第六章微生物生长

（三）稳定期
2、原因 （1） 营养物的耗尽（特别是生长限制因子） （2） 营养物比例失调 （3） 酸、醇、毒素、H2O2等有害物质的积累 （4） pH、氧化还原电位 （5） 菌体量达到一定产量。

（三）稳定期

稳定期初期是收获菌体或与菌体生长相平 行的代谢产物的最佳时期，如SCP、乳酸。 稳定期是积累代谢产物时期 稳定期长短与菌体和外界环境条件有关， 生产上常常通过补料、调 pH 、温度等措 施，延长稳定期，以积累更多的代谢产物。
（a) 恒化培养系统；
(b)恒浊培养系统；
1.无菌培养基储存容器；2.流速控制阀；
3.培养室；4.排出管；5.光源；6.光电池；7.流出液
（一）恒浊连续培养法
概念：通过调节培养基流速，使培养液浊度 保持恒定的连续培养方法。
方法：当浊度高时，使新鲜培养基的流速加 快，浊度降低，则减慢培养基的流速。 特点：营养基质过量，微生物始终以最高速 率进行生长，并可在允许范围内控制不同 的菌体密度；但工艺复杂，烦琐。
使用范围：用于生 产大量菌体、生产 与菌体生长相平行 的某些代谢产物， 如乳酸、乙醇等。
（二）恒化连续培养法
概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定而保持细菌 生长速率恒定的方法。 原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、 生长因子等） ，使其始终成为生长限制因子，而 达到控制培养液流速保持不变，并使微生物始终在 低于其最高生长速率条件下进行生长繁殖。 特点：维持营养成分的亚适量，控制微生物生长速 率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产 量低于最高菌体产量。
即可定性，又可定量，用途广泛。 样品材料稀释，倾入平板或表面 涂布，在浓度比较低的平板上可 得到单菌落。

0.2ml
0.2ml
一. 纯培养的分离方法
（二）划线分离法 方法简便，用于微生物纯化、分离
（并非所有的菌都能在培养基上生 长 ，分离的为实际的10%）
一. 纯培养的分离方法
（三）单细胞挑取法 显微镜下操作
举例：大肠杆菌一个细胞一般重约10–12~10–13g，液体培养 物中细胞浓度达到2×109个/ml时，100ml培养物可得 10~90mg干重的细胞。
（一）测生长量
2、间接法 （1）比浊法 （2）生理指标法 细胞含氮量（细菌12.5%，酵母7.5%，霉菌 6.0%） 细胞含碳量 细胞其他指标，如P 、DNA等
凡是处于较低浓度范围内，可影响 生长速率和菌体产量的营养物， 称为生长限制因子。
（4）培养温度 大肠杆菌 10℃ 代时860分， 15℃ 代时120 分， 40℃ 代时17.5分 指数期因微生物生理特性较一致，生长速 率恒定是好材料，为最佳种子。

应用意义：
①由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种 的最佳菌龄；
代时 17min 12.5 16~18 29~44 18 18.3 66~87 26 48 23.5 344~46 792~93 1200
n为繁殖代数 G为代时 R为生长速率常数=1/G
t1、t2为时间
X1、X2为对应的菌数
（二）指数期
2.影响因素 （1）菌种：不同菌种的代时差别极大 E.coli 17 分，结核杆菌 792—932分 （2）营养成分：丰富时，生长快 （3）营养物浓度：影响生长速度及生长量。
（四 利用选择性培养基分离法等。 有目的选择某种微生物
二. 微生物生长的测定（测定群体的增 加量）
（一） 测生长量 （适用于细菌、放线菌、酵母菌、霉菌） 1、直接法： （1）粗放的离心管测体积法 ； （2）精确的称干重法 干重一般为湿重的10—20%

将一定量的菌液中的菌体通过离心或过滤分离出来 , 然后烘干(干燥温度可采用105℃、100℃或80℃)、 称重。一般干重为湿重的10%—20%，而一个细菌细 胞一般重约10-12—10-13g。 该法适合菌浓较高的样品。
一个世代所需的时间就是代时（G ）代 时能够反应细菌的生长速率，代时短， 生长速率快
菌名 培养基 培养温度 E. coli（大肠杆菌） 肉汤 37℃ E. coli 牛奶 37 Enterobacter aerogenes（产气肠细菌） 肉汤或牛奶 37 E. aerogenes 组合 37 B. Cereus（蜡状芽孢杆菌） 肉汤 30 B. thermophilus（嗜热芽孢杆菌） 肉汤 55 Lactobacillus acidophilus（嗜酸乳杆菌） 牛奶 37 Streptococcus lactis（乳酸链球菌） 牛奶 37 S. lactis 乳糖肉汤 37 Salmonella typhi（伤寒沙门氏菌） 肉汤 37 Azotobacter chroococcum（褐球固氮菌） 葡萄糖 25 Mycobacterium tuberculosis（结核分枝杆菌）组合 37 Nitrobacter agilis（活跃硝化杆菌） 组合 27
第六章 微生物的生长及其控制
第一节 微生物的 纯培养的获得及 生长测定
微生物的生长概念
• 个体生长 • 群体生长 个体繁殖 群体生长 个体生长+个体繁殖
由于微生物的个体极小，所以常用群体生 长来反映个体生长的状况
群体生长
生长是原生质总量增加的过程， 繁殖是个体数目的增加。 微生物的研究和应用中，只有群体的生长 才有实际意义。 个体-----个体生长----个体繁殖----群体生长 微生物学中指的生长均为群体生长。

①增加接种量；（群体优势----适应性增强）
（二）指数期
细胞以几何级数速度分裂的一段时期。 1、特点：
细胞平衡生长，菌体内各成分均匀； 代谢旺盛； 对理化因素敏感。 菌体量X2=X1· 2n
生长速率常数 R 最大，分裂时间最短；
由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间 隔称为世代
三种厌氧培养皿
四、大规模工业发酵生产 1、固体培养 好氧菌的曲法培养 将麸皮、碎麦、豆饼等固体基质经蒸煮 何自然接种后，薄薄地铺在培养容器 表面：生长 + 散热
通风曲槽结构模式图
曲床；2.风道；3.鼓风机；4.电动机；5.入风口；6.天 窗；7.帘子；8.曲料；9. 曲槽罩
四、大规模工业发酵生产
•同步细胞群体在任何一时刻都处在 细胞周期的同一相，彼此间形态、 生化特征都很一致，因而是细胞学、 生理学和生物化学等研究的良好材 料。
细菌的同步生长与非同步生长的曲线
一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔 滤膜上。
硝酸纤维素薄膜法
二、单细胞微生物的生长曲线



定量描述液体培养基中无分枝单细胞微生物群体 生长规律的实验曲线，称为生长曲线。 接种少量纯种单细胞微生物 分批培养

代谢产物和微生物细胞形成过程的关系
(a)酵母菌形成的初级代谢产物——乙醇；
应用意义：
发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸 等），生产上应尽量延长此期，提高产量， 措施如下： • 补充营养物质（补料） • 调pH • 调整温度
（四）衰亡期




死亡数＞新生数， 群体中活菌数目急剧下降，出现负生长， 细胞出现多形态、畸形、芽孢释放，R＜０ 衰亡期比其它各期时间更长，而且时间长度取 决于菌种及环境条件。 衰亡期的出现是由于培养环境对微生物生长明 显不利，使分解代谢大于合成代谢，最终导致 细胞大量死亡 。
对应线性纵坐标（左）；
.对应对数纵坐标（右）
丝状真ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ的生长曲线
三、厌氧微生物的培养（实验室）
厌氧手套箱
Hungate滚管技术 用高纯氮驱除小 环境中的空气，使培养基的配制、 分装、灭菌和储存，以及菌种的接 种、培养、观察、分离、移种和保 藏等过程始终处于高度无氧的条件 下，从而保证了厌氧菌的存活。 将菌接种到融化的培养基中，然后 将特制的试管，用丁基橡胶塞严密 后平放，置冰浴中均匀滚动，使含 菌的培养基布满在试管的内表面， 最后长出许多单菌落
②发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体 密度
③食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期 ④是生理代谢及遗传研究或进行染色、形态观察 等的良好材料。
（三）稳定期
1、特点： 生长速率常数 R=0 ，即新繁殖的细胞数与 衰亡相等，这时菌体产量达到了最高点 细胞开始贮存各种储藏物：异染颗粒等 芽孢开始形成， 次级代谢产物开始合成。
2、深层液体通气培养 应用大型发酵罐进行液体通气搅拌培养 50---500吨 优点：养料均匀、控制精确、纯种发酵、 生产稳定、规模庞大
发酵罐模型
商品酵母菌的三级培养过程
从历史发展的角度来看，微生物培养技 术的发展主要有以下特点：
（1）从少量培养发展到大规模培养。 （2）从浅盘培养发展到厚层固体或深层（液体）培养。 （3）从以固体培养为主发展到以液体培养为主。 （4）从静止式液体培养发展到通气搅拌式液体培养。 （5）从分批培养发展到连续培养以至多级连续培养。 （ 6 ）从游离的微生物细胞培养发展到利用固定化细胞培 养。 （7）从单一微生物培养发展到混合微生物培养。 （ 8 ）从利用野生菌种发展到利用变异菌株以及 “工程 菌”。
（二）
计繁殖数
2、间接法： （2）液体稀释法（半固体深层琼脂法） 一些厌氧菌在普通平板生长不好，可以用液 体稀释法 液体样品10的极差稀释
第二节 微生物的生长规律
一、微生物的同步生长 二、单细胞微生物的生长曲线
第二节 微生物的生长规律
一、微生物的同步生长 二、单细胞微生物的生长曲线
•进行同步分裂的细胞称为同步细胞。
测浊度
（二）
计繁殖数
1、 直接法： 计数板法（如：血球计数板法、细胞 计数板） 缺点：死活细胞都有 用染色剂可区别死活 酵母用美蓝、细菌用丫叮橙（紫外光）
（二）
计繁殖数
2、间接法： （1）平板菌落计数法（活菌） 好氧菌使用较好 操作同稀释分离过程 计数结果比直接计数低 操作烦琐