使进入每个细胞的IPTG量都是一致的，这样使蛋白表达浓度可以随着IPTG浓度而改变。

通过对 IPTG浓度的控制可以使细胞微量表达或者大量表达。

一般说来，低浓度表达有利于蛋白的可溶性和活性。

3.二硫键形成与溶解性增强二硫键的形成对某些蛋白的可溶性起到重要的作用，而Novagen也专门设计了一些菌株是谷胱甘肽还原酶（gor）和/或硫氧还蛋白还原酶（trxB）缺陷型的，包括AD494，BL21trxB，Origami，Origami B和Rosetta-gami™。

在这些菌株中表达蛋白，可以更大程度促进二硫键的形成，并使蛋白以可溶形式和有活性形式出现的可能增加。

4. 稀有密码子的补给不同物种有不同的密码子偏爱性，如果外源蛋白中含大量大肠杆菌的稀有密码子，特别当这些稀有密码子呈连续分布的时候，就会造成蛋白表达量极低，或者翻译提前终止。

Rosetta™是为了表达真核蛋白而特别设计的，它含有大肠杆菌稀有的密码子tRNA，包括AUA，AGG，AGA，CUA，CCC和GGA。

它们以氯霉素抗性的质粒形式存在。

Rosetta系列是来自BL21lacY1，所以它具有 BL21lacY1的所有特性。

5. 硒蛋氨酸标记 B834是来源于BL21的蛋氨酸（met）营养缺陷型菌株。

它在高度特异活性35S-met标记和晶体成像蛋氨酸标记中非常有用。

我们常用的培养基有LB、TB、M9、M9ZB，LB因为其成本低廉所以应用最为广泛，而Novagen有提供特殊的培养基Overnight Expres s™ Autoinduction System。

使用这种培养基不需要按照传统方法先培养一段时间再加IPTG进行诱导，它可以直接进行过夜培养。

在这种培养基中含有痕量金属，可以满足合成蛋白时对金属的需求。

同时提供除了各种氨基酸，这其中蛋氨酸是另外加入的。

这样培养基可以满足细菌生长的各种需求，使细菌密度更高；可以自动诱导无需自己加IPTG；使蛋白更加容易溶于培养基中；并且如果需要的话，可以对蛋氨酸进行硒标记。

同时Novagen还有表达双外源蛋白的载体pCDFDuet-1 DNA 、pETDuet™-1 DNA 、pRSFDuet-1 DNA。

这些载体含有两个不同多克隆位点，可以插入两个外源蛋白基因，利用单独的T7 启动子, 乳糖操纵子和核糖体结合位点进行表达。

载体转化进入合适的菌株中最多可以同时表达8个外源蛋白。

人们合成与生物相关的物质是从尿素开始的，1828年，德国化学家维勒人工合成了存在于生物体的这种有机物。

在1960年我国科学家采用化学方法首次成功地合成了具有生物活性的蛋白质——胰岛素。

随着内切酶的发现和基因工程技术的发展，人们发现用各种不同的载体在原核、真核系统中进行蛋白表达更为行之有效。

而这其中大肠杆菌表达系统发展得最为迅速、成熟。

原核表达具有操作方便、快捷，需时较短，表达量大，适合工业化生产等优点。

虽然也有缺少糖基化和表达后加工等问题，当有了其它多种表达系统后，原核系统仍是我们合成外源蛋白的首选。

在网上看到有人把原核表达技术分成四个等级：初次尝试扫盲、乱棍打枣入门、系统优化中级和自成一体高手，觉得十分有意思。

但是根据笔者自己的经验以及耳闻目睹的一些经历告诉我：做表达？那是谋事在人，成事在天。

有时候你把克隆做出来了，双酶切鉴定没问题，测序没问题，可是就是看不到表达带。

原因当然可以分析，实验也是可以改进，但是窜改一下戈尔泰的话：“成功的实验都是一样的，失败的实验各有各的不幸。

”在实验遇到瓶颈的时候要如何进行分析，找到问题的症结是我们的实验关键所在。

在准备进行原核表达的时候需要考虑的因素很多，市面上可供选择的载体、菌株也很多，要如何进行正确的选择，找到适合自己的载体是十分重要的。

所以，现在要对目前常用的一些载体进行介绍，让我们对其相关产品及其表达原理进行了解，以方便实验设计。

首先来一些大肠杆菌表达的基本概念：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。

选择表达系统通常要根据实验目的来考虑，比如表达量高低，目标蛋白的活性，表达产物的纯化方法等等。

主要归结在表达载体的选择上。

表达载体：我们关心的质粒上的元件包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因等。

通常，载体很贵，我们可以通过实验室之间交换得到免费的载体。

但是要小心，辗转多个实验室和多个实验室成员之手的载体是否保持原来的遗传背景？MCS是否还是原来那个MCS？是我们要特别注意的。

复制子：通常表达载体都会选用高拷贝的复制子。

pSC101类质粒是严谨方式复制，拷贝数低，pCoE1，pMBI(pUC)类的复制子的拷贝数高达500以上，是表达载体常用的。

通常情况下质粒拷贝数和表达量是非线性的正相关，当然也不是越多越好，超过细胞的承受范围反而会损害细胞的生长。

如果碰巧需要2个质粒共转化，就要考虑复制元是否相容的问题。

筛选标记和报告基因：氨苄青霉素抗性是最常见的筛选标记，卡那霉素或者是新霉素次之，通常是另一个载体的筛选标记用。

四环素，红霉素和氯霉素等已经日渐式微。

抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要留意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。

在表达筛选中要注意的问题应该就是LB倒板前加抗生素的温度，温度过高容易导致抗生素失效。

今天耐青霉素的超级细菌泛滥，不知道是否有我们实验人员的功劳呢？大家“随便倒掉”已经获得氨苄抗性的大肠杆菌之前有没有经过煮沸或者消毒等处理呢？从以前的一针50万单位到现在100多万个单位，青霉素剂量似乎越来越大了。