常用westernblot试剂配方
Western blot试剂配方
SDS-PAGE相关试剂、缓冲液的配置方法1.5M Tris-HCl 组分浓度：1.5M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 36.33g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=8.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=6.8(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存1.0M Tris-HCl 组分浓度：1.0M配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于250ml蓝口瓶中。
Tris-base 24.22g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.调pH=7.5(在磁力搅拌器上进行)，定容至200ml，4℃保存10%SDS （W/V）组份浓度：10%（W/V）SDS配置量：200ml配制方法： 1.称取2g SDS。
2.加入200ml的去离子水后搅拌溶解。
注意：溶解定容SDS时不宜剧烈摇晃，避免产生过多的泡沫；10%SDS溶液在低温是易析出晶体，可以置于70℃溶解。
30%（W/V）丙烯酰胺组份浓度：30%（W/V）Acrylamide配制量：200ml配制方法：1.称量下列制剂，置于1L烧杯中。
丙烯酰胺58gN-N亚甲基双丙烯酰胺2g2.向烧杯中加入约150ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.加去离子水将溶液定容至200ml，用定性滤纸滤去杂质。
4.于棕色瓶中4℃保存。
注意：丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用具有积累性，配制时应戴手套等。
聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为有可能含有少量的未聚合成份。
10%APS （W/V）组份浓度：10%（W/V）过硫酸铵配置量：1ml配制方法： 1.称取0.1g过硫酸铵。
Westernblot所需溶液的配制.ea
WB所需溶液的配制1Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Running buffer) 5×5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液：Tris碱和72ｇ甘氨酸，5ｇ电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。
使用前，将5×稀释到1×：取200ml 5×，定容到1000ml。
2转膜缓冲液〔Sending buffer〕〔现用现配〕必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。
小片段可不加SDS。
310% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS〔Sodium Dodecyl Sulfate，SDS,C12H25O4NaS〕溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。
4注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。
5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。
使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。
4度存那么两周内用完，最多不能超过一个月。
负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。
6 10×TBS (Tris-buffered saline)的配置加HCl调pH到7.6，室温储存。
7TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置8 上样缓冲液〔loading buffer〕的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。
按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
9 stacking gel buffer (4×)10 5×Sample buffer (10ml)11封闭液的配置Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide12丽春红溶液：100微升冰醋酸，参加丽春红，用水稀释至10毫升。
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤
WesternBlot相关试剂配方及详细实验步骤Western Blot详细实验步骤及试剂配方1. 溶液配置1.1 5×SDS-PAGE上样缓冲液（Loading buffer）药品用量1 M Tris-HCl (PH=6.8) 1.25 mLSDS 0.5 gBPB（溴酚蓝，有毒）25 mg甘油 2.5 mL去离子水up to 5 mL分装至1.5 mL离心管中，每管500 μL，室温保存，使用前每管加入25 μL的β-巯基乙醇。
1.2 10×SDS-PAGE电泳缓冲液（Running buffer 母液）药品用量Tris 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144.2 gSDS 10 gddH2O up to 1 L室温保存即可，使用时稀释为1×的工作液，可回收反复使用4~5次。
1.3 Tris-HCl缓冲液（1）1.5 M Tris-HCl (PH=8.8)→制分离胶Tris (MW: 121.14) 45.43 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 8.8（2）1.0 M Tris-HCl (PH=6.8)→制浓缩胶Tris (MW: 121.14) 30.29 gH2O up to 250 mL浓盐酸调PH 6.8二者高压灭菌后，置于室温保存即可。
1.4 10% SDS (十二烷基硫酸钠)SDS 10 gddH2O up to 100 mL室温保存即可。
1.5 10% AP (过硫酸铵)→1.5 mL 离心管配制过硫酸铵（刺激性，腐蚀性） 0.1 g超纯水up to 1 mL混匀后，锡箔纸包住，避光处理，置于-20℃保存。
1.6 30% 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺 150 g甲叉双丙烯酰胺 4 gMilli-Q水 30 mL滤纸过滤，Milli-Q水定容至500 mL，装入棕色瓶子中，4℃保存。
1.7 10×转膜缓冲液(Trans buffer 母液)Tris (MW: 121.14) 30.3 gGlycine (甘氨酸) 144 g去离子水 up to 1 L室温保存即可，其1×的工作液配制为：100 mL母液+200 mL甲醇（有毒）+700 mL水。
Westernblot试剂配制及操作流程
Westernblot试剂配制及操作流程试剂配制：1.电泳缓冲液：a. 准备1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液（Tris-Glycine缓冲液）：每一升缓冲液中加入30.3g Tris base、288g glycine，并调节pH至8.3±0.1b. 准备3×SDS-凝胶缓冲液：每一升缓冲液中加入30g Tris base、144g glycine、10g SDS，并调节pH至8.3±0.12.蛋白提取缓冲液：a. 准备RIPA缓冲液：每一升缓冲液中加入5g Tris base、15g NaCl、5g sodium deoxycholate、1g NP-40，并将pH调节至7.4b.按需添加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。
操作流程：1.样品制备：a. 收集细胞或组织样品，加入适量的蛋白提取缓冲液，并使用超声波细胞破碎仪或玻璃Dounce破碎器破碎细胞，释放蛋白。
b.在4℃下离心细胞提取物，收集上清液，并在离心后尽快使用或存储在-80℃的冰箱中。
2.SDS-凝胶制备：a. 准备15%缩胆凝胶：加入7.5mL 30%丙烯酰胺、10mL 10×SDS-凝胶缓冲液、7.5mL去离子水和20uL 10%Tetramethylethylenediamine (TEMED)，混合均匀。
b.将混合液倒入立方形凝胶模具中，插入两根不锈钢导电丝作为电极，并进一步注入10%胶解剂。
c.待凝胶定形后，用1×蛋氨酸－甘氨酸缓冲液冲洗凝胶表面。
3.蛋白电泳：a.加载样品：将样品加入离心管中，加入1×电泳缓冲液以使样品浓度均匀。
b. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，通常每孔加入20-30ug样品。
c.进行电泳：将装有凝胶的电泳槽放入电泳缓冲液中，将蛋白电泳至凝胶顶部。
d.转移凝胶：根据需求选择湿式或半湿式转印方式，将蛋白转移到PVDF或NC膜上。
4.免疫印迹：a.封闭膜：将转印膜放入封闭溶液中（如5%脱脂奶粉或3%BSA）封闭非特异性结合位点。
Western blot试剂配制及操作步骤
Western blot试剂配制1．30％丙稀酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲双丙稀酰胺1g双蒸水定容到100ml，经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光，4℃保存于棕色瓶中2．1.5 M Tris-HCl (MW=121.1)pH 8.8Tris碱90.75g双蒸水400ml用浓HCl调pH至8.8，加双蒸水定容至500ml。
4℃冰箱保存3．1.0 M Tris pH6.8Tris碱12g双蒸水60ml用浓HCl调pH至6.8，加双蒸水定容至100ml。
4℃冰箱保存4．10％SDS(w/v）SDS 10g溶于加水至100ml，室温放置5．10％过硫酸胺（10%APS）过硫酸胺1g溶于10ml双蒸水中。
可在密闭的管子里4℃保存一周6．10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris 30.3g甘氨酸144gSDS 10g定容至1000ml室温放置。
临用时稀释成1×电泳缓冲液7．1%溴酚蓝（w/v）溴酚蓝Tris-base MilliQ 水100 mg60 mg定容至10 ml8．TEMED原液，4℃冰箱保存9．2×sample buffer(2×样品缓冲液)1.0 M Tris pH6.82.5mlSDS 0.8gDTT 0.3085g甘油3ml溴酚蓝0.004g加双蒸水至10ml，分装—20℃保存10. 4×SDS加样缓冲液10ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5mlSDS 0.8g溴酚蓝0.004g甘油4mlTakara5x buffer 总5ml1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25mlSDS 0.5g溴酚蓝BPB 25mg甘油 2.5ml500ul每管分装，使用前将25ul的2-ME加到没管中11．转膜缓冲液Tris 碱 5.8g甘氨酸 2.9gSDS 0.37g甲醇200ml加双蒸水至1000ml，临用前配制，4℃冷却12．1×TBSTTris 碱 3.0285 g氯化钠8.766gTween-20 500ul加双蒸水至1000ml，现配现用。
Western Blot试剂配方
1. 30%储备胶溶液：丙烯酰胺(Acr) 29.0g，亚甲双丙烯酰胺(Bis) 1.0g，混匀后ddH2O，37℃溶解，定容至100ml，棕色瓶存于室温。
2. 4×分离胶缓冲液(1mol/L Tris-HCl PH 8.8)：Tris 18.17g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 8.8，定容至100ml。
3. 4×浓缩胶缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl PH 6. 8) ：Tris 12.1g加ddH2O溶解，浓盐酸调PH 6. 8，定容至100ml。
4. 10%SDS：电泳级SDS 10.0g加ddH2O，68℃助溶，浓盐酸调PH 7.2，定容至100ml。
5. 5×电泳缓冲液(PH 8.3)：Tris 15.2g 甘氨酸94g ddH2O 定容到1000ml SDS 5g 先在974ml蒸馏水中加入Tris碱，待溶解完全后，再加甘氨酸，最后加SDS。
6. 10%过硫酸铵(AP)：0.1g AP加ddH2O至1.0ml，4℃保存，要在一周内使用，最好新鲜配制。
7. 2×加样缓冲液：2×SDS加样缓冲液，0.5mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2ml，10%SDS 4 ml，β-巯基乙醇1ml，甘油2ml，1%溴芬蓝1ml，置4℃避光保存8. TEMED：注意室温较低时TEMED量可加倍，最后灌胶之前再用9. 转膜缓冲液(Towbin transfer Buffer)：即1×SDS-Page10. 0.0 1mol/L PBS (PH 7.4) ：NaCl 8.5g，(12H2O)Na2HPO4 2.9011g，(2H2O)NH2PO4 0.24g，加ddH2O定容至1000ml11. 封闭液: 1×PBS中加入30ml，5%(V/V)脱脂奶粉1.5g，0.02%叠氮钠0.006g，0.05% Tween-20 0.015g12. 漂洗液(PBST)：含0.05% Tween-20的PBS溶液每1000 ml PBS溶液中加0.5 ml Tween-2013. 水饱和正丁醇：正丁醇50 ml，ddH2O 5 ml 加入瓶中震荡，使结合，存于室温。
western-blot 通用配方
1.Western Blotting 相关溶液及抗体1)转膜缓冲液（running buffer）(10×)(1L)Tris 30.3g甘氨酸144g不调pH转膜工作液（1×)(1L)（现配现用）(10×)转膜缓冲液（running buffer）100ml无水乙醇100ml水800ml2)TBS 缓冲液(5×)（1L）Tris-HCl 12.15gNaCl 146.4g用36-37%浓盐酸调节pH值至约7.4（约5ml浓盐酸，pH试纸检测即可）TBST：TBS+Tween-20 0.1%（1ml for 1L）3) 封闭液TBST 缓冲液中加入5%脱脂奶粉或者(3% Gelatine)4）Western Blotting 第一抗体适合于自己蛋白的抗体5）Western Blotting 第二抗体辣根过氧化物酶-羊抗兔IgG/(羊抗鼠IgG)4.实验步骤（1）SDS-PAGE 电泳分离蛋白质：(浓缩胶70V，30-40min；分离胶120V，1h)5×loading buffer: 4mlddH2O 1.76ml 1M Tris-HCl pH 6.8 0.24ml甘油1ml 10%（w/v）SDS 0.8mlß-巯基乙醇0.2ml（2）将4 张滤纸剪成与海棉大小一致的方形（3）配（1×)转膜工作液(10×)转膜缓冲液（running buffer）80ml无水乙醇80ml水640ml800ml（4）将胶泡在（1×)转膜工作液中（防止胶干掉，最好不要用水，水泡胶会涨）（5）用尺子量胶大小，裁PDVF膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）（6）PDVF膜先在无水乙醇中泡约1min,然后泡到（1×)转膜工作液中。
（PDVF膜为疏水性的，先在乙醇中泡会使其亲水性好）（7）将海绵和滤纸在水中浸湿，然后按照一下顺序(整个操作过程中保证膜不能干)：白板—海绵—两层滤纸--PDVF膜（靠正极）--胶（靠负极）（用小试管排气泡）--两层滤纸—海绵（用小试管排气泡）--夹住—放入胶槽中（白板靠红，黑板靠黑，保证电极方向不要错）--在胶槽中加入转子—倒入（1×)转膜工作液—在胶槽中放入冰袋—80V～100V 恒压，60min(该条件可以转移25kD～90kD的蛋白)(8)封闭：在封闭液中室温，摇1h或者4℃静置过夜。
常用western blot 试剂配方
Western blot常用试剂配方1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）丙烯酰胺29 g双丙烯酰胺1g加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。
2. 10% SDS：（10ml）电泳级SDS 1 g蒸馏水9 ml初始PH约为7.85，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至7.2，定容至10ml。
3.TEMED（四甲基乙二胺）（成品）4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH 8.8）：50mlTris-base 9.085 g蒸馏水45 ml加浓盐酸（约0.4ml）调PH至8.8后定容至50ml，4℃保存。
5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH6.8）：50mlTris-base 6.055 g蒸馏水44 ml加3.5ml浓盐酸调PH至6.8后定容至50ml，4℃保存。
6. 10%过硫酸铵（10% AP）：0.5ml 新鲜配制称取0.05g AP于1.5ml EP管中，储存于-20℃，用时溶于0.5ml蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50mlupper buffer 0.312 ml 15.6ml甘油（丙三醇）0.5 ml 25mlSDS 0.1 g 5gDTT 0.0385 g溴酚蓝0.005g 0.25g加蒸馏水溶解后定容至1ml。
取0.2ml加0.8ml蒸馏水配成工作液。
8. 5 × running buffer：（1000ml）Tris-base 15.1 g甘氨酸（Glycine）94 gSDS 5 g加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
用时加4000 ml蒸馏水。
9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）甲醇30 ml冰乙酸10 ml蒸馏水60 ml考马斯亮-250 0.05 g10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配乙酸（10%）50ml甲醇（30%）150ml加蒸馏水定容至500ml。
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Western blot常用试剂配方
1. 丙烯酰胺-双丙烯酰胺储存液：30% AB（100ml）
丙烯酰胺29 g
双丙烯酰胺1g
加蒸馏水至100ml，过滤，棕色瓶保存。
2. 10% SDS：（10ml）
电泳级SDS 1 g
蒸馏水9 ml
初始PH约为，用针尖蘸少许浓盐酸调PH 至，定容至10ml。
（四甲基乙二胺）（成品）
4. Lower-buffer （1.5M Tris-Cl PH ）：50ml
Tris-base 9.085 g
蒸馏水45 ml
加浓盐酸（约）调PH至后定容至50ml，4℃保存。
5. upper buffer（1.0M Tris-Cl，PH ）：50ml
Tris-base 6.055 g
蒸馏水44 ml
加浓盐酸调PH至后定容至50ml，4℃保存。
6. 10%过硫酸铵（10% AP）：新鲜配制
称取0.05g AP于EP管中，储存于-20℃，用时溶于蒸馏水7. 5 × loading buffer：（1ml）50ml
upper buffer ml
甘油（丙三醇）ml 25ml
SDS g 5g
DTT 0.0385 g
溴酚蓝
加蒸馏水溶解后定容至1ml。
取加蒸馏水配成工作液。
8. 5 × running buffer：（1000ml）
Tris-base 15.1 g
甘氨酸（Glycine）94 g
SDS 5 g
加蒸馏水溶解后定容至1000ml。
用时加4000 ml蒸馏水。
9. 考马斯亮蓝染液：100ml（可重复利用）
甲醇30 ml
冰乙酸10 ml
蒸馏水60 ml
考马斯亮-250 0.05 g
10. 考马斯亮蓝脱色液500ml：现用现配
乙酸（10%）50ml
甲醇（30%）150ml
加蒸馏水定容至500ml。
11. Transbuffer（PH ）：100ml 现用现配
Tris-base 0.3028 g
甘氨酸 1.4872 g
甲醇20 ml
加蒸馏水定容至100ml。
12. 10 x 丽春红染液（储存液）：（可重复利用）
（用时用蒸馏水稀释为1 X 的）染色后用纯水脱色
丽春红 2 g
三氯乙酸30 g
磺基水杨酸30 g
加H2O 定容至10 ml（储存液）。
4℃保存。
用1 × TBST洗脱
13. 10 ×TBS：500 ml
Tris-base 12.1 g
NaCl 40g
加浓盐酸5ml调PH至，加蒸馏水定容至500ml（储存液）。
4℃保存。
用时蒸馏水稀释为1 × TBS（1份10 ×储存液，9份水）.
14. 1 × TBST （加Tween-20的TBS）洗涤液：Tween-20含量%
15. 封闭液：含5%脱脂奶粉的TBST
脱脂奶粉1g
1 × TBST 20 ml
16. ECL 发光底物：两种溶液1:1混合，均匀涂于膜上。
17. H202配制
取普通纯水按照每10ml纯水加入40μl30% H2O2比例配成新鲜H2O2溶液替代ECL溶液B使用。