病毒的分离与鉴定ppt课件
病毒的纯化和检测.ppt
(二) 病毒的数量与感染性测定
• 1.蚀斑测定
• 是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。 将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。 病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养 琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。 结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中 可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如 中性红) 染色，则活细胞着色，受病毒感染而 破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑 (plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗 粒形成的，称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,PFU)。病毒悬液中的感染性 病毒量的滴度可用PFU／ml表示。
• 病毒的纯化可以应用提纯蛋白质的技术方 法；
• 对大小、形状和密度高度一致的病毒粒子， 可以采用分级分离的技术。
四、病毒萃取液的分级纯化
• 沉淀法 ➢中性盐沉淀法
➢聚乙二醇沉淀法
➢有机溶剂沉淀法 ➢等电点沉淀法
• 离心法
➢差速离心法 ➢密度梯度离心法
速率区带离心法 等密度区带法
➢凝胶色谱法 ➢电泳法
生产较复杂、成本高
生产简单、成本低
二、人工被动免疫
• 人工被动免疫的制剂有免疫血清和丙种球蛋白， 或与细胞免疫有关的因子等。大多数人均受过不 同种类的病毒感染，从正常血清中提取免疫球蛋 白可用于紧急预防。常注射人免疫球蛋白预防甲 型肝炎、麻疹、脊髓灰质炎等。可使接触病原者 不出现症状或仅出现轻微症状。近年来有人应用 含有高滴度抗HBs的乙肝免疫球蛋白Ig) 预防乙型 肝炎有一定效果。在使用免疫球蛋白时因其半衰 期短，故应注意有效期。
微生物实验十 流感病毒的分离培养 PPT课件
• （二）、接种样本 • 将标记好的鸡胚的气室朝上放置在照蛋器上。 • （2）用75％酒精消毒鸡胚，用无菌镊子在气室 端钻孔，再无菌眼科剪剪开10x6mm窗口。 • (3)用注射器吸800µl标本。 • (4)从窗口中滴入无菌的液体石蜡，轻轻晃动鸡胚， 让液体石蜡在鸡胚壳膜内层铺开，此时在照蛋灯 下即可清楚的看到鸡胚胎的位置。将注射针头刺 入胚胎的鄂下胸前，用针头轻轻拨动下颚及腿， 当进入羊膜腔时，能看到鸡胚随着针头的拨动而 动，即可注射200µl标本。将针头退出至½ 寸，将 另外200µl标本注入鸡胚尿囊腔。每个样本接种2全装置中 • (6)用消毒过的医用胶布封口 • (7)33～35oC 温箱培养鸡胚2～3 天。临床 采样标本通常培养3天，病毒传代通常培养 2天。 • 注意：鸡胚进行病毒分离培养时，每天检 查鸡胚生长情况，24小时内死亡的鸡胚， 认为是非特异死亡应弃去
+++”：大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不
二、流感病毒分离之鸡胚培养法
• （一）、检视标记鸡胚 • （1）用照蛋灯检视鸡胚，判断鸡胚状态 • 血管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血带 或淤血块 • 胎动：活胚有明显的自然运动，死胚无胎动 • 绒毛尿囊膜发育界限：密布血管的绒毛尿囊 膜与鸡胚 • 胎的另一面形成明显的界限 • （2）标记出鸡胚的气室与尿囊的界限 • （3）如果鸡胚是死胚、没有受精、有裂痕、发 育不全、或表面有好多渗水孔，应弃掉
• • • • •
6、牛血清白蛋白组分Ⅴ，7.5%溶液 7、临床样品0.5mL 8、1mL无菌移液管 9、10mL无菌移液管 10、15mL无菌离心管
• • • • •
（三）实验步骤 1、准备病毒生长液 （1）细胞维持液准备 500mL D-MEM液中加入 ①青、链霉素母液 5mL（终浓度达： 100U/mL青霉素；100µg/mL链霉素） • ②牛血清白蛋白组分Ⅴ 12.5mL（终浓度： 0.2%） • ③HEPES缓冲液 12.5mL（终浓度： 25mM）
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离…（一）病毒的分离病毒分离的一般程序是：检验标本→杀灭杂菌(青、链霉素)→接种易感的动物→出现病状鸡胚→病变或死亡细胞培养→细胞病变→鉴定病毒种型(血清学方法)无菌标本(脑脊液、血液、血浆、血清)可直接接种细胞、动物、鸡胚；无菌组织块经培养液洗液洗涤后制成10～20%悬液离心后，取上清接种；咽洗液、粪便、尿、感染组织或昆虫等污染标本在接种前先用抗生素处理，杀死杂菌。
1．细胞培养用分散的活细胞培养称细胞培养（Cell culture）。
所用培养液是含血清（通常为胎牛血清）、葡萄糖、氨基酸、维生素的平衡溶液，pH7.2～7.4。
细胞培养适于绝大多数病毒生长，是病毒实验室的常规技术。
原代细胞培养(Primary cell culture) 用胰蛋白酶将人胚（或动物）组织分散成单细胞，加一定培养液，37℃孵育1-2天后逐渐在培养瓶底部长成单层细胞，如人胚肾细胞、兔肾细胞。
原代细胞均为二倍体细胞，可用于产生病毒疫苗，如兔肾细胞生产风疹疫苗，鸡成纤维细胞产生麻疹疫苗，猴肾细胞生产脊液灰质炎疫苗。
因原代细胞不能持续传代培养，故不便用于诊断工作。
二倍体细胞培养(Diploid cell cultune) 原代细胞只能传2-3代细胞就退化，在多数细胞退化时，少数细胞能继续传下来，且保持染色体数为二倍体，称为二倍体细胞。
二倍体细胞生长迅速，并可传50代保持二倍体特征，通常是胚胎组织的成纤维细胞（如WI-38细胞系）。
二倍体细胞一经建立，应尽早将细胞悬浮于10%二甲基亚砜中，大量分装安瓿贮存于液氮（-196℃ ）内，做为“种子”，供以后传代用。
第七章2病毒分离鉴定PPT课件
缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的 病毒。
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(三）细胞培养
细胞培养(cell culture)是指利用机械、酶或化 学方法使动物组织或传代细胞分散成单个乃至 2～4个细胞团悬液进行培养。
根据细胞的类型和培养 细胞代数的不同，可将 其分为两种。
有血凝素（HA）的病毒能凝集人或动物红细胞，称为血凝现 象，血凝现象能被相应抗体抑制称为血凝抑制试验，原理是 相应抗体与病毒结合后，阻止病毒表面HA与红细胞结合.
血凝试验
血凝抑制试验
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四、 电子显微镜检查
病毒的很多特征如大小、形态、结构等 必须借助电子显微镜进行检查。对于目前尚 难培养而形态又非常典型的病毒，可直接从 感染组织或分泌液，或者接种病料的鸡胚和 细胞培养收获的材料作电子显微镜检查，直 接观察病毒粒子。
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透射电子显微镜
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1. 正染法：超薄切片法
取材
戊二醛 固定
四氧化锇
清洗与 脱水
切片
染色
铀染 铅染
浸透 包埋 聚合
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鸡痘病毒（超薄切片）
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超薄切片法的优缺点：
优点：可观察病毒形态和形态发生过程 缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存
测定抗体
潜伏期及前驱期 刚发病或急性期
较难查见 最多查见
未增多
未增多或增多 不明显
恢复期及康复期
很难查见
明显增多 （常超过4倍）
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一、标本的处理
常见病毒鉴定ppt课件
腮腺炎病 毒
球形，核心为单股负 链RNA，衣壳呈螺旋 对称，有包膜
一侧或双侧腮腺肿大，伴有疼痛、 发热
第一节 呼吸道病毒
三、其他呼吸道病毒
病毒名称 形态结构
所致疾病
腺病毒
球形、双链DNA、核 咽炎、扁桃体炎、肺炎、流行性眼
衣壳20面体对称、无 结膜炎、急性出血性膀胱炎、胃肠
包膜
炎等
副流感病 毒
球形、单负链RNA、 核衣壳螺旋对称、有 包膜
月
第二节 肝炎病毒
3.培养特性 易感动物：黑猩猩，狨猴，鹰面猴，短尾猴 允许性细胞：Vero、恒河猴胚肾细胞
（FRHK-4）、人肝癌细胞株（PLC/PRF/S） 等 在培养细胞中生长缓慢，无CPE
第二节 肝炎病毒
（二）微生物学检验
HAV-IgM检测：早期、快速诊断最可靠的血清学指标 HAV-IgG检测：主要用于了解既往感染史、疫苗免疫、效 果评价或流行病学调查 分离培养：原代肝细胞或恒河猴胚肾传代株细胞对HAV敏 感，生长缓慢，不引起细胞裂解
第十八章 常见病毒鉴定
本章内容
1 第一节 呼吸道病毒 2 第二节 肝炎病毒 3 第三节 反转录病毒 4 第四节 疱疹病毒 5 第五节 肠道病毒 6 第六节 朊粒及其他病毒
学习目标及重点
学习目标： 掌握流感病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、肠道病毒的主要生物学特点, 各病毒的传播途径、临床检验和防治原则 区别乙型肝炎病毒常见抗原抗体的组成及其临床意义 五种肝炎病毒常用鉴定方法 解释流感病毒变异和流行的关系 了解朊粒的生物学特征 本章重点： ★流感病毒、肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒、肠道病毒的生物学特性和致病性 ★常见病毒的检验方法
第一节 呼吸道病毒
3.培养特性： 在鸡胚羊膜腔和尿囊腔中增殖 红细胞吸附试验（hemoadsorption test） 易感动物为雪貂 4.抵抗力： 抵抗力较弱 不耐热，56℃ 30分钟可灭活病毒 室温下很快丧失传染性
病毒分离鉴定54页PPT
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿
Hale Waihona Puke 谢谢！病毒分离鉴定
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
病毒的分离鉴定
病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。
1. 病毒的分离1.1 标本的处理1.1.1 标本的收集a）粪便标本：将5g粪便标本和50ml PBS放入盛有20-25颗玻璃小珠的100ml无菌瓶中，搅拌成悬液，倒出上清，3000X g, 4C离心6min 。
b）拭子和生物体液：拭子浸在2-3ml 运载培养基中，将棉拭子中的液体尽量挤出以获得标本，如果液体被污染，应3000X g 4C离心30min。
c）组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的PBS制备成20%的悬液，3000X g 4C离心30min。
1.1.2 除菌处理a）粪便可加青链霉素使最终浓度为10000单位/毫升，置4C过夜。
b）鼻咽拭子一般加抗生素最终浓度为2000单位/毫升，置4C作用4小时c）对乙醚有抵抗的病毒如鼻病毒、肠道病毒、呼肠孤病毒、腺病毒、痘病毒等，则可加入等量的乙醚4 C过夜除菌。
1.2病毒的分离培养病毒是严格的细胞内寄生微生物，培养病毒必须使用细胞。
根据病毒的不同选用敏感动物（动物接种）、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养）。
1.2.1鸡胚接种a）鸡卵的选择：一般都选新鲜、10天以内的受精卵以保证规格质量上的一致b）孵育：孵育时可将鸡卵放入卵箱内进行，气室向上，孵育的最适温度为38--39C，相对湿度为40—70%，孵育8日后，鸡卵应每天翻动1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。
c）检卵：鸡卵孵育4〜5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次）。
①未受精鸡卵：在检卵器上仅见到模糊的阴影。
②活鸡卵：鸡胚发育4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚），有明显的自然转动。
③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。
病毒的分离与鉴定(一)ppt课件
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病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
实验材料 (1)脑炎病毒悬液. (2)小白鼠(3W龄). (3)1ml的注射器、针头. (4)碘酒、酒精棉球. 实验方法: (1)以左手将小白鼠头部和体部固定于台面. (2)用碘酒、酒精棉球消毒头部右侧眼、耳间部位
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病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
(3)以1ml的注射器抽提病毒悬液,以右手持注射器, 将针头向眼外与耳根连线中点略偏向耳的方向刺 入颅腔,约进针2~3mm,注入量0.02~0.03ml. (4)注射完毕,将用过之物煮沸消毒. 实验结果: 接种后每日观察动物2次.动物一般在接种后3-4d后 开始发病,食欲减退,活动迟缓,耸毛、震颤、卷曲、 尾强直,逐渐导致麻痹、瘫痪而死亡.
实验九
1
病毒的分离与鉴定（一）
1、病毒的培养与鉴定 2、病毒的CPE过程 3、病毒的电镜照片观察 4、流感病毒的分离鉴定（一）
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内
接种
2
流感病毒的分离鉴定
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种 目的：熟悉人工培养病毒的常用方法及其操 作技术。
(+)
(—)
作血凝抑制试验 盲传鸡胚两代，仍为
阴性时报告阴性
5
实验方法：
(1)取孵育10~12d鸡胚, 在检卵灯下画出气室 界线,于胚胎附近无大 血管处画出标记作为 注射入口. (2)将卵置于卵架上,消 毒标记处,用无菌剪刀法：
(3)用灭菌注射器吸取流感病毒液 0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射. (4)注射后,用无菌胶布 封孔,置35度温箱孵育. (5)每日在灯下检视鸡 胚情况(若鸡胚在接种 后24h内死亡为非特异 性死亡,应弃之).
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病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
(3)以1ml的注射器抽提病毒悬液,以右手持注射器, 将针头向眼外与耳根连线中点略偏向耳的方向刺 入颅腔,约进针2~3mm,注入量0.02~0.03ml.
(4)注射完毕,将用过之物煮沸消毒.
• 实验结果:
接种后每日观察动物2次.动物一般在接种后3-4d后 开始发病,食欲减退,活动迟缓,耸毛、震颤、卷曲、 尾强直,逐渐导致麻痹、瘫痪而死亡.
(5)每日在灯下检视鸡
胚情况(若鸡胚在接种 后24h内死亡为非特异 性死亡,应弃之).
病毒的动物接种法－小白鼠脑内接种
• 实验材料
(1)脑炎病毒悬液. (2)小白鼠(3W龄). (3)1ml的注射器、针头. (4)碘酒、酒精棉球. • 实验方法: (1)以左手将小白鼠头部和体部固定于台面. (2)用碘酒、酒精棉球消毒头部右侧眼、耳间部位
实验方法：
(1)取孵育10~12d鸡胚, 在检卵灯下画出气室
界线,于胚胎附近无大
血管处画出标记作为
注射入口.
(2)将卵置于卵架上,消 毒标记处,用无菌剪刀 尖在标记处打一小孔.
实验方法：
(3)用灭菌注射器吸取流感病毒液 0.2ml,由小孔刺入0.5cm后,进行注射. (4)注射后,用无菌胶布 封孔,置35度温箱孵育.
病毒的分离与 鉴定
病毒的分离与鉴定（一）
• 1、病毒的培养与鉴定
• 2、病毒的CPE过程
• 3、病毒的电镜照片观察
• 4、流感病毒的分离鉴定（一） • •
（1）鸡胚尿囊腔接种法 （2）病毒的动物接种法－小白鼠脑内 接种
流感病毒的分离鉴定
• （1）鸡胚病毒的常用方法及其操 作技术。
鸡胚尿囊腔接种法
• 实验材料： • (1)来亨鸡受精卵、卵架、检卵灯。
• (2)碘酒、酒精消毒棉球。
• (3)灭菌的手术刀、镊子、剪刀。 • (4)1ml注射器及针头。 • (5)病毒液:流感病毒、新城鸡瘟病毒。 • (6)无菌胶布。
•
分离鉴定程序 病人急性期咽喉含漱液 (经双抗处理) 鸡胚培养(羊水囊或尿囊腔) 35℃ ，72h 收获：取羊水或尿囊液作血凝试验 (+) (—) 作血凝抑制试验 盲传鸡胚两代，仍为 阴性时报告阴性