用地衣红染色法评价猪卵母细胞核成熟

用地衣红染色法评价猪卵母细胞核成熟卢庆，葛立军，高俊锋，曹爱巧，剧世强，芮荣*南京农业大学动物医学院，南京（210095）E-mail：rrui@摘要：用0.1%地衣红对猪卵母细胞进行染色检查，分析不同层数卵丘细胞对卵母细胞成熟的影响。

结果显示，3层及3层以上卵丘细胞包被的猪卵母细胞核成熟率为64.7%，明显高于3层以下卵丘细胞包被的卵母细胞或裸卵的核成熟率（分别为56.3%和33.3%）；3及3以上卵丘细胞包被的卵母细胞卵裂率和16细胞胚发育率均为最高，分别为66.7%和37.0%。

表明卵丘细胞对猪卵母细胞的核成熟及卵母细胞体外受精后的卵裂和早期胚胎发育，都具有明显的促进作用。

地衣红染色检查与其他成熟判断法相比，结果比较准确、重复性好。

关键词：地衣红染色，卵母细胞，核成熟，猪胚胎体外生产（IVP）主要包括卵母细胞体外成熟（IVM）、体外受精（IVF）和其后的体外培养（IVC）等技术环节。

猪IVP的效率与体内发育能力相比一直处于较低水平，其原因较为复杂，包括卵母细胞IVM不完全、精液质量不佳、多精受精或培养条件不合适等等。

从后续培养的结果来看，卵母细胞的来源和成熟质量仍为影响体外生产的关键环节[1]。

经过不断的技术改进，以TCM-199为基础的成熟培养液现已被广泛应用于猪卵母细胞的体外成熟。

在本实验室所获得的猪卵母细胞卵丘扩散率可基本稳定在80%左右；但有学者认为，卵丘扩散并不能完全代表卵母细胞成熟[2]。

如何评价卵丘包被对卵母细胞体外成熟的作用，正是本实验研究的目的所在。

通过用地衣红染色法分析不同的卵丘包被条件对卵母细胞成熟发育的影响，以期改进猪卵母细胞核成熟评价方法。

1. 材料与方法1.1猪卵母细胞采集从屠宰场采集猪卵巢，置于盛有37℃生理盐水（含青霉素、链霉素各500 IU/mL）的保温瓶内，于2.5 h内送达实验室。

将卵巢用添加1%新生牛血清（NCS）的改良杜氏磷酸盐缓冲液（mPBS）洗3-4次后用于采卵。

采用抽吸法采集卵巢表面直径2-5 mm卵泡卵母细胞，用带有8号或12号针头的注射器抽吸卵巢表面卵泡中的卵母细胞，抽吸的卵母细胞缓缓注入10 mL离心管中，37 ℃静置5 min，弃去上清；含卵母细胞的沉淀用少量mPBS液重新悬浮后转入10 cm培养皿内，于实体显微镜下检卵。

所获裸卵或卵丘-卵母细胞复合体（COC）用mPBS洗2-3次后，再用TCM199培养液1-2次备用。

1.2 卵母细胞体外成熟培养成熟培养液为TCM199，添加10% NCS、10%猪卵泡液（pFF）、10 IU/mL孕马血清促性腺激素（PMSG）、10 IU/mL人绒毛膜促性腺激素（hCG）、69µg/mL L-半胱氨酸、1µg/mL 17β-雌二醇(E2)、0.36mg/L丙酮酸钠、1mL/L乳酸钠、100IU/ml青霉素钠和100IU/mL硫酸链霉素[3]。

采用微滴法进行体外培养，制作100 µl成熟培养液滴，上盖石蜡油，在CO2培养箱内隔夜平衡。

每100 µl微滴中放入约15枚卵母细胞，于38.5℃、5%CO2气相和饱和湿度本课题得到上海市科技兴农重点攻关项目(沪农科攻字[2003]第14－1号)，国家自然科学基金(30270958)和江苏省自然科学基金(BK2002108)的资助。

作者简介：卢庆（1982－），硕士研究生，研究方向为动物生殖生物学。

*通讯作者的CO2培养箱中培养44 h。

1.3 地衣红染色法完全除去卵丘细胞的卵母细胞在PBS液中洗2次，置于 2.5%戊二醛溶液中固定30s-1min。

取出后移至生理盐水或PBS液中洗1-2次；在载玻片中央约为盖玻片大小的区域、相当于其4个角的位置，点上少量凡士林；将卵母细胞集中置于凡士林4个点的中央；放上盖玻片，于镜下轻压，并用生理盐水充满盖玻片。

放入有乙酸-乙醇（3：1）的容器内，4℃冰箱内保存3 d；期间每天取出3次过乙酸-乙醇。

第3天过无水乙醇，然后以0.1%地衣红染色5 min后，以乙酰甘油透明。

最后指甲油封片，镜下观察。

1.4 卵母细胞的体外受精体外成熟的猪MII期卵母细胞脱除卵丘细胞后，以15枚为1组，移入预先隔夜平衡的50 µL mTBM液中等待受精。

精子处理时，取1 mL鲜精用2 mL mPBS液离心洗涤2次，再用3 mL mTBM液离心洗涤1次，最后加入含200 µg/mL肝素的mTBM液，悬浮并调整精子浓度为1×106/mL，取50 µL精子加入含卵母细胞的mTBM液中；精卵共同孵育6~8 h后，移入隔夜平衡的100 µL NCSU-23培养液中进行体外培养。

培养条件为38.5 ℃、5% CO2气相和饱和湿度。

培养48 h后，检查卵裂情况，此后每天检查胚胎发育情况。

1.5 实验设计1.5.1 卵母细胞成熟的核相变化取生发泡期（GV期）或44 h培养的成熟（MII期）卵母细胞，去除卵丘细胞，作地衣红染色，观察其核相变化。

1.5.2 不同层数卵丘细胞对卵母细胞成熟的影响按COC质量分为3组：A组（A级卵母细胞）：胞质均匀，且包被3层及3层以上未扩展卵丘细胞；B组（B级卵母细胞）：形态良好，有少于3层或不完整卵丘细胞包被的卵母细胞；C组（C级卵母细胞）：形态良好的裸卵，无卵丘细胞包被。

成熟培养44 h后，取出先观察卵丘扩散情况；再用0.1％透明质酸酶处理5 min，用移卵管吹打去除卵丘细胞。

在倒置显微镜下检查第一极体（pbI）。

未观察到pbI的卵母细胞用乙酸-乙醇固定72 h，地衣红染色，观察核相变化。

1.5.3 不同层数卵丘细胞对早期胚胎发育的影响依1.4.2分组，卵母细胞成熟培养44 h后，随机取部分卵母细胞进行体外受精实验，观察卵裂与发育情况。

1.6 数据处理每个处理作4次及4次以上重复；所得数据用t检验进行统计学处理。

2. 结果2.1 卵母细胞的核相变化[4]在猪GV期卵母细胞内，均有一个较大的核，位于细胞中央或近边缘处，核膜清晰，有的明显可见核仁；接近生发泡破裂（GVBD ）时，核膜、核仁消失，染色质凝集成团块状；在第1次成熟分裂中期（MI ），染色体形成，并有规律地排列于赤道板上；后期及末期有时可见两团染色体的存在。

在M Ⅱ卵母细胞，往往可在卵周隙中见到pbI ，或在压片中看到两团染色体的存在，其中一团已经凝集形成染色质团，即为将要排出的pbI ，另一团呈分散分布，即为M Ⅱ期卵母细胞染色体（图1C ）。

据此标准，将胞质中出现第2次成熟分裂中期染色体、有pbI 或形成pbI 的染色体团块的卵母细胞判定为核成熟。

图1. 相差显微镜下的猪卵母细胞A. 经离心的新鲜猪GV 期卵母细胞（200×）；B. 地依红染色的GV 期卵母细胞（箭头示核；400×）；C. MII期卵母细胞（400×）；D. 排出pbI 的卵母细胞（400×）。

Fig 1. Photomicrographs of porcine oocytesA. Fresh porcine GV-oocyte after centrifugation;B. Porcine GV-oocyte with Orcein staining (nuclear arrowed);C.MII-oocyte; D. Oocyte with extruded pbI.2.2 不同层数卵丘细胞对卵母细胞成熟的影响pbI 率是指排出pbI 的卵母细胞数与检查的总卵数之比；GV 率、MI 率和MII 率则分别指依卵母细胞地衣红染色的核相判断标准，将处于GV 期、MI 期和MII 期的卵母细胞数与检查的总卵数之比。

其中，pbI 率与MII 率之和为核成熟率。

不同质量分组的COC 体外培养成熟结果见表1。

表1. 不同的卵丘包被对猪卵母细胞成熟的影响Table 1. Effect of different layers of cumulus cells on the maturation of porcine oocytes分组Group 卵数 No. oocytes pbI 率 pbI rate GV 率 GV rateMI 率 MI rate MII 率 MII rate 核成熟率 Nuclear maturation rate A 34 (20/34) (4/34)(7/34) (2/34) a (22/34) B 32 43.8% (14/32) 38.89%(7/18)38.89%(7/18) 22.22% (4/18) 56.3%b (18/32) C 42 26.2% (11/42)58.06%(18/31) 29.03%(9/31) 9.68% (3/31) 33.3%c (14/42) ，，同列数据后不同小写字母表示差异显著（P <0.05）。

Values with different letters within column are significantly different, P <0.05.由表1生成的图2可直观地反映出不同的卵丘包被对猪卵母细胞成熟的影响。

3层及3层以上卵丘细胞包被的卵母细胞核成熟率为64.7%（22/34），3层以下卵丘细胞包被的卵母细胞核成熟率为56.3%（18/32），裸卵的核成熟率可达33.3%（14/42）；3组间差异均显著，AB C D表明卵丘细胞对卵母细胞的核成熟具有明显的促进作用。

Fig. 2. 不同层数卵丘细胞包被的卵母细胞体外成熟核相2.3 不同层数卵丘细胞包被对卵母细胞体外受精胚发育的影响不同层数卵丘细胞包被对卵母细胞体外受精胚发育的影响见表2。

表2. 不同层数卵丘细胞包被对猪卵母细胞体外受精胚发育的影响Table 2. Effect of different layers of cumulus cells on the development of porcine IVF embryos分组Group卵数No. oocytes卵裂率（％）Cleavage percentage16细胞胚发育率（％）16-cell percentagea aB 76 50%(38/76) b 9.21%(7/76) bC 65 4.62%(3/65)c0(0/65)ca，b，c同列数据后不同小写字母表示差异显著（P<0.05）。

Values with different letters within column are significantly different, P<0.05.表2表明，3及3以上卵丘细胞包被的卵母细胞卵裂率和16细胞胚发育率均为最高，分别为66.7%(54/81)和37.0%(30/81)。