ELLM试剂法测定自由巯基和二硫键
Ellman方法说明书Word版
Ellman试剂介绍、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、1页半胱氨酸作为巯基基团的标准品、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、2页巯基基团的摩尔吸光度、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、2页故障排除、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、3页相关的赛默飞世尔科技产品、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、3页附加信息、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、4页参考文献、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、、4页半胱氨酸作为巯基基团的标准品A.原料制备·反应缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液，PH=8.0，包含1mM EDTA·半胱氨酸一水合盐酸盐，分子量175.6·Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液溶解4mgDTNBB.步骤2、取若干试管，每个试管中包含50μL的Ellman试剂液和2.5ml的缓冲液。
3、在各试管中加入250μL各浓度的标准工作液或待测物溶液。
注：对于未知的样品需要稀释，以便使其浓度标准曲线的工作范围之内（理想的浓度为0.1-1.0）。
4、室温下反应15min。
5、测试412nm紫外吸收。
6、根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算SH含量基于摩尔吸光系数精确测量巯基的基团A.原料制备·反应缓冲液：0.1M磷酸钠缓冲液，PH=8.0，包含1mM EDTA·Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液溶解4mgDTNBB.吸光度测试1、对于每一个未知样本进行测试,准备一个包含50μL的Ellman试剂液和2.5ml的缓冲液。
2、加入250μL待测样品,空白添加250μL反应缓冲液。
3、室温下反应15min。
4、测试412nm紫外吸收。
5、根据TNB的摩尔消光系数(14,150M-1cm-1)计算巯基含量。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
E L L M A N试剂法测定自由巯基和二硫键This manuscript was revised by the office on December 22, 2012E L L M A N试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自2-吸光度0.2来计算-*1cm）1.4*101.2.不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].试验方案主要材料：1.材料PEG-G-CSF 批号：080229 浓度4.32mg/mlG-CSF 批号：080126 浓度6.9mg/ml小瓶。
NOB液：0.1%TFA/90%乙腈/H2O3.仪器质谱仪：BRUKER DALTONICS MALTI-TOF-TOF autoflexⅢ(厂内编号KC2007-011)Beckman 22R台式离心机（厂内编号AM-039）Beckman DU-800 紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）恒温循环仪：JULABO F12-ED（厂内编号KC2008-003）反相柱：Symmetry C18 5um 300à高压液相仪器：，（UV/Visible Detector）试验过程：一、缓冲液替换PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为50mM NH4HCO3，稀释中加入G-CSF+DTT相分离收样：SF+DTT相分离集到之间的交由崔文喜冻干四、ELLMAN试剂测定自由巯基由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
E L L M A N试剂法测定自由巯基和二硫键标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]E L L M A N试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-根据文献记载，TNB的吸光系数在13.6*103M-cm-~14.25*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=0.2/（14.15*103LM-cm-*1cm）=1.4*10-5mol/L(1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml.我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm的吸收也不3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12时，15min之内会完全降解[7,8]。
巯基化HA中巯基的取代度Ellman法详细步骤
首先制作半胱氨酸标准曲线，再用紫外分光光度法测定样品吸光度，计算出疏基含量，最终得出修饰率。
1、制作标准曲线：
缓冲液的配制：称取0.254gNaH2PO4与10.162gNa2HPO4于500ml容量瓶中，用
超纯水溶解，加入148.896mg的EDTA（乙二胺四乙酸），使其完全溶解，定容成500ml。
Ellman试剂的配制：称取4mgDTNB溶解在1ml缓冲液中。
取7只试管，分别在每只试管内加入50μL Ellman试剂与2.5ml磷酸钠缓冲溶液，混匀后，再在各试管内加入50μL标准溶液，混合均匀，在室温放置15min，以溶液G为空白，于波长412nm处测定半胱氨酸标准液的吸光度值(A)，如表9所示:
制作标准曲线如图10所示。
得标准曲线方程为y=0.1692x-0.0001，R2=09994，满足要求。
2、测量半胱氨酸透明质酸结合物的修饰率：
配制样品溶液：称取10.5mg半胱氨酸透明质酸结合物（含0.0274mmol伯醇羟基）用缓冲液溶解并定容至5ml；
配制空白对照溶液：称取10.5mg透明质酸（含0.0274mmol伯醇羟基）用缓冲液溶解并定容至5ml；
取2只试管，分别在每支试管内加入50μL Ellman试剂与2.5ml磷酸钠缓冲溶液，混匀后，再在各试管内加入50μL待测样品，混合均匀，在室温放置15min，以透明质酸溶液做空白，于波长412nm处测定待测样品的吸光度值(A)，如表10所示：
利用标准曲线和测得的样品溶液吸光度，计算样品中巯基的含量。
带入标准曲线计算：0.0385=0.1692x-0.0001，得出修饰率为3.5%（巯基数相对于透明质酸的双糖单位数）。
ellman's试剂比色法测定食品中蛋白质的巯基和二硫键
ellman's试剂比色法测定食品中蛋白质的巯基和二硫键
Ellman's试剂比色法是一种常用于测定食品中蛋白质的巯基和二硫键的方法。
该方法基于Ellman试剂对巯基和二硫键的选择性反应，将其转化为可检测的黄色产物。
实验中，首先将样品加入含有Ellman试剂的反应液中，在一定的反应时间后，使用紫外可见分光光度计测量反应液的吸光度，从而确定样品中的巯基和二硫键含量。
Ellman's试剂比色法具有灵敏度高、操作简便等优点，是一种常用的蛋白质含硫官能团测定方法。
- 1 -。
ELLMAN试剂法测定自由巯基和二硫键
ELLMAN 试剂测定自由巯基试验基于的原理：5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid (DTNB) 5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm 没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB ）[1]。
TNB 2-在412nm 有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
SS NO 2NO 2-OOC-OOC+SH S -SNO 2NO 2-OOC-OOC+SDTNB TNB 2- 根据文献记载，TNB 的吸光系数在13.6*103M -cm -~14.25*103M -cm -之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在0.2-0.7之间。
A=εbc ，其中A 为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol ·cm ）]。
以吸光度下限0.2来计算（吸光系数取14.15*103M -cm -），需要TNB 的浓度为c=0.2/（14.15*103LM -cm -*1cm ）=1.4*10-5mol/L (1.4*10-8mol/ml)，需要蛋白浓度为1.4*10-5mol/L*18790g/mol=0.2631g/L=0.2631mg/ml. 我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN 试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：1. EDTA 的适量加入有助于TNB 显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2. 在不同缓冲液中，TNB 的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm 的吸收也不3. 同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB 的分光光度法分析对SDS 很敏感[6]。
4. DTNB 随着pH 的升高，降解速度加快。
在pH7.0，其降解速度为0.02%/h ，在5.pH值8.0，其降解速度为0.2%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH 12时，15min之内会完全降解[7,8]。
蛋白二硫键鉴定和定量分析
蛋白二硫键鉴定和定量分析BTP-蛋白二硫键鉴定和定量分析蛋白质鉴定和结构功能分析是现代生物学研究中的必要环节，而质谱已成为这一环节的支撑技术。
很多定位到细胞表面或分泌到胞外的蛋白质都有二硫键，例如免疫系统(immune system)产生的抗体、各类生长因子（growth factors）、内分泌系统产生的肽激素如胰岛素(insulin)，以及这些生长因子或激素的受体。
因为二硫键的正确形成对于这些蛋白质的稳定性和活性至关重要，而且很多蛋白质品以及生物制剂(Biopharmaceutical)的靶蛋白都有这些属性，所以二硫键配对状态的精确解析对于它们的结构功能研究和相关品的研发、质控有重要价值。
百泰派克公司采用Thermo Fisher的Q ExactiveHF质谱平台，Orbitrap Fusion质谱平台，Orbitrap Fusion Lumos质谱平台结合Nano-LC，推出蛋白二硫键分析解决方案，您只需要将您的实验目的告诉我们并将您的样品寄给我们，我们会负责项目后续所有事宜，提供蛋白二硫键位点的相关信息。
百泰派克公司基于发表在Nature Methods上的文章：mapping native disul de bonds at a proteome scale，结合自己的实验经验建立了针对于单个蛋白和组学水平上的蛋白二硫键分析解决方案，包括克服蛋白质二硫键体外交换、保持其天然结构的样品制备方法，二硫键交联肽段的有效质谱分析方法，以及配套的二硫键鉴定软件pLink-SS。
二硫键鉴定研究路线BTP-蛋白二硫键鉴定和定量分析研究案例该项目是某高校老师二硫键鉴定，得到的部分结果如下图所示：二硫键鉴定研究案例BTP-蛋白二硫键鉴定和定量分析样品要求1. 如果您提供的是组织样品，请您干冰将组织样品寄给我们；植物组织样本最少200mg，血液样品至少1ml(血浆注意用EDTA防凝)，血清0.2-0.5ml，尿液2ml，动物组织样品至少1g，细胞样品为1X107个细胞，酵母、微生物等干重200mg。
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E L L M试剂法测定自由巯基
和二硫键
Prepared on 22 November 2020
ELLMAN试剂测定自由巯基试验基于的原理：
5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoicacid(DTNB)5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)
5,5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)在412nm没有吸收，与巯基反应后，生成2-硝基-5-巯基苯甲酸（TNB）[1]。
TNB2-在412nm有很强的吸收，可以用于对肽段的自由巯基进行定量分析[2]。
DTNBTNB2-
根据文献记载，TNB的吸光系数在*103M-cm-~*103M-cm-之间[3,4]。
吸光度测量的最灵敏范围在之间。
A=εbc，其中A为吸光度，ε是摩尔吸收光系数或消光系数，ε单位为升/（摩尔·厘米）[L/(mol·cm）]。
以吸光度下限来计算（吸光系数取*103M-cm-），需要TNB的浓度为c=（*103LM-cm-*1cm）=*10-5mol/L*10-
8mol/ml)，需要蛋白浓度为*10-5mol/L*18790g/mol=L=ml.
我们的条件可以达到这个检测限度。
ELLMAN试剂法测定自由巯基主要的影响因素有：
1.EDTA的适量加入有助于TNB显色的稳定和成梯度线性关系[5]。
2.在不同缓冲液中，TNB的最大吸收波长略微不同，所以它们在412nm
的吸收也不
3.同，要根据选择的缓冲液来确定[5]。
另外，TNB的分光光度法分析对
SDS很敏感[6]。
4.DTNB随着pH的升高，降解速度加快。
在，其降解速度为%/h，在
5.pH值，其降解速度为%/h,随着pH值得升高，降解速度加快，在pH12
时，15min之内会完全降解[7,8]。
6.摩尔吸收光系数在不同的温度下不同，随温度的升高而下降[4].
试验方案
主要材料：
1.材料
PEG-G-CSF批号：080229浓度ml
G-CSF批号：080126浓度ml
10k超滤膜PALL
2.试剂
SequencingGradeModifiedTrypsin,Promega，lot#237826。
20ug/小瓶。
加
入20ul50mMNH4HCO3，溶解，配成1ug/ul的酶液。
1MDTT刘春凤提供
TFA（三氟乙酸）：TEDIALot#705114
乙腈：FisherScientificLot#055848
StarterkitforMALDI-TOFMS：BRUKERDALTONICS，LotNO2007-
208241-001(includingα-Cyano-4-
hydroxycinnamicacid(HCCA),peptidecalibrationstandard,proteincalibratio
nstandardI,proteincalibrationstandardⅡ)
PEG肽段反相分离流动相
A液：%TFA/H2O
B液：%TFA/90%乙腈/H2O
3.仪器
质谱仪：BRUKERDALTONICSMALTI-TOF-TOFautoflexⅢ(厂内编号
KC2007-011)
Beckman22R台式离心机（厂内编号AM-039）
BeckmanDU-800紫外分光光度计（厂内编号KC2007-005）
恒温循环仪：JULABOF12-ED（厂内编号KC2008-003）
反相柱：SymmetryC185um300à*150mm，LotNO
高压液相仪器：，（UV/VisibleDetector）
试验过程：
一、缓冲液替换
PEG-G-CSF和G-CSF进行缓冲液替换，超滤替换缓冲液为
50mMNH4HCO3，。
使用50mMNH4HCO3作为空白对照，样品用
50mMNH4HCO3稀释一倍后在DU-800紫外分光光度计上测浓度。
PEG-G-CSF的浓度约ml，G-CSF的浓度约ml。
二、酶切处理
1）取37ulG-CSF,共400ug，加入稀释为终浓度为2mg/ml。
取,共400ug，加入152ul50mMNH4HCO3稀释为终浓度为2mg/ml。
2）按质量比1：40往PEG-G-CSF中加入Trypsin10ul，往G-CSF中加入Trypsin10ul，同时各加入1ul1MDTT使终浓度为5mM。
另做一空白对
照，往300ul50mMNH4HCO3中加入Trypsin15ul。
37℃反应，开始时间为。
三、肽段反相分离
G-CSFTrypsin+DTT反相分离
收样：
PEG-G-CSFTrypsin+DTT反相分离
四、ELLMAN试剂测定自由巯基
由于收集到的PEG肽段已经是自由巯基，所以可以跳过还原二硫键这一步。
根据我们所查找到得文献，采用的参数如下：
反应缓冲液：磷酸钠+，
温度：25℃
在这些参数下，摩尔吸收光系数为±*103LM-cm-[9].
1)标准曲线
用反应缓冲液配制10umDTT，20umDTT，40umDTT，80umDTT，
160umDTT，320umDTT。
用缓冲液配制10mM的ELLMAN试剂。
准
备两个比色皿。
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收
值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品
管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品
管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。
④A412nm=A final-（）(A DTNB-A buffer),制作标准曲线。
2）样品巯基测定
①加入100ul反应缓冲液到样品管和对照管中，在412nm测定吸收
值，吸收值调节到0.
②加入100ul反应缓冲液到对照管中，加入100ulELLMAN试剂到样品
管中，在412nm测定吸收值A DTNB。
③加入100ul蛋白质溶液到对照管中，加入100ul蛋白质溶液到样品
管中，混匀，3~5min后测定吸收值，直到值不再增加，记为A final。
④A412nm=A final-（）(A DTNB-A buffer)，根据标准曲线测定巯基。
参考文献：
1)产品说明书。
7)Riddles,—areexamination,。