流感病毒的分离培养
流感病毒的鸡胚培养,收获及血凝效价测定实验报告
篇一：鸡胚培养法鸡胚培养法（病毒分离培养）鸡胚是发育的机体，适合许多人类和动物病毒及立克次体的生长增值，常用于痘类病毒、粘液病毒、和疱疹病毒的分离、鉴定、抗原准备、疫苗生产以及病毒性质等方面的研究。
鸡胚培养病毒，常用的接种途径包括绒毛尿囊膜，尿囊腔、羊膜腔以及卵黄囊接种四种。
根据不同病毒，不同实验目的以及不同来源的标本，选择不同的途径接种鸡胚进行培养，即可达到分离培养病毒和传代病毒的目的。
本片主要介绍尿囊腔和羊膜腔两种接种途径在病毒分离培养和传代中的应用。
鸡胚的接种方法、孵育及收获一、仪器和器材spf鸡卵或鸡胚、二级生物安全柜、孵卵箱或恒温箱、检卵灯、照蛋灯、开卵钻、卵盘、1ml、1次注射器、医用胶布、液体石蜡、无菌镊子、巴氏吸管、15 ml无菌离心管、试管架、96孔微量反应板、加样槽、移液器、75%酒精、生理盐水等。
二、鸡胚的孵育应选择保存温度在100左右，时间不超过10天，卵壳薄而色浅的鸡卵，用于鸡胚的孵育。
特别脏的鸡卵需用清水清洗，用布擦干后孵育，干净的鸡卵不必做任何处理。
将鸡卵置于380c---390c孵卵箱，在孵卵箱底层盛水器中放入干净自来水，以保证鸡胚发育的湿度，病保持良好的通风，孵育至第四天，于检卵灯上检查鸡胚受精与否及发育情况。
受精鸡卵可见清晰地血管小团和发育的鸡胚迹象，似蜘蛛壮，未受精鸡卵仅能看见模糊的卵黄黑影，无鸡胚迹象。
在孵育过程中，应随时对鸡胚进行检查，淘汰濒死或已经死亡的鸡胚。
若在恒温箱里孵育鸡胚，则应在恒温箱底层放入装满水的广口容器，并从孵育的第3天起，每天180度转到鸡胚1—2次，是鸡胚发育匀称。
也可直接订购孵育9—11日龄的鸡胚。
如何判断鸡胚存活状态：1胎动：于检卵灯下可见活胎有明显的自然运动，但胎龄大于14天的胚胎，胎动不明显，甚至无胎动，死胎则无任何胎动，胎发红似出血样，有的呈现黑快。
2血管：活胚可见清晰地血管，卵壳较薄者还可见血管的搏动。
死胎血管模糊，成淤血带或淤血块。
流感病毒的分离鉴定(二)
流感病毒血凝试验
试管号 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9
生理盐水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 病毒液 (1:10) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 弃0.2 病毒稀释度 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 1:5120 对 照 0.5%鸡红细胞 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 摇匀置室温60～90分钟 结果
实验材料
(1)接种流感病毒的鸡胚。 (2)质量分数为0．5％的鸡红细胞悬液。
(3)流感病毒型与亚型免疫血清。
(4)碘酒，酒精消毒棉球。 (5)灭菌的镊子、剪刀。 (6)无菌小试管，毛细滴管，吸管。 (7)生理盐水。
(8)试管、试管架。
实验方法：
1、血细胞凝集实验 (1)收获尿囊液：鸡胚孵育3d后,放4度冰箱过夜,次日 取出鸡胚,消毒气室端卵壳,用小镊子在无大血管处 撕破卵膜,以无菌毛细管吸取尿囊液,放入无菌试管
实验十 流感病毒的分离鉴定（二）
1、血细胞凝集实验 2、血细胞凝集抑制试验
目的：熟悉病毒血凝、血凝抑制试验的方法及其应用。 原理：流感病毒颗粒表面有血凝素,具有使鸡、豚鼠 等血细胞凝集的能力。把一定浓度的鸡红细胞加到待 检的鸡胚尿囊液或羊水中，如出现血细胞凝集现象， 即表示有病毒存在；如血凝阳性，则可进一步用血凝 抑制试验进行病毒鉴定，流感病毒的血凝性，可被免 疫血清中的特异性抗体所抑制，使其失去凝集作用， 借此可用已知抗体鉴定未知病毒及病毒的型、亚型。
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流感病毒分离技术2019.3.3
2020/7/7
鹤壁市疾控中心
MDCK细胞培养法
材料与试剂
2020/7/7
鹤壁市疾控中心
2020/7/7
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液体配置
1 细胞培养液：500ml DMEM+1.25ml 8万单位庆大霉 素+5ml 双抗（10%）+10%胎牛血清（现用现加，细胞 传代时用）
2 洗液：500ml MEM+1.25ml 8万单位庆大霉素+5ml 双抗+TPCK胰酶 0.5ml（1%）
3 病毒应用液：500ml DMEM+1.25ml 8万单位庆大霉 素 +5ml 双 抗 +TPCK 胰 酶 0.5ml+牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5ml（25%）Fra bibliotek2020/7/7
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细胞传代
消 化 细 胞 用 3ml EDTA 胰 酶 洗 两 遍 ， 之 后 再 加 3ml EDTA胰酶放于37℃隔水式恒温培养箱3min后出现雾状倒 掉胰酶，继续放于37℃隔水式恒温培养箱，观察细胞至出现 透明点状后取出用手轻拍直至贴壁细胞完全脱落，用细胞培 养液吹打细胞培养瓶长有细胞的面，加细胞培养液至所需要 的 量 ， 分 装 ， 标 记 。 放 于 3 7 ℃ 隔 水 式 恒 温 培 养 箱 培 养 1824h
异常增殖有顿挫感染和病毒干扰现象，顿挫感染为病毒进入宿主 细胞后，细胞不能为病毒增殖提供所需要的酶、能量及必要的成分； 干扰现象为两种病毒感染同一细胞时，可发生一种病毒抑制，另一种 病毒增殖，这种现象可发生于同种、同型及同株之间。
样本因素
样本病毒含量，质量等。 （MDCK细胞培养法非100%分离病毒）
2020/7/7
流感病毒在MDCK细胞中分离与培养的影响因素
ｐ Ｈ值 上升 ，所 以病毒 培养 基一般 现配 现用 。
． ２ ． ３ ． ６ 细胞 培 养物 的收获 当 ７ ５ ％ ～１ ０ ０ ％ 细胞 出 果 不 能在 ２ ４ ｈ送 到 的需 要 放在 一７ ０℃ 冰箱 保 存 ，也 １ 现病 变 时进 行 收获 ，Ｃ Ｐ Ｅ（ 细胞 病 变 ） 出现 时 间与病 可 以暂 时 放在 ４ 冰箱 ２ ４ ｈ 。
ｍ ｌ 的胰 酶可明显提高 细胞增
通过对 ＭＤ Ｃ Ｋ细胞培养与增毒 的影 响因素分 析 ，明显 提高流感病毒分离 与增毒 的效价 。
文章编号 ：１ ０ ０ ３— ６ ２ ４ ５（ ２ ０ １ ４ ）０ ５— ０ ５ ８ ５— ０ ２
本研 究通 过各 不 同培 养条 件下 对 ＭＤ Ｃ Ｋ细胞 接 种 检 测到 滴度后 改 用 Ｔ ２ ５培 养瓶 加 ７ ｍ ｌ 维 持液增 毒 。
１ ． ２ ． ２ 样பைடு நூலகம்处理
样 品 及 时 送 到后 用无 菌镊 子 把 棉
毒 的型别 和毒株 的差 异 以及感 染 量 的大小 有 关 。收获
之前 可 以将 细 胞放 于 一 ７ ０ 冰 箱 冻融 １ ～２次 ，以提 高收 获标本 的病 毒滴 度 。即使 无 细胞 病变 也应 该 于接
血清 白蛋 白组 分 Ｖ；细 胞 生 长 液 ＭＥ Ｍ 加胎 牛血清 ，
是样 本后 吸 咐 １ ． ５ ｈ为 佳 ，过少 时 问 吸 咐不 完 全 ，过
终浓 度 １ ０ ％ ；青 、链 霉 素 母 液 ５ ｍ ｌ（ 终 浓度达 １ ０ ０ 长 时 间病 毒培 养 的 阳性率 降低 。 ． ２ ． ３ ． ５ 病 毒 培养基 在 Ｍ Ｅ Ｍ加 入 Ｈ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ 、胰酶 和 Ｕ ／ ｍ ｌ 青 霉 素 ，１ ０ ０ ｍ ｌ 链霉素） ，Ｈ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ缓 冲 液 １ Ｅ Ｐ Ｅ Ｓ的 作 用 是加 １ ２ ． ５ ｍ ｌ（ 终浓 度 ２ ５ ｍ １ ） ；病 毒 维 持 液 ＭＥ Ｍ加 Ｔ Ｐ Ｃ Ｋ 牛血 清 白蛋 白组 份 Ｖ配 制 而成 ，Ｈ 胰 酶 ，终浓 度 为 ０ ． ２ ｍｌ ，１ ０ ％ 牛血 清 白蛋 白组 强体 系 的缓 冲能力 ，胰 酶 的作 用是 将 病毒 粒 非裂 解 型
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件
• （二）、接种样本 • 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。 • （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。 • (3)用注射器吸800µl标本。 • (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床 采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。 • 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
二、流感病毒分离之鸡胚培养法
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 • 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚 • 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发 育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
• • • • •
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 7、临床样品0.5mL 8、1mL无菌移液管 9、10mL无菌移液管 10、15mL无菌离心管
• • • • •
（三）实验步骤 1、准备病毒生长液 （1）细胞维持液准备 500mL D-MEM液中加入 ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达： 100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度： 0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度： 25mM）
流感病毒分离培养SOP
1. 范围适用于实验室所有技术人员进行流感病毒的MDCK细胞分离和鉴定。
2. MDCK细胞培养程序2.1 生物安全要求MDCK细胞培养实验室生物安全级别：BSL-2 ，所有操作必须在BSL-2实验室的生物安全柜里进行。
2.2 材料2.2.1 生长成片的MDCK细胞2.2.2 无菌的T25细胞培养瓶2.2.3 D-MEM培养液（含有L-谷氨酰胺）2.2.4 青、链霉素母液（10000 U/mL青霉素G；10000µg/mL硫酸链霉素），分装后保存于-20℃2.2.5 HEPES缓冲液，1M母液2.2.6 胎牛血清2.2.7 EDTA-胰酶（0.05%胰酶，0.53mM EDTA-4Na），分装后保存于-20℃2.2.8 7.5%牛血清白蛋白组分V2.2.9 1mL、10mL无菌移液管2.2.10 70％～75％的酒精注意事项：经常检查试剂使用的有效期。
2.3 实验步骤这里以T75细胞瓶的单层细胞培养为例，叙述MDCK细胞的培养程序。
如果细胞瓶的规格有变，MDCK细胞悬液的量必须做相应的调整。
2.3.1 D-MEM培养液的准备500mL D-MEM液中加入：a）青、链霉素母液5mL（终浓度达：100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素）。
b）7.5%牛血清白蛋白组分Ⅴ12.5mL（终浓度：0.2%）。
c）HEPES缓冲液12.5mL（终浓度：25mM）。
2.3.2 细胞生长液的准备胎牛血清10mL加到90mL的上述（1）的液体中，使胎牛血清的终浓度为10%。
2.3.3 首先将细胞培养瓶中的培养液弃去，加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶。
2.3.4 温和地摇动细胞瓶1min，使EDTA-胰酶均匀分布在整个细胞薄层。
然后用移液管吸去EDTA胰酶。
2.3.5 重新加入5mL在37℃水浴中预热的EDTA-胰酶重复上述步骤。
2.3.6 加入1mLEDTA-胰酶使其均匀分布在整个细胞薄层，37℃孵育细胞瓶直至细胞从塑料细胞瓶的表面分离（约5～10min）。
细胞培养技术分离流感病毒及分离条件的研究
［ Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｐ ａ ｔ ｈ ｏ ｇ ｅ ｎ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ．２ ０ １ ５ Ｓ ｅ ｐ ；１ ０ （ ９ ） ： ８ １ ２ —８ １ ５ ． ］
Ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｉ ｎｆ ｌ ｕ ｅ ｎ ｚ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ａ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕｒ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄｉ ｔ ｉ ｏ ｎｓ
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适大小的细胞培养瓶和细胞培养板来用做 病毒分离 • 2、胰酶（牛胰腺来源Ⅷ型） • 3、HEPES缓冲液，1M母液 • 4、D-MEM培养基，Hank's液 • 5、青、链霉素母液（10000U/mL 青霉素G； 10000µg/mL硫酸链霉素
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• (5)将针头弃于合适的生物安全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床
采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。
• 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度：
0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度：
25mM）
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （2）病毒生长液
• 每500mL细胞维持液中加入0.5mL的TPCK胰酶（母液浓度为2mg/mL）使TPCK-胰酶 的终浓度为2µg/mL。2．流感病毒MDCK细 胞分离步骤：
二、流感病毒分离之鸡胚培养法 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带
或淤血块
• 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊
膜与鸡胚
• 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
一、流感病毒MDCK细胞分离方法
• （一）生物安全要求 • H5,H7亚型致病性禽流感病毒，H2N2亚
型流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物安 全级别：BSL-3。实验操作人员需进行 BSL-3防护，具体详见“生物安全个人防护 SOP”。H5,H7亚型高致病性禽流感病毒， H2N2亚型流感病毒的MDCK细胞分离操作 必须在BSL-3级实验室的生物安全柜中进行。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• 6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 • 7、临床样品0.5mL • 8、1mL无菌移液管 • 9、10mL无菌移液管 • 10、15mL无菌离心管
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （三）实验步骤 • 1、准备病毒生长液 • （1）细胞维持液准备 • 500mL D-MEM液中加入 • ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达：
“—”：不凝集，红细胞沉于管底，呈一边缘整齐的致密圆点。
中移出。 • ②用无菌的移液管吸取适量临床标本置于细胞培养瓶中，
温和摇动数次。 • ③然后放于37℃，5%CO2培养箱中吸附1～2h。 • ④吸出接种物，用10mL的无菌移液管吸取6mL Hank's液
分别清洗细胞2遍。然后加入6mL病毒生长液于细胞培养 瓶中。 • ⑤放置于33～35℃培养箱培养。 • ⑥每日观察细胞病变情况。（细胞病变的特征是细胞肿胀 圆化，细胞间隙增大，细胞核固缩或破裂，严重时细胞部 分或全部脱落）。 •
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
凝，在管底中心形成小红点。
“++”：约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不
凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。
“+”：只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小
圆点，凝集的红细胞在小圆点的周围。
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• （3）细胞培养物的收获
• 当75%～100%细胞出现病变时进行收获， 收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融 1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即 使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。 收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次， 然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于 15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病 毒液可以立即进行后续试验，或冻于-80℃ 冰箱待以后试验使用。
育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
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• （二）、接种样本
• 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。
• （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。
• (3)用注射器吸800µl标本。
• (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2 个鸡胚。
• （1）75％～90％成片细胞的准备，以选取 T25细胞瓶为例。
• ①用40×物镜观察细胞生长状态。
• ②轻轻倒出细胞生长液，用10mL的无菌移 液管吸取6mL Hank's液分别清洗细胞3遍。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• （2）细胞培养瓶的接种 • ①用无菌的移液管将清洗细胞的Hank's液从细胞培养瓶
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
• 其余流感病毒的MDCK细胞分离实验室生物 安全级别：BSL-2。实验操作人员需进行 BSL-2防护，具体详见“生物安全个人防护 SOP”。其余流感病毒的MDCK细胞分离操 作必须在BSL-2级实验室的生物安全柜中进 行。
资料仅供参考,不当之处，请联系改正。