耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的IMP—4耐药基因LAMP检测
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制研究
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药机制研究黄峰;许元元;秦淑国【摘要】目的:探讨耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因及耐药特性.方法:对42株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌进行药敏试验、改良Hodge试验,并采用聚合酶链反应(PCR)方法检测细菌肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)基因.结果:42株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中,药敏试验结果显示耐药情况严重,仅对替加环素、阿米卡星、妥布霉素、复方新诺明较敏感.改良Hodge试验及KPC基因检测全部阳性,基因测序为KPC-2型.结论:KPC-2是引起肺炎克雷伯菌耐药的主要原因,应引起临床及实验室的关注.%Objective:To explore the drug resistance gene of Klebsiella pneumoniae carbapenemase,and its resistant features.Methods:The drug sensitivity test and modified Hodge test in 42 strains of Klebsiella pneumoniae carbapenemase were performed,and the KPC gene of bacterium was detected using PCR.Results:The drug resistance in 42 strains of Klebsiella pneumoniae carbapenemase were severe,which was sensitive to the tigecycline,amikacin,tobramycin and cotrimoxazole.The detection results of modified Hodge test and KPC gene were positive,and the type KPC-2 gene was identified.Conclusions:KPC-2 is the major cause of drug resistance of Klebsiella pneumoniae,which should be paid attention to in clinic and laboratory.【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2017(042)003【总页数】4页(P379-382)【关键词】耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌;耐药机制;改良Hodge试验【作者】黄峰;许元元;秦淑国【作者单位】皖北煤电集团总医院(蚌埠医学院第三附属医院) 检验科,安徽宿州234000;皖北煤电集团总医院(蚌埠医学院第三附属医院) 检验科,安徽宿州234000;皖北煤电集团总医院(蚌埠医学院第三附属医院) 检验科,安徽宿州234000【正文语种】中文【中图分类】R378.99肠杆菌科细菌作为医院感染和社区获得性感染的重要病原菌，可引起呼吸道、尿路等各种部位的感染以及菌血症，近年来由于抗菌药物的大量及不合理使用促进了耐药菌株的迅速扩散。
碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的药物敏感性及耐药基因检测
DOI ：10.11655/zgywylc2020.18.069基金项目：山西省软科学研究一般项目（2018041033⁃5）作者单位：030012太原，山西省人民医院检验科（崔巧珍、杨志宁）；北京大学人民医院检验科（王启）·医学检验·碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的药物敏感性及耐药基因检测崔巧珍王启杨志宁肺炎克雷伯菌是肠杆菌科细菌中引起院内感染的重要病原菌之一，而碳青霉烯类药物是治疗由肠杆菌科细菌引起感染的一类重要的抗菌药物，耐药一旦发生，临床治疗将面临极大挑战［1］，近年来碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRKP ）检出越来越多，由于其治疗困难而受到广泛关注。
美国疾病预防控制中心（CDC ）在2014年已将碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌（CRE ）列为迫切需要“采取行动的公共卫生威胁”［2］。
CRE 最主要的耐药机制是产碳青霉烯酶，CRE 中检出最多的是CRKP 。
目前我国临床分离的CRKP 中最常见的耐药机制是产肺炎克雷伯菌产生的A 组丝氨酸碳青霉烯酶（KPC ）型碳青霉烯酶［3，4］。
本文旨在分析山西省人民医院抗菌药物对CRKP 菌株药敏情况及耐药基因分布，为临床抗感染治疗提供实验室依据。
1材料与方法1.1菌株收集：收集菌株来源于2012年1月至2018年7月临床送检的各类标本中培养分离的非重复CRKP （亚胺培南、美罗培南或厄他培南任一中介或耐药者）菌株，共收集菌株46株。
1.2仪器与试剂：采用布鲁克MicroFlex 全自动质谱鉴定仪、法国梅里埃公司VITEK2⁃Compac 全自动细菌鉴定与药敏分析系统及配套试剂，血琼脂培养基（SBA ）、巧克力琼脂培养基为法国梅里埃公司现成品、中国蓝平板和药物敏感试验所用MH 等培养基购自天津金章生物技术公司现成品。
抗菌药物纸片均购自英国OXOID 公司。
PCR 扩增引物购自Invitrogen 公司；PCR 仪为美国Bio⁃Rad 公司生产。
2013~2017某医院耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因检测及分析
63 Journal of China Prescription Drug Vol.19 No.1·医院药学·饮片处方的质量的到了提高，但是仍存在一些问题，还需要继续强化合理用药意识，提升医师和药师的专业技术能力，运用适宜的管理方法进一步提高处方质量。
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IMP-4型金属β内酰胺酶合并膜孔蛋白OmpK36缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素高水平耐药
生堡捡墅匡兰苤壶垫！Ｑ玺！旦箜！！鲞筮２魍￡ｈ也』！坐丛型：墅巳！！虫塾望垫！Ｑ：！堂：箜：塑垒！表１肺炎克雷伯茵ｚ４、ｚ５及其ＩＭＰ－４转移接合子和ＩＭＰ－４质粒消除株ＭＩＣ测定结果（斗ｇ／ＩＩｌｌ）注：ＪＺ４、Ｊｚ５为肺炎克雷伯菌ｚ４、ｚ５ＩＭＰ－４转移接合予；ＸＺ４、ＸＺ５为肺炎克雷伯菌ｚ４、７＿５ＩＭＰ－４质粒消除株（从９ｍｍ变成２２ｍｍ）。
ｚ５用同样的方法传代至第２次也筛选出２株美罗培南抑菌圈直径明显变大的菌株（从１９ｍｍ变成２９ｍｍ）。
药敏结果（表Ｉ）显示，ｚ４和ｚ５转移接合子的药敏谱基本相同，亚胺培南、美罗培南和厄他培南的ＭＩＣ为１—２ＩＪｇ／ｍｌ，ＥＤＴＡ可将其抑制至与接合前大肠埃希菌ＥＣ６００相同的水平；ｚ４和ｚ５的转移接合子对氨苄西林、头孢他啶和头孢西丁高水平耐药（＞２５６斗ｇ／ｍ１），头孢噻肟和头孢哌酮／舒巴坦次之（６４斗ｇ／ｒｎｌ），对哌拉西林、哌拉西林／他唑巴坦和头孢吡肟的耐药程度较低（１６斗ｇ／ｍ１），对氨曲南、阿米卡星和环丙沙星敏感。
ｚ４和ｚ５质粒消除株的药敏谱差异较大，最明显之处在于ｚ５的质粒消除株对碳青霉烯类抗生素敏感，ｚ４的质粒消除株则表现为敏感性降低，亚胺培南、美罗培南和厄他培南的ＭＩＣ分别为０．２５、０．５和４∥ＩＩｌｌ。
质粒ＤＮＡ电泳图谱（图１）显示，Ｚ４可见约５５０００ｂｐ和５０００ｂｐ２个条带，ｚ５可见约５５０００ｂｐ和４０００ｂｐ２个条带，Ｚ４和ｚ５的转移接合子均获得约５５０００ｂｐ的条带，ｚ４和ｚ５的质粒消除株的条带分别与Ｚ４和ｚ５相似，仍可见约５５０００ｂｐ的条带，可能是由于ｚ４和ｚ５均含有２个或２个以上约５５０００ｂｐ的质粒，只是在琼脂糖电泳中无法分辨出来。
４．ＩＥＦ：由图２可见，肺炎克雷伯菌Ｚ４和ｚ５均在ｐＩ５．４和约９．０的位置有Ｂ内酰胺酶活性的条带，ｚ４和ｚ５的转移接合子仅在ｐＩ９．０的位置有一条带，ｚ５的质粒消除株在ｐＩ５．４的位置有一条带，ｚ４的质粒消除株则未见有１３内酰胺酶活性的条带。
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药性及同源性分析
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌 的耐药性及 同源性 分析
谢 思 陈 丽 丹 李 林 海 杨 永 泉 黄 晓 燕 张 莹 莹 石 玉 玲
摘 要 目的 ： 研 究本院耐碳青 霉烯类肺 炎克雷伯 菌（ Ｃ Ｒ Ｋ Ｐ ） 耐 药性 以及 菌株 间的同源性。方 法 ： 全 自动
ｍｏ ｄ ｉ ｉ ｆ ｅ ｄ Ｈｏ ｄ ｇ ｅ ｔ ｅ ｓ ｔ ａ ｎ ｄ Ｅ ＤＴ Ａ— ｄ ｉ ｓ ｋ ｓ ｙ ｎ ｅ ｒ ｇ ｙ ｔ ｅ ｓ ｔ ｒ ｅ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｌ ｙ ，Ｐ Ｃ Ｒ ｄ ｅ ｔ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｃ ａ ｒ ｂ ａ ｐ ｅ ｎ ｅ ｍａ ｓ ｅ ｃ ａ ｒ ｂ ａ ｐ ｅ ｎ ｅ ｍ ｇ ｅ ｎ ｅ，
其 中 Ｉ、 Ⅱ为主要 流行克 隆型 。结论 ： 本 院存在 肺 炎克 雷伯 菌耐 药株 的传 播 ， 携 带的耐 药基 因以 Ｋ Ｐ Ｃ ． ２为
主， 主要 以 Ｉ Ｃ Ｕ与 ＭＩ Ｃ Ｕ的 ２株 耐药株流行 ， 而且耐 药菌株 间存在 着不 同程度 的亲缘关 系。 关键词 肺 炎克 雷伯 菌 ： 碳 青霉烯酶 ； 耐药性 ； 同源性
微 生物分析仪进行 细菌鉴定及 药敏试验 ．采用改 良 Ｈｏ ｄ ｇ ｅ试验和 Ｅ Ｄ Ｔ Ａ协 同试验检 测耐 药表型 ， Ｐ Ｃ Ｒ检测
碳 青霉烯酶基 因， 脉冲场 凝胶 电泳（ Ｐ Ｆ Ｇ Ｅ ） 分析 菌株 同源性 。结果 ： ２ ６株 肺炎克 雷伯 茵对 头孢 菌素 类、 单环 Ｂ ． 内酰胺 类 、 氨基糖 苷 类 、 喹喏 酮类 、 呋 喃妥 因等 多种 抗 菌药物耐 药 ； 经Ｐ Ｃ Ｒ检 测后 ２ ５株携 带 Ｋ Ｐ Ｃ基 因， １ 株携 带 Ｉ ＭＰ基 因， 未检 测 出 Ｖ Ｉ Ｍ、 Ｎ Ｄ Ｍ一 １ 、 Ｏ Ｘ Ａ一 ４ ８基 因 ； Ｐ Ｆ Ｇ Ｅ电泳结果显 示 ， ２ ６株肺 炎克 雷伯 茵分为 ４ 型。
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌获得性耐药基因检测与分析
摘 要 ：目 的 了 解 耐 碳 青 霉 烯 类 肺 炎 克 雷 伯 菌 获 得 性 耐 药 基 因存 在 状 况 及 与 常 见 可 移 动 遗 传 元 件 的 关 系 ， 探 讨
其 耐 药 机 制 。方 法 收 集 ２ ０ １ １年 １月 一 ２ ０ １ ２年 ６月 医 院住 院 患 者 分 离 到 的 ２ Ｏ株 耐 碳 青 霉 烯 类 肺 炎 克 雷 伯 菌
ａ ｎ ｃ ｅ ｍｅ ｃ ｈ ａ ｎ ｉ ｓ ｍ． ＭＥ ＴＨＯＤＳ Ｔｏ ｔ ａ ｌ ｌ ｙ ２ ０ ｓ ｔ ｒ ａ ｉ ｎ ｓ ｏ ｆ ＣＲＫＰ ｆ ｒ ｏ ｍ ｉ ｎ ｐ ａ ｔ ｉ ｅ ｎ ｔ ｓ ｉ ｎ ａ ｃ ｉ ｔ ｙ － ｌ ｅ ｖ ｅ ｌ ｈ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｆ ｒ ｏ ｍ Ｊ ａ ｎ ．２ ０ １ １ ｔ Ｏ
耐 药 相 关 基 因 和可 移 动 遗传 元 件 密 切 相 关 ， 样 本 聚 类 分 析 提 示 本 组 菌 株 存 在 多个 克 隆 传播 。 关键词 ： 肺 炎 克 雷 伯 菌 ；耐碳 青 霉 烯 类 ； 获 得 性 耐 药基 因 ；町移 动 遗 传 元 件 ； 聚 类 分 析
中图分类号 ： Ｒ３ ７ ８ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章编号 ： １ ０ ０ ５ — ４ ５ ２ ９ （ ２ ０ １ ５ ） １ ９ － ４ ３ ４ ２ — ０ ４
Ａｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ａ ｃ ｑｕ ｉ ｒ ｅ ｄ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎｔ ｇ ｅ ｎ ｅ ｓ ｉ ｎ
ｃ ａ ｒ ｂ ａ ｐ ｅ ｎｅ ｍ ｒ ｅ ｓ ｉ ｓ ｔ ａ ｎｔ Ｋｌ ｅ ｂ ｓ ｉ ｅ ｌ ｌ ａ ｐｎｅ ｕ ｍｏ ｎ ｉ ａ
中华医院感染学杂志 ２ ０ １ ５年 第 ２ ５卷 第 １ ９期 Ｃ ｈ ｉ ｎ Ｊ Ｎｏ ｓ ｏ ｃ ｏ ｍｉ ｏ １ Ｖｏ １ ． ２ ５ Ｎｏ １９ ２０１ ５
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分子流行病学和耐药基因分析
耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌分子流行病学和耐药基因分析吕继芳;郑焙文;张静;喻玮;董慧慧;李兰娟;肖永红【摘要】目的了解碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌分子流行病学特征及其碳青霉烯酶基因的携带情况.方法收集我院2014年1月到2014年12月临床标本中分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌,采用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定系统进行细菌鉴定及药敏检测,改良Hodge试验检测碳青霉烯酶表型,聚合酶链反应(PCR)检测碳青霉烯酶基因、多位点序列分型(MLST)和质粒复制子分型.结果共收集138株碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌,细菌对多种临床常用抗菌药物均显著耐药.改良Hodge试验127株结果阳性(92.0％).PCR结果显示125株携带碳青霉烯酶基因,其中124株携带blakpc-2型基因(89.9％),1株携带blaimp-4型基因.MLST分型显示以ST11为主(96株,69.6％).质粒分型以IncF型多见(100株,72.5％).结论产KPC-2型碳青霉烯酶是我院肺炎克雷伯菌碳青霉烯类抗生素耐药的主要原因,ST11为主要克隆菌株.耐药菌株携带的质粒类型以IncF型为主.【期刊名称】《中国抗生素杂志》【年(卷),期】2016(041)005【总页数】6页(P356-361)【关键词】肺炎克雷伯菌;耐药性;碳青霉烯酶;分子分型【作者】吕继芳;郑焙文;张静;喻玮;董慧慧;李兰娟;肖永红【作者单位】浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,感染性疾病诊治协同创新中心,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,感染性疾病诊治协同创新中心,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,感染性疾病诊治协同创新中心,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,感染性疾病诊治协同创新中心,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,感染性疾病诊治协同创新中心,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,感染性疾病诊治协同创新中心,杭州310003;浙江大学医学院附属第一医院传染病诊治国家重点实验室,感染性疾病诊治协同创新中心,杭州310003【正文语种】中文【中图分类】R978;R378碳青霉烯类抗菌药物是临床上治疗产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌引起的感染最有效的药物。
血培养分离碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌临床分布和耐药基因分析
血培养分离碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌临床分布和耐药基因分析血培养分离碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP）是一种多重耐药菌株，其在临床上引起的感染往往难以治疗，且具有高致病性和传播性。
本文将对CRKP的临床分布和耐药基因进行分析。
CRKP是由基质胞外多糖Ⅱ编码的碳青霉烯酶（Carbapenemase）的产生导致的，这些酶能够降解碳青霉烯类抗生素，从而导致抗生素的失效。
根据碳青霉烯酶的类型以及CRKP的分布情况，可以有针对性地选择合适的抗生素进行治疗。
CRKP的临床分布呈现出地理和医疗环境的差异。
世界卫生组织数据显示，CRKP在亚洲和欧洲的发病率较高，而在北美洲和澳大利亚等地较低。
在亚洲地区，CRKP已成为医院内感染的主要病原菌，且其感染率逐年上升。
CRKP主要存在于重症监护病房、呼吸道科、泌尿外科和康复医学科等患者中，其主要感染部位包括肺部、尿道和血液等。
CRKP的耐药基因主要有多个类型的碳青霉烯酶。
其中，最常见的酶包括肠杆菌产超广谱酶（KPC）和大肠埃希氏菌产金属酶（NDM）。
这些酶的产生主要是由于质粒编码的酶基因水平变异所导致的。
除了质粒编码的酶基因外，CRKP还可以通过整合子和转座子等外源性基因转移耐药基因。
此外，CRKP还具有多重抗药机制。
除碳青霉烯酶外，CRKP还具有外膜不透性增加、外泌体释放和多种转运泵等耐药机制。
这些耐药机制使CRKP对多种抗生素产生耐药，并具有交叉耐药性，进一步增加了其治疗难度。
针对CRKP的治疗策略主要有以下几个方面。
首先，应该加强临床和实验室监测，及时掌握CRKP的分布情况和抗药特点。
其次，要加强感染控制措施，包括医院环境清洁、医护人员手卫生等，以减少CRKP的传播。
此外，希望通过研发新的抗生素和抗菌剂，控制CRKP的传播。
综上所述，CRKP是一种具有高致病性和传播性的多重耐药菌株，其临床分布和耐药基因类型具有一定的地区差异。
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耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌的IMP—4耐药基因LAMP检测目的：分析耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌的临床一般情况的特点，检测IMP-4耐药基因分布情况。
方法：搜集2014年11月-2016年4月福建省立医院微生物室从不同病区各种临床标本分离的肺炎克雷伯菌280株，其中包括耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌38株。
根据对碳青酶烯类抗生素的敏感性，选择38株耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）设为试验组，随机选择28株非耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌（KP）为对照组进行MP-4基因的LAMP技术检测，产物电泳观察结果。
结果：耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌多见于老年有抗生素使用史的患者，LAMP 法检测出CRKP组38株细菌中23例含IMP-4基因，KP组28株细菌中2例含IMP-4基因，差异有统计学意义（P＜0.05）。
结论：本研究建立的IMP-4 基因LAMP检测方法有助于初步判断肺炎克雷伯菌是否为耐药株。
[Abstract] Objective：To analyze the clinical characteristics of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，and to detect the distribution of IMP-4 resistance gene.Method：A total of 280 strains of Klebsiella pneumoniae were isolated from various clinical specimens of the Fujian Province Hospital from November 2014 to April 2016，including the carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae strains of.According to the sensitivity of carbapenem antibiotics，38 strains of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae（CRKP）for the experimental group，randomly selected 28 strains of carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae（KP）for the matched group.MP-4 gene LAMP technology products the results of electrophoresis.Result：Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae was more common in elderly patients with a history of antibiotic use，LAMP detected a CRKP group of 38 strains of bacteria in 23 cases with IMP-4 gene，KP group of 28 strains of bacteria in 2 cases with IMP-4 gene，the differences were statistically significant （P ＜0.05）.Conclusion：The IMP-4 gene LAMP detection method established in this study can help to determine whether Klebsiella pneumoniae is a resistant strain.[Key words] Klebsiella pneumoniae；Carbapenem resistant；LAMP肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia，KP）属肠杆菌科，存在于上呼吸道和肠道中，是常见的人体条件致病菌，当机体抵抗力减弱时，该菌可引起肺部、泌尿系感染，甚至败血症。
近年来，肺炎克雷伯菌引起的医院感染逐年增高，已成为医院感染的重要致病菌[1]。
碳青霉烯类抗生素自问世以来，就成为多重耐药性肺炎克雷伯菌的主要治疗药物，能有效杀灭病原菌。
但是肺炎克雷伯菌在临床抗生素广泛使用甚至滥用的选择压力下，特别是第三代头孢菌素、碳青霉烯类药物的大量应用，耐药形势日趋严重，出现了对碳青霉烯类药物耐药的肺炎克雷伯菌（Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP），并且耐藥率逐年递增，给临床治疗带来极大困难[2]。
2015年，全国耐药监测网数据显示，肺炎克雷伯菌对第三代头孢菌素的耐药率全国为36.5%，耐碳青霉烯类耐药率为7.6%[3]。
面对如此严重的细菌耐药形势发展，加强细菌耐药监测、减少抗生素滥用导致的细菌耐药变得十分重要。
本研究针对肺炎克雷伯对碳青霉烯的耐药情况和耐药基因测定进行研究，寻找可以快速判断细菌耐药性的基因指标，指导临床抗生素使用。
1 资料与方法1.1 菌株来源搜集2014年11月-2016年4月笔者所在医院微生物室从不同病区各种临床标本培养出的肺炎克雷伯菌280株，标本类型包括：血液、痰、尿液、伤口分泌物、导管末端、肺泡灌洗液、胆汁、鼻腔分泌物、穿刺液、肝脓肿引流液、腹水、胸水等。
标本2 h内送检，采用常规细菌分离培养方法，鉴定细菌，所有菌株均应用法国生物梅里埃公司的VlTEK2-compact全自动细菌分析仪进行细菌鉴定及药敏分析，测定最低抑菌浓度（MIC），质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853、肺炎克雷伯菌ATCC700603。
对符合标准的菌株采用纸片法和细菌保存液保存法各保存菌株一份于-70℃冰箱中，所有标本均采用统一形式编号，以建立肺炎克雷伯菌标本库。
1.2 判定及排除标准（1）耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌判定标准：根据美国临床实验室标准化协会（CLSI）2016年版标准（CLSIM100-S26）[4]，厄他培南≤18 mm、亚胺培南和美罗培南的抑菌圈直径≤19 mm判断为耐药或VITEK-2药敏显示这三种抗生素中介/耐药，需进行手工法确认。
美罗培南、亚胺培南或厄他培南三者中，至少对其中之一耐药的菌株为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌。
（2）排除标准：剔除重复标本。
1.3 主要仪器与试剂DNA核酸提取试剂盒（博奥生物公司）；LAMP引物合成（上海生工生物工程有限公司）；BstDNA聚合酶（北京百奥莱博科技有限公司）；VlTEK2-compact 全自动细菌分析仪（法国生物梅里埃公司）。
1.4 方法1.4.1 细菌DNA的提取（玻璃珠法）采用博奥生物公司细菌核酸提取试剂盒提取。
1.4.2 引物设计引物设计根据Genebank公布的基因序列，用PrimerExplorer4.0引物设计软件进行目标序列引物设计，获取一套特异性IMP-4基因的LAMP引物，包括1对内引物和1对外引物，引物序列见表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。
1.4.3 LAMP扩增方法与步骤配制25 μl的LAMP扩增反应体系，反应体系组成包括：反应缓冲液2.5 μl，MgSO4（100 mmol/L）1.5 μl，dNTP mixture（10 mmol/L）3.5 μl，FIP/BIP（40 μmol/L）1.0 μl，F3/B3（5μmol/L）1.0 μl，Bst DNAPolymerase（8000 U/ml）10 μl，DNA模板2.0 μl，HBN（4 mmol/L）0.75 μl，加超纯水ddH2O至25 μl，65 ℃水浴恒温反应60 min。
1.4.4 LAMP产物测定琼脂凝胶电泳法测定LAMP产物，在凝胶成像仪中观察或拍照记录结果。
1.5 统计学处理采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用字2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果2.1 一般情况2014年11月-2016年4月笔者所在医院微生物室搜集到肺炎克雷伯菌280株，标本来源主要为痰、尿、血，还包括其他如脓液、穿刺液、导管末端、肺泡灌洗液、鼻腔分泌物、腹水、胸水、胆汁等。
细菌培养及药敏鉴定结果提示有耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）38株，耐药率为15.7%。
临床资料提示CRKP 组38例，男26例，女12例，年龄28～97岁，平均（74.76±16.96）岁；65岁以上患者31例，占81.58%；标本来源主要为痰和尿液，感染多为入院48 h以上发生，占63.58%；31.58%患者在送检标本前有使用过抗生素治疗。
非耐药菌组242例，男173例，女69例，年龄0～96岁，平均（60.54±20.61）岁；65岁以上患者133例，占54.96%；标本来源主要为痰和血液，感染多为入院48 h以上发生，占70.25%；15.29%患者在送检表本前有使用过抗生素治疗，见表2 。
2.2 IMP-4耐药基因的LAMP检测结果：利用LAMP技术对38株耐碳青酶烯类肺炎克雷伯菌（CRKP组）和从非耐药菌中随机挑选的28株肺炎克雷伯菌（KP组）进行IMP-4基因检测，反应产物进行凝胶电泳判定，CRKP组38株菌株中检测出23株阳性，KP组28株菌株中检出2株阳性，比较差异有统计学意义（P＜0.05），见图1、图2、表3。
3 讨论肺炎克雷伯菌对碳青酶烯类抗生素耐药率逐年上升，临床分离到的耐药菌往往出现在危重患者身上。
在传统病原学检测报告出具之前，临床医生仅能采取经验性使用抗生素。
如何避免传统细菌培养和药敏结果报告滞后的缺点，寻找可以很好提示细菌耐药性的临床特点和基因型检测指标是当前研究的热点。
环介导恒温扩增法（Loop-mediated Isothcrmal Amplifieation，LAMP）属于恒温扩增法中的一种，2000年由日本科学家Notomi等[5]提出，可以体外扩增并检测目标基因。
反应原理是DNA遵循严格的碱基配对，所以针对目的基因的6个序列区域设计4条特异性引物（2条内引物、2条外引物）来检测目的基因的存在与否。
本研究通过设计了一套特异性IMP-4基因的LAMP引物，测定我院肺炎克雷伯菌的IMP-4基因分布情况。
包括细菌DNA提取、LAMP反应体系、LAMP反应产物凝胶电泳分析获得结果，整个过程仅需2 h左右。
相比传统的细菌培养药敏结果2～3 d出具结果，有明显的优势，并且進行LAMP反应不需要对致病菌进行增菌养殖，在反应第一步就杀灭了致病菌，提取出DNA，生物安全更有保障；相比PCR方法，LAMP不需要专门的核酸扩增仪器，反应过程恒温，减少了PCR升温、降温过程对DNA的损耗，而LAMP与PCR一样，遵循严格的碱基配对，对检验标本可以不提纯致病菌而直接处理提取DNA进行检测，其特异性和敏感度都得到多个试验的验证[6-7]，在敏感度方面甚至优于PCR。