生化分离工程 第三章 沉淀

作 业
简述蛋白质的沉淀方法。 1 简述蛋白质的沉淀方法。 什么是盐析，影响盐析的因素有哪些？ 2 什么是盐析，影响盐析的因素有哪些？
第三章
沉淀
主要内容
Байду номын сангаас
第一节 蛋白质表面特性 第二节 蛋白质沉淀方法 第一节 蛋白质表面特性
蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成。 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成。 蛋白质的水溶液呈胶体性质， 蛋白质的水溶液呈胶体性质，在蛋造白质分子周围存在与蛋白质分子紧密或疏松结合的 水化层。是蛋白质形成稳定的胶体溶液、防止蛋白质凝聚沉淀的屏障之一。 水化层。是蛋白质形成稳定的胶体溶液、防止蛋白质凝聚沉淀的屏障之一。 蛋白质沉淀的另一屏障是蛋白质分子间的静电排斥作用。当双电层的电位足够大时， 蛋白质沉淀的另一屏障是蛋白质分子间的静电排斥作用。当双电层的电位足够大时，静 电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用，使蛋白质溶液处于稳定状态。 电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用，使蛋白质溶液处于稳定状态。
6 多价金属离子
多价金属离子： • 多价金属离子：向蛋白质溶液中加入一些高价金属离子而使蛋白 质沉淀下来。 质沉淀下来。 沉淀原理： 沉淀原理：金属离子可与蛋白质分子上的某些残基发生作用而使蛋 白质沉淀。 白质沉淀。
7 亲和沉淀法
亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物的或合成的分子（ 亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物的或合成的分子（免疫配位 基质、辅酶等） 体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特 殊选择性的分离技术。 殊选择性的分离技术。 沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特 沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附” 殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。 殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。 亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方 法。 初始阶段， ①初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配位 体络和形成沉淀； 体络和形成沉淀； 所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤， ②所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂 质； 用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体现中离解出来。 ③用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体现中离解出来。
影响盐析的因素
(1)无机盐种类：离子半径小，带电多，电荷密度高的阴离子，盐析效果 无机盐种类：离子半径小，带电多，电荷密度高的阴离子， 好。
值接近蛋白质pI值时， (2)pH值：pH影响Cohnx方程中的 值，pH值接近蛋白质pI值时，蛋白 pH值 pH影响Cohnx方程中的b值 pH值接近蛋白质pI值时 影响Cohnx方程中的 质溶解度最小。 质溶解度最小。 (3)温度：T影响Cohn方程中的b值。温度升高，b降低；温度降低 ，b升 温度： 影响Cohn方程中的 值 温度升高， 降低； 升 Cohn方程中的 降低 高。
沉淀原理： 沉淀原理： 有机溶剂能破坏溶质分子的水化层，降低溶质的溶解度； A 有机溶剂能破坏溶质分子的水化层，降低溶质的溶解度；B 有机溶剂降低水溶液的介 电常数，使溶质分子间的静电引力（库仑力）增大，导致溶质的凝集和沉淀。 电常数，使溶质分子间的静电引力（库仑力）增大，导致溶质的凝集和沉淀。
4 非离子型聚合物
透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等） 透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里 是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜 放在缓冲液中进行，可不断更换缓冲液，直至杂质被除去。 放在缓冲液中进行，可不断更换缓冲液，直至杂质被除去。
2 等电点沉淀
分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，改变盐的浓度(即离子强度) pH和温度条件下 Ks分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，改变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀的目 的。 分级盐析法：在一定的离子强度条件下，改变溶液的pH和温度达到沉淀的目的。 pH和温度达到沉淀的目的 β分级盐析法：在一定的离子强度条件下，改变溶液的pH和温度达到沉淀的目的。
利用蛋白质在pH pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分 • 利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分 级的方法称为等电点沉淀法。 级的方法称为等电点沉淀法。 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH pH到目的蛋白的等 • 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等 电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。
分段盐析
不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布 的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样， 的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调 节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。 节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。 常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大， • 常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大， 价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。 价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。 盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。 • 盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。 蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。 • 蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐 常用透析法。 常用透析法。
lgS=β-K lgS= -Ksμ
式中S为蛋白质的溶解度； 为离子强度； 为常数，与盐的种类无关，但与温度和pH有关； pH有关 式中S为蛋白质的溶解度； μ为离子强度； β为常数，与盐的种类无关，但与温度和pH有关； 为盐析常数，与盐的种类有关，但与温度和pH无关。 pH无关 Ks为盐析常数，与盐的种类有关，但与温度和pH无关。
非离子型聚合物： 非离子型聚合物：利用一些非离子型的高聚物来沉淀蛋白质的方 法。 沉淀原理：可能有降低蛋白质分子表面的水化程度或空间排阻作用 沉淀原理：
5 聚电解质沉淀法
聚电解质沉淀法： • 聚电解质沉淀法：利用一些含有重复离子化基团的水溶性聚合物
来沉淀蛋白质的方法 沉淀原理：与絮凝类似，在蛋白质间起架桥作用， 沉淀原理：与絮凝类似，在蛋白质间起架桥作用，同时还兼有盐 降低水化程度和电荷中和等作用。 析、降低水化程度和电荷中和等作用。
沉淀原理：蛋白质在其等电点时溶解度最低。 沉淀原理：蛋白质在其等电点时溶解度最低。
3 有机溶剂沉淀法
有机溶剂沉淀：向含有目标物质的溶液中加入水溶性的有机溶剂( • 有机溶剂沉淀：向含有目标物质的溶液中加入水溶性的有机溶剂(如丙 乙醇等) 而使目标物质发生沉淀的方法。 酮，乙醇等)，而使目标物质发生沉淀的方法。
第二节 蛋白质沉淀的方法
• • • • • • 盐析沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 非离子型聚合物 聚电解质 多价金属离子
1.盐析法
盐析沉淀法：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低， 盐析沉淀法：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低，发生沉淀的 现象。 现象。
中性盐：硫酸铵、硫酸钠、 中性盐：硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠等 盐析沉淀原理: 盐析沉淀原理: 由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电荷从而使蛋白质分子聚 由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电荷从而使蛋白质分子聚 水化膜 电荷 沉淀析出 集而沉淀析出。 集而沉淀析出。 蛋白质的盐析行为常用Cohnx经验式表示： Cohnx经验式表示 蛋白质的盐析行为常用Cohnx经验式表示：