构建shRNA干扰稳定细胞系ppt课件
《RNA建库流程》课件
RNA样品的浓度与质量检测
浓度检测
通过测量RNA样品的吸光度值，可以计算出其浓度。常用的测量仪器包括紫外分 光光度计和荧光计。
质量检测
除了浓度检测外，还需要对RNA样品的质量进行检测，以确保其完整性。常见的 检测方法包括琼脂糖凝胶电泳、Agilent 2100 Bioanalyzer等。
03
RNA逆转录
RNA建库的基本原理
原理
基于逆转录和PC除基因组D
步骤一
步骤二
去除基因组DNA
步骤三
逆转录合成cDNA
02
RNA建库流程的优缺点分析
样品制备难度大
RNA建库流程中样品制备阶段较为复杂，需要严格控制实验条件 ，对于实验操作的要求较高。
实验成本高
该流程需要使用大量的试剂和仪器，导致实验成本较高，限制了其 在一些资源有限的研究领域中的应用。
对原始样品的依赖性强
RNA建库流程的结果受到原始样品质量的影响较大，如果原始样 品质量不佳，将直接影响后续的测序结果。
RNA样品的纯化与分离
纯化
RNA样品中常常含有DNA、蛋白质和酚等杂质，这些杂质会 影响后续的实验结果。因此，在建库前需要进行纯化，去除 这些杂质。常用的纯化方法包括使用离心柱、磁珠或试剂盒 进行纯化。
分离
对于不同大小和性质的RNA分子，需要进行分离，以便后续 的建库和测序。常见的分离方法包括凝胶电泳、聚丙烯酰胺 凝胶电泳、色谱法和微流控技术等。
反应时间
根据酶活性和产物质量确 定最佳的反转录时间。
缓冲液和离子浓度
优化反应缓冲液和离子浓 度，以提高反应效率和产 物质量。
逆转录产物的质量检测
产物长度检测
通过凝胶电泳检测反转录产物的 长度，确保产物片段的完整性。
shrna构建方法
shrna构建方法
shRNA（short hairpin RNA）是一种用于基因沉默的工具，可以通过干扰RNA（RNAi）途径来抑制特定基因的表达。
下面我将从多个角度来介绍shRNA的构建方法。
1. 设计shRNA序列，首先需要设计一个能够特异性靶向要沉默的基因的shRNA序列。
这个序列通常包括一个短的“loop”区域和两个互补的“stem”区域。
设计shRNA序列时需要考虑避免靶向到其他基因，同时确保足够的特异性。
2. 合成DNA片段，一旦设计好shRNA序列，接下来需要合成包含这个序列的DNA片段。
这个DNA片段通常会包括适当的启动子和终止子序列，以便在细胞中进行转录和转录后修饰。
3. 构建shRNA表达载体，合成的DNA片段通常会被克隆到一个适当的表达载体中，这个载体通常包括能够在目标细胞中高效表达shRNA的元件，比如启动子和启动子。
这个载体也可能包括标记基因，比如荧光蛋白，以便在细胞中观察shRNA的表达情况。
4. 验证shRNA的效果，一旦构建好shRNA表达载体，就需要在
细胞系或动物模型中验证shRNA的效果。
这通常包括检测目标基因的表达水平，以确保shRNA能够有效地抑制目标基因的表达。
总的来说，构建shRNA的过程包括设计shRNA序列、合成DNA 片段、构建表达载体和验证效果。
这些步骤需要仔细设计和严格控制，以确保shRNA能够准确、高效地抑制目标基因的表达。
FPR基因shRNA干扰载体的合成与构建
FPR基因shRNA干扰载体的合成与构建目的设计并构建靶向甲酰肽受体FPR基因的shRNA 慢病毒表达载体并鉴定。
方法根据GenBank数据库提供的FPR基因序列，设计合成针对FPR的shRNA序列，构建PDS019_pL/shRNA/GFP/F-FPR慢病毒载体，并通过测序鉴定。
结果成功构建的重组质粒测序结果与Genebank 中的FPR cDNA 序列相符。
结论构建FPR基因shRNA干扰载体，为该基因的相关实验研究提供载体。
Abstract：Objective To construct and identify FPR shRNA lentiviral vector. Methods Genome sequences of FPR gene was retrieved from Genebank. The shRNA sequences for FPR were synthesized and cloned into PDS019_pL/shRNA/GFP/F to generate shRNA lentiviral vector. The recombinant vectors was identified by sequencing.Results The sequence identified by sequencing were the same as the targeting one. Conclusion The constructed FPR shRNA lentiviral vectors were constructed，which may be used for the further research the role of FPR in the malignant behavior of the cancer.Key words：FPR；Vector construction甲酰肽受体（Formyl peptide receptor，FPR）在肿瘤的发生、演进和转移过程中可能起重要作用。
shRNA干扰服务
shRNA⼲扰服务shRNA⼲扰服务服务简介：shRNA-Target Gene表达载体构建好后，即可进⾏RNA⼲扰实验。shRNA RNAi试验设计理由: shRNA表达载体⽬的细胞转染效率的检测。如果⽬的细胞的质粒转染效率较低(低于70%) ，则应采⽤慢病毒或者腺病毒包装，病毒具有⾼感染率、⾼表达特性，在⾼效的侵染效率的情况下，才能进⾏RNA⼲扰实验。
对照设置与分组shRNA NC(阴性对照序列，排除⾮特异性效应)shRNA GAPDH(阳性对照序列，排除系统性的误差)shRNA Target1-4(靶基因序列)mock(转染试剂对照组，排除转染试剂的毒性效应) RNA⼲扰效率的检测(体外)。
⼀般应该从mRNA⽔平、蛋⽩质⽔平、细胞表型⽔平三个层次来检测⼲扰效率。mRNA ⽔平：RT-PCR、Real-Time PCR；蛋⽩质⽔平Westem-Blot、ELISA 、免疫组化；细胞表型⽔平MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞⼩室实验等。 RNA⼲扰效率在动物模型上的进⼀步验证(体内)。
动物模型实验同以采取"体内法"和"体外法"。体内法，即先做裸⿏成瘤模型，再将质粒或病毒导⼊裸⿏，检测RNA⼲扰效果。此法操作复杂，对质粒和病毒产品的质和量要求都较⾼，但是⽐较贴近实际，说服⼒较显著。
体外法，即先将质粒或病毒导⼊肿瘤细胞，再将肿瘤细胞导⼊动物体内，然后检测阳RNA⼲扰效果。此法操作较简单，对质粒和病毒产品的质量要求较低。
TIPS:RNA⼲扰实验中的对照按照nature的标准，⼀个严格的RNAi介导knockdown实验要有6个对照: 转染试剂对照（监控转染及培养条件对结果的影响）； nonsense siRNA对照（监控外源核酸本⾝对结果的影响）； positive siRNA对照（监控假阴性）； 技术重复对照（也叫off-target 对照，也就是利⽤⾄少2个靶点的siRNA同时实验，2个siRNA互为off-target control，当两者的表型相同时，才有可能是特异性的knockdown效应）；
RNA干扰完整
RNA的干扰
RNA干扰的概念
RNA
干扰
RNA干扰的作用机制 RNA干扰的应用 RNA干扰存在的问题
什么是RNA干扰？
• 英文：RNA interference，缩写RNAi 。 • 概念：是指在进化过程中高度保守的、由 双链RNA（double-stranded RNA， dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性 降解的现象，是正常生物体内抑制特定基 因表达的一种现象
• 。利用RNAi技术来研究药物作用的特异性和机制对于加快 药物开发的研制速度大有益处，因为基因组研究成果和高 通量的筛选技术，为更好更快发现药靶和候选药物提供了
重要基础。在药物开发过程中，用RNAi技术可以对靶基因
的功能进行分析，有助于搞ห้องสมุดไป่ตู้药物的作用机制以及与基因 编码产物，及与相应化合物的相互作用，从而更正确地发 现药靶，开发更有效的候选药物
第二步（效应阶段）是 siRNA 在 ATP参与下被 解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成 诱导的沉默复合体。在ATP 酶的作用下，活化 的 RISC 以单链 siRNA 为向导识别同源性的单 链靶mRNA ，并在距离RISC 的3` 端11个碱基 位置切割靶mRNA ，导致靶基因的沉默。
RNAi技术及其应用 PPT课件
包含两种主要的组成成分，即决定干扰特异性的 小RNA和发挥抑制作用的Argonaute蛋白。
根据RISC复合物中Argonaute蛋白的天然活性以及 小RNA与
其靶标mRNA之间互补程度的不同，RISC复合物 与靶标mRNA结合后会发挥几种不同的作用，它 可以控制mRNA的稳定性和蛋白质合成、维持基
值得一提的是，这是第一
项使用受体介导递送方式的siRNA临床试验，该 产品被连接有转铁蛋白的环糊精颗粒包裹。这样， 药物就只会被细胞表面表达有转铁蛋白受体的细
胞摄取，而转铁蛋白受体在肿瘤
细胞表面表达量就非常高。
Acuity制药公司与Merck公司旗下的 SirnaTherapeutics公司合作进行的临床药物试验成
内源性siRNA（esiRNA）。 不过，这些小RNA子都有一个共同的特征，那就 是它们都能与Argonaute蛋白相结合，从而发挥它
们的靶向作用。
简述
小RNA分子的形成过程以及RNA沉默的机制 a、能够形成dsRNA结构或者发夹结构的天然转录 产物是形成小RNA分子的前体物质。这些双链结
构的RNA分子经由疗技术，却已经以一种 前所未有的速度迈进了临床试验阶段。下面，我
们将介绍几种已经进入临床试验阶段的人体疾病 RNAi疗法。 第一个被
siRNA治疗指南批准获得临床研究新药 （investigationalnewdrug，IND）资格，并且进入
了临床试验的就是Bevasiranib，它是美国Ac
为两大类：
一是小干扰RNA（siRNA），它是细胞为了应对病
毒感染或者其它人工导入分子而剪切外源性长 dsRNA前体而生成；二是miRNA，它由细胞运用
其自身基因组编码的茎
环结构加工而来。借助高通量测序技术，人们发 现了好几种内源性小RNA，包括最近发现的PIWI 相互作用RNA（PIWI-interactingRNA,piRNA）和
shRNA干扰腺病毒载体构建技术原理
shRNA干扰腺病毒载体构建技术原理
shRNA干扰腺病毒载体由腺病毒基因组序列和细菌质粒序列构成。
细菌质粒序列含有一个Ampicillin抗性基因和一个高拷贝复制子pUCori。
腺病毒基因组序列是从元件5'ITR开始，到元件3'ITR结束。
腺病毒基因组序列可容纳两个外源基因表达盒子：一个是shRNA 表达盒子，另外一个是marker基因表达盒子。
Marker基因表达盒子已经克隆在载体上，无需重新构建。
我们提供了EGFP和mCherry两种荧光marker您选择。
shRNA表达盒子则包括三部分序列：U6启动子、shRNA和终止子。
U6启动子和Marker基因表达盒子已经克隆在pDown入门克隆上，每次构建载体，只需通过annealing-ligation技术将感兴趣的shRNA和终止子克隆到pDown载体上，再通过site-specific recomination cloning技术将pDown入门克隆克隆到腺病毒载体上即可。
shrna原理
shrna原理
shrna（short hairpin RNA）是一种通过介导RNA干扰（RNA interference）途径进行基因沉默的工具。
它是由一个短小的RNA分子构成，具有一段特定的互补序列，能与靶基因的mRNA发生特异性的配对。
通过配对，shrna能够直接与mRNA形成双链结构，并激活RNA酶Dicer以及一系列核酸
酶的协同作用，将mRNA在细胞内切割成较短的片段。
这些
切割后的mRNA片段无法被翻译成蛋白质，从而起到沉默目
标基因的作用。
shrna的合成通常是通过质粒转染或病毒载体转染的方式进行。
在质粒转染中，shrna序列首先被构建在可表达的质粒中，并
经过体外扩增纯化后，转染到目标细胞中。
而在病毒载体转染中，shrna序列则被整合到携带有病毒基因组的病毒载体中，
通过病毒感染的方式传递到目标细胞内。
一旦shrna进入细胞，它将与细胞内的RNA干扰机器结合，
并导致产生RNA-induced silencing complex（RISC）。
该复合
物通过识别与shrna序列互补的mRNA，并通过核酸酶和蛋白
质的协同作用，将mRNA切割为短片段。
这些短片段被称为
小干扰RNA（siRNA），它们能够选择性地沉默与shrna互补
的mRNA分子。
一旦目标mRNA被沉默，相应的蛋白质合成
就会受到抑制，从而影响目标基因的表达。
总之，shrna通过介导RNA干扰的机制，能够选择性地沉默目标基因的表达。
这一技术在基因功能研究、基因治疗和药物开发等领域具有广泛的应用前景。
稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH—7细胞株的建立
稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH—7细胞株的建立目的为研究细胞周期相关因子PAK2在原发性肝癌中的作用，拟用shRNA干扰技术建立稳定抑制PAK2蛋白表达的HUH-7肝癌细胞系。
方法用基因转染技术将人PAK2的3个shRNA片段分别克隆至慢病毒载体pHBLV-U6-ZsGreen-Puro，包装成病毒后利用脂质体将载体病毒转染至HUH-7细胞，利用G418筛选稳定表达shRNA的细胞。
利用Real-time PCR和Western blotting方法分别鉴定转染细胞内PAK2的RNA及蛋白表达水平。
结果sh1-PAK2 HUH-7、sh2-PAK2 HUH-7和sh3-PAK2病毒载体均可转染至HUH-7细胞系，且转染效率较高（>80%）。
Real time-PCR结果显示，与对照组sh-cont 比较，转染sh1-PAK2、sh2-PAK2和sh3-PAK可明显抑制HUH-7细胞内PAK2-mRNA的表达，差异均有统计学意义（均P 80%）. The results of Real time-PCR showed that，compared with control group sh-cont，transfection sh1-PAK2，sh2-PAK2 and sh3-PAK could inhibit the expression of PAK2-mRNA in HUH-7 cells，the differences were all statistically significant （all P 80%），其荧光分布图见图2。
2.2 Real-time PCR检测干扰后HUH-7内PAK mRNA表达Real time-PCR结果显示，与对照组sh-cont比较，转染sh1-PAK2、sh2-PAK2和sh3-PAK可明显抑制HUH-7细胞内PAK2-mRNA的表达，差异均有统计学意义（均P < 0.05），其中sh2-PAK2和sh3-PAK2的干扰效果尤为明显，下调效率分别达68%和89%。
RNA干涉课件
miRISCs/miRNP
不同点/分歧点 各自的生物学功 能不同
siRNA ⅰ抵抗病毒的防御机制(Pfeffer et al., 2004; Ding et al., 2004)；ⅱ沉默那些过 分表达的mRNA；ⅲ保护基因组免受转座子的 破坏(Mello and Conte, Jr., 2004; Hannon, 2002; Tabara et al., 1999)-9； 高度特异性 单链的siRNA结合到RISC复合物中，引导复 合物与mRNA完全互补，通过其自身的解旋酶 活性，解开siRNAs，通过反义siRNA链识别 目的mRNA片段，通过内切酶活性切割目的片 段，接着再通过细胞外切酶进一步降解目的 片段。同时，siRNA也可以阻遏3′UTR具有 短片断互补的mRNA的翻译（off target）。 siRNA对称地来源于双链RNA的前体的两侧臂
在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形 成所谓RNA诱导沉默复合物。激活的RISC通过碱基配对定
位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3'端12个碱基的
位置切割mRNA。
起始阶段
效应阶段
siRNA
RNAi相关术语
RNAi：（RNA interference）RNA干扰
内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的能诱导细胞内与其序列同源的特异
基因表达沉默或抑制的效应，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为 RNA干扰，它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。 siRNA ：(small interfering RNAs)小干扰RNA 由长dsRNA裂解而成的一种19-25nt的短片断双链RNA分子，能够以同源互 补序列的RNA为靶目标降解特定的mRNA， RNAi的关键效应分子 shRNAs:(small hairpin RNA )小发夹RNA 是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，shRNA需通过载体导入细 胞后，然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用。