聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳简称PAGE
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凝胶浓度的选择与被分离物质分子量密切相关
二、电泳的原理
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（ native－PAGE）
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生物大分子在聚丙烯酰胺凝胶中泳动时，有电荷效应与分 子筛效应。不同的核酸或蛋白质，它们的分子量大小及构 型不同，所带净电荷的多少不同。电泳时的泳动率就不 同，从而分出不同的区带。在电泳分离后能保持蛋白质和 酶等生物大分子的生物活性。
三、电泳操作流程 (SDS-PAGE)
1.制备PAGE胶
固定玻璃板 灌注分离胶，水封, 静置待凝固 吸干水，灌注浓缩胶，插入梳子, 静置待凝固
注意： a.催化剂TEMED要在注胶前加入,否则胶凝结而无法灌注. b.空气中的氧气的存在影响凝胶的聚合，因此，水封的 目的是隔绝空气中的氧气，并且使分离胶顶部平整。
相对迁移率 mR ＝
蛋白质样品区带中心迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心迁移距离(cm)
四、电泳的应用
常规的聚丙烯酰胺凝胶电泳适合于核苷酸多态性和蛋 白质的分析、分离。 SDS-PAGE则常用于测定蛋白质的分子量和蛋白质的 亚基数。目前已发现有些蛋白质不能用 SDS-PAGE测定分 子量。如电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的 蛋白质（某些糖蛋白）以及一些结构蛋白，如胶原蛋白等。
c.Acr和Bis具有神经毒，操作时应戴手套。Acr/Bis储液于棕色 瓶4℃保存。
2.加样
电泳槽内注入电极缓冲液， 使其完全淹没浓缩胶顶部， 小心拔出梳子
经SDS处理的样品， 于沸水中加热3 min， 以除去亚稳态聚合。
用微量移液器于距 槽底三分之一处进样
3.电泳
加样后的凝胶，应立即电泳。 样品进浓缩胶，电流控制在20－30 mA； 样品进分离胶，电流控制在40-50 mA。 待溴酚蓝条带泳动到距离胶板前沿约1-2cm处， 停止电泳。
电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳
.电泳技术.第一节第二节电泳技术概述常见电泳技术.常见电泳技术第二节纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳梯度凝胶电泳等电聚焦电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹电泳毛细管电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE.PAGE应用围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。
.1、聚丙烯酰胺凝胶的特点①可用于分离不同分子量的生物大分子聚丙烯酰胺凝胶的特点②更高的灵敏度：10－9～10－12 mol/L③化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”④电泳分离的重复性好⑤透明度好，便于照相和复印⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存.⑦无紫外吸收⑧可用作固定化酶的惰性载体2、凝胶聚合的原理及有关特性（1）聚合反应凝胶单体丙烯酰胺加速剂四甲基乙二胺AcrTEMED交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis催化剂过硫酸铵(AP) 或核黄素.（2）凝胶孔径的可调性及其有关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系T(Acr和Bis总浓度)（%）= C(交联剂百分比)（%）= abmbab100100其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关a/b＞100 a/b=30 凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂完全透明而又有弹性C=6.5−0.3T不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。
当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
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把膜置于第二抗体中，温和振荡2小时
ß
在TBST中洗膜1小时，中间更换4次
ß
显影，定影这一步骤为最重要的步骤之一，非常容易出现问题，必须小心仔细，我们在实验中采用的是上海康成公司生产的第二代化学超敏发光试剂盒，说明书另附PDF。在实验中发现有时发光很快减弱；肉眼可以看到发光，但是底片显不出来等问题。联系了康成公司的技术员，改动如下：膜与发光显色剂接触时间改为2分钟（不是说明书中的5min），底片压片时间2分钟。显影时有一些基本的原则，如严格的避光，压片前注意排除气泡，压片过程中底片不能接触液体等，按照一定的规则放置膜。将底片压片曝光结束后，将其中一角折起以助定位。定影后将膜贴于显出的条带，条带旁表明marker条带。底片注明实验日期、名称。
（2）分类
western显色的方法主要有以下几种：
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
iii.底物荧光ECF
iv.底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
2.针对样品的常见问题
B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot（以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cruz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳法1.仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘或平板电泳槽组成。
其电泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电泳仪稳流挡上。
2.试剂(1)溶液A 取三羟甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L盐酸溶液48ml，再加水溶解并稀释至100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(2)溶液B 取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g，加水溶解并稀释至100ml,滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。
(3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀释至1000ml，置冰箱中保存，用前稀释10倍。
(4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加0.05mol/L氢氧化钠溶液3.0ml 与90％乙醇5ml,微热使溶解，加20％乙醇制成250ml。
(5)染色液取0.25％(W/V)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(6)稀染色液取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)三氯醋酸溶液至10ml。
(7)脱色液 7％醋酸溶液。
3.操作(1)制胶取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混匀，抽气赶去溶液中气泡，加0.56％过硫酸铵溶液2ml，混匀制成胶液，立即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使胶层高度达6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶面，管底气泡必须赶走，静置约30分钟，待出现明显界面时即聚合完毕，吸去水层。
(2)标准品溶液及供试品溶液的制备(3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标准品溶液50～100μl，为防止扩散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。
以下是一般
的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联剂（通常是二甲基亚砜）在缓冲液中混合，加热溶解，然后迅速倒入电泳槽或制备模具中，留下一端可以装入电极。
2. 固化凝胶：将凝胶慢慢冷却至室温，使其固化。
这通常需要约30分钟至1小时。
3. 准备样品：将待测样品与一定体积的加载缓冲液混合均匀（可以包含甲基绿或其他荧光染料），并加热处理。
这样做是为了使样品蛋白质裂解、去除二硫键、破坏二级和三级结构，以使所有蛋白质都呈线性链状。
4. 加载样品：用微量移液器向凝胶中的小孔加入已经处理好的样品。
5. 进行电泳：将电泳槽连接至电源并设定合适的电压和电流。
根据待测蛋白质的大小和分子量，可以选择不同的电泳条件（如电压、电流和时间）。
6. 着色和显影：电泳结束后，用染料染色或其他方法可视化蛋白质。
通常使用染料如明胶蓝或银染法来增强蛋白质的显色。
7. 分析和解读：根据电泳图像，分析和解读样品中的蛋白质分离情况，如判断蛋白质的相对分子量、纯度等。
请注意，以上步骤仅为一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，具体操作可能会根据实验目的和需求有所变化。
同时，操作和设备使用时应遵守实验室安全规定。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳1. 引言SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
通过SDS（十二烷基硫酸钠，Sodium Dodecyl Sulfate）将蛋白质变性并赋予负电荷，在凝胶电泳中，根据蛋白质的分子量大小，使蛋白质在电场中向阳极方向运动，从而实现蛋白质的分离。
SDS-PAGE广泛应用于蛋白质的分子量测定、复杂蛋白质混合物的分离、蛋白质组学研究等领域。
它具有简单易行、高分辨率、高灵敏度以及可以与其他技术（如质谱、Western blot 等）结合等优点。
本文将介绍SDS-PAGE的原理、实验步骤和关键注意事项，并提供相关的Markdown文本格式输出，以便读者在实验中参考。
2. 原理SDS-PAGE的原理基于SDS的作用。
SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，能够使蛋白质在水溶液中均匀地带上负电荷，同时使蛋白质变性并展开成线性构象。
在电泳过程中，SDS包裹在蛋白质中，使蛋白质的电荷密度保持均一，从而使蛋白质的迁移速率仅与蛋白质的分子量有关，而与蛋白质的电荷无关。
SDS-PAGE通常在聚丙烯酰胺凝胶上进行。
聚丙烯酰胺是一种化学稳定性强的凝胶材料，通过聚合物的交联形成网状结构。
在凝胶电泳过程中，根据蛋白质分子量的不同，蛋白质能够在凝胶孔隙中以不同程度的速率迁移。
3. 实验步骤3.1. 制备凝胶1.准备1.5 M的Tris缓冲液，pH 8.8。
2.准备汀凝胶的原液，将30%丙烯酰胺溶液、1.5 MTris缓冲液和10%过硫酸铵按照体积比例（29:1:10）混合均匀。
3.快速加入TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺）溶液至原液中，并迅速倒入凝胶模具中。
4.在凝胶模具上方加入异丙醇以防止凝胶表面生成凝胶。
3.2. 样品处理1.取适量的蛋白质样品。
2.加入相应的样品加载缓冲液（含有SDS和还原剂，以及测量样品体积比例的溶液）。
3.在冰上煮沸5分钟，使蛋白质样品变性并带上负电荷。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术是一种常用的生物分子电泳分
离技术，它可以用来分离、鉴定、分析不同分子量的碱基链，以及抗
原和抗体。
PAGE是通过聚丙烯酰胺凝胶作为分离层来分离和分析物质
的一种电泳技术，具有灵活性好、精密度高等优点，一直被应用于生
物学研究中。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）作为生物分子电泳的基础技术，用
于分离纯化各种类型的微缩生物，包括蛋白质，核酸和糖苷。
由于这
种技术具有灵活性强、精密度高，一直广泛应用于多学科领域。
分离Pakage包括多个步骤，包括以下几种步骤:样品制备、电泳、高压灌注、凝胶固定等。
PAGE技术的工作原理是利用水相中分子在凝胶中受到质子交换效应、静电力场和电迁移矢量力的影响，使不同分子类型在空间上形成
不同分布，进而可以检测出不同分子类型的特征。
聚丙烯酰胺凝胶的
特点是可以用来分离和分析多种组分，而且可以快速、灵活、有效地
分离出不同的分子，可以用来分析多种环境和生物样本中的物质。
PAGE技术在生物研究中具有重要现实价值，使用PAGE可以快速、精准地检测出各种生物体中不同类型的碱基链和抗原抗体。
另外，PAGE的质量控制指标相当严格，可以保证对检测结果的精准度。
由此
可见，这种PAGE技术在分离物质方面有无可比拟的优势，受到了生物
学研究的广泛应用。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)实验报告一、实验目的1.学习SDS-PAGE分离蛋白质的原理；2.掌握垂直板电泳的操作方法。
二、实验原理1、电泳：(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。
(2)影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。
2、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）(1)定义聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
SDS-PAGE:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）(2)SDS的作用SDS是一种阴离子去垢剂，可与蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。
由于SDS带有大量负电荷，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖,即消除了蛋白质分子之间电荷差异。
因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小(3) SDS-PAGE分类：¾SDS-PAGE按照缓冲液pH值和凝胶孔径差异分为连续系统和不连续系统两大类：连续系统：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统：缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度均不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳(4)聚丙烯胺凝胶的生成：聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。
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本章主要内容
• • • • • • • 基本原理 醋酸纤维薄膜电泳(CAME) 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS-PAGE电泳 琼脂糖凝胶电泳 等电聚焦电泳 双向电泳
概
念
• 带电粒子在直流电场中的作用下，在一定 介质（溶剂）中发生的向异性电极定向移 动的现象称为“电泳” • 利用电泳现象对混合物进行分离分析的技 术称为“电泳技术”
凝胶聚合的影响因素
• 空气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止， 故聚合过程中反应液应与空气隔绝 • 某些材料如有机玻璃等能抑制聚合反应 • 某些化学药物如赤血盐等可减慢反应速度 • 温度升高聚合加快，温度降低聚合减慢
聚丙烯酰胺凝胶的性质
• 总浓度T%：100ml凝胶胶机械强度增加。 但达15％时胶脆性增大，易断裂；T％过小则凝 胶稀软不易操作 • 交联度C%：交联剂Bis占单体Acr与Bis总量的百 分数 • T%值固定时，C％＝5％时孔径最小，高于或低 于5％时孔径相应变大。C%过大胶不透明，缺乏 弹性；过小则凝胶呈糊状
SDS-蛋白质复合物的形状
琼脂糖凝胶电泳
• 琼脂糖是从琼脂中提取出来的链状多糖 • 优点：(1)含液体量大，达98％～99％，近 似自由电泳，但样品扩散速度小，对蛋白 质吸附极少 (2)分辨率高,重复性好 (3)电泳 速度快 (4)透明,不吸收紫外线，可直接用紫 外检测仪测定 (5)区带可染色，样品易回收 • 缺点：含有较多硫酸根，电渗作用大 • 用途：用于核酸的分离、鉴定
点
• 凡是带电物质均可应用某一电泳技术分离， 并可进行定性定量分析 • 样品用量少 • 设备简单 • 可在常温进行 • 操作简便省时 • 分辨率高
蛋白质电荷的来源
电泳的基本原理
• • • • 带电粒子在电场中所受的力F=QE 所受阻力F’=6πrηv 电泳平衡时F=F’，则QE= 6πrηv 迁移率(电泳淌度)＝Q/ 6πrη,表示粒子在单 位电场强度下的泳动速度 • 不同物质能否利用电泳进行分离，决定于 两者迁移率的差别，有差别才能分离。电 泳后分开的距离与迁移率、电压、时间等 相关
等电聚焦电泳
（isoelectric focusing electrophoresis, IEFE）
• 利用具有线性pH梯度的电泳介质来分离等 电点不同的蛋白质 • 当蛋白质迁移至其pI相同的pH处，则不再 泳动，而浓缩成狭窄的区带 • 蛋白质因其等电点的不同而得以分离
pH梯度的形成
IEFE的聚焦效应
常规PAGE与SDS-PAGE的区别
IEFE优缺点
• 优点:(1)分辨率高,可将pI相差0.01～ 0.02pH单位的蛋白质分开 (2)区带狭窄 (3) 样品不管加到什么部位都可聚焦到其等电 点 • 缺点:(1)需用无盐溶液，而无盐溶液中蛋白 质易沉淀 (2)不适于在pI点不溶解或发生变 性的蛋白质
分子量范围与凝胶浓度的关系
PAGE的分类
• 根据具体操作分为：圆柱型，平板型（水 平方向、垂直方向） • 根据凝胶系统的均匀性分为：连续系统， 不连续系统
PAGE圆盘电泳示意图
不连续圆盘电泳示意图
不连续电泳的物理效应
• 样品浓缩效应：凝胶孔径不连续 缓冲液离子成分不连续 pH的不连续性 • 分子筛效应 • 电荷效应 各种蛋白质因所带的净电荷、分子量大小 和形状不同而得以分离
分
类
• 按有无支持物分为：自由电泳，区带电泳 （其中根据支持物的不同而有不同的名称 如纸电泳，琼脂糖电泳等） • 按电压分：低压电泳，高压电泳 • 按用途分：分析电泳，制备电泳，定量免 疫电泳 • 按支持物形状分：薄层电泳，平板电泳， 圆盘电泳，毛细管电泳 • 按区带形式分：盘状电泳，火箭电泳
特
PAGE常见问题
• 凝胶不聚合或聚合时间过长：最常见原因 是硫酸铵失效，需新鲜配制；室温较低时 聚合变慢，可调整硫酸铵和TEMED用量 • 指示剂向相反方向移动:电源连接错误，缓 冲液选择错误 • 指示剂前沿呈“曲线”：“微笑”现象由 凝胶冷却不均匀造成；“皱眉”现象多由 电泳装置不合适、底部气泡或靠近玻片的 凝胶聚合不完全引起
SDS-PAGE
• SDS：十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate），阴离子去垢剂 • SDS带有大量负电荷，大大超过天然蛋白 质原有的电荷量，从而消除或掩盖了不同 种类蛋白质间的电荷差异 • SDS作为变性剂和助溶剂，能断裂分子内 和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋 白质分子的二级和三级结构 • SDS-蛋白质的迁移率取决于分子量的大小
影响电泳的因素
• 样品的性质 • 电场强度 • 缓冲液： (1)pH值 (2) 成分 (3)离子强度 • 支持介质：吸附、电渗，分子筛 • 温度
电
渗
（electro-osmosis）
• 在电场作用下液体相对于固体表面的移 动称“电渗”
醋酸纤维薄膜电泳
（cellulose acetate membrane electrophoresis, CAME）
• 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺 （acrylamide, Acr）和交联剂甲叉双丙烯 酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis） 在加速剂（TEMED）和催化剂（硫酸铵） 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶
聚丙烯酰胺凝胶的聚合反应
聚丙烯酰胺凝胶
• 特点：(1)在一定浓度时，凝胶透明、有弹 性、机械性能好 (2)化学性能稳定，与被分 离物不起化学反应 (3)对pH和温度变化较 稳定 (4)几乎无电渗作用 ,只要Acr纯度高， 操作条件一致，则重复性好 (5)样品不易扩 散且用量少 (6)凝胶孔径可调节 (7)分辨率 高
• 醋酸纤维素是纤维素的羟基乙酰化形成的 纤维素醋酸酯 • 对蛋白质样本吸附少，分离速度快，时间 短，电渗作用虽然高但很均一，不影响分 离效果，经透明化处理后有利于光吸收扫 描测定和膜的长期保存 • 影响因素：膜的性质，缓冲液，电流和电 压，电泳时间和温度，电泳槽的密封性能
聚丙烯酰胺凝胶电泳
（polyacryamide gel electrophoresis, PAGE）