白血病免疫分型测定
急性白血病免疫学分型
（一）急性淋巴细胞白血病按免疫标志分为非T细胞型和T细胞型。
前者又可分为无标志性急淋（Null-ALL）普通型急淋（Common-ALL）、前B细胞型急淋（Pre-B-ALL）和B细胞型急淋（B－ALL）4个亚型；T细胞型又分为不成熟胸腺细胞型（immature T-ALL），普通的胸腺细胞型（eommon T-ALL）和成熟胸腺细胞型（mature T-ALL）。
见表5－3－1 和表5－3－2. 表5－3－1 急性T淋巴细胞白血病（T－ALL）细胞表型组别免疫亚型表型特征CD7CD5CD2CD1CyCD3SmCD3CD4CD8Ⅰ幼稚胸腺细胞型immature T-ALL+-/+-/+--/+---Ⅱ普通胸腺细胞型common T-ALL+++++-/+++Ⅲ成熟胸腺细胞型 mature T-ALL+++-+/-++/--/+表5－3－2 急性非T淋巴细胞白血病（non-T-ALL）细胞表型组别免疫亚型表型特征HLA-DRCD19CD10CD22CD20CyIgMSmIgⅠ无标志型急淋Null-ALL+-/+-----Ⅱ普通型急淋common-ALL+++-/+-/+--Ⅲ前B细胞型急淋pre-B-ALL++++++-ⅣB细胞型急淋B－ALL＋＋+/-++-+ （二）急性非淋巴细胞白血病应用免疫学标志进行分型尚正在探索中，髓细胞系的免疫膜标志；粒细胞系为过氧化物酶＋、CD34＋、CD13＋；单核细胞系为α－萘酚醋酸酯酶＋，可被氟化钠抑制，CD34＋、CD13＋、CD14＋；红细胞系为血型糖蛋白（Gl ycophorin）及红细胞膜收缩蛋白（Spectrin）＋；巨核细胞系为血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa+、Ⅰb/Ⅲa＋。
急非淋膜标志与FAB分型的关系见表5－3－3. 表5－3－3 急性非淋巴细胞白血病FAB 分型与膜标志抗体M1M2M3M4M5M6M7 HLA－DR++-+++/-+/-CD34++/--+/-+/--+/-CD33+++ +++/-+/-CD13+/-++ + +- CD14-+/--++- CD15-++/-+++/- 血型糖蛋白-----+-Ⅱb/Ⅲa/Ⅰb------+。
白血病免疫分型测定
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
操作-样本制备：
细胞膜表面抗原
1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。
2．首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。
3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)
4．各管中加入标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。
6．各管中加入透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。
8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。
9．300g离心5分钟后，弃去上清液。
10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。11 Nhomakorabea上机测样
报告结果
报告百分数
操作性能
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态，腰穿采骨髓。
采集部位腰穿采骨髓
抗凝剂肝素抗凝
要求1．样本量至少3ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻的标本或已固定的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
4：鞘液液体20L室温
5：清洗液液体5L室温
白血病免疫分型初筛方案
白血病免疫分型初筛方案白血病免疫分型初筛方案白血病是一种由于造血干细胞异常增殖引起的恶性血液病，其临床表现及预后差异较大。
对于白血病患者的治疗和预后判断，准确的分型至关重要。
近年来，随着免疫学研究的进展，白血病的免疫分型成为了一个重要且具有指导意义的方面。
本文将介绍白血病免疫分型的初筛方案，以及其对临床的意义和应用。
一、什么是白血病免疫分型？白血病免疫分型是通过检测白血病患者的免疫表型，即细胞上表达的抗原和细胞表面标记物，来确定白血病的类型和亚型。
目前，常见的白血病免疫分型方法主要包括流式细胞术、免疫组化、免疫电镜等。
二、为什么需要白血病免疫分型？白血病患者的治疗和预后与其分型紧密相关。
不同类型的白血病具有不同的临床表现、生物学特点和预后，准确的分型对于指导个体化治疗非常重要。
免疫分型不仅可以帮助医生确定病情严重程度、制定个体化治疗方案，还可以对患者的预后做出评估。
对于一些疑难病例，免疫分型还有助于确定病理诊断和鉴别诊断，减少误诊和漏诊的发生。
三、白血病免疫分型的初筛方案目前，国际上广泛应用的白血病免疫分型初筛方案主要是基于流式细胞术。
这一方法具有快速、准确、多参数检测的特点，使得它成为了白血病免疫分型的首选工具。
白血病免疫分型的初筛方案通常包括以下几个方面的内容：1. 纵向免疫分型纵向免疫分型主要是通过检测白血病细胞表面的免疫表型，确定白血病的类型和亚型。
对于怀疑白血病的患者，医生通常会进行一系列免疫标记物的检测，如CD45、CD34、CD13、CD33、CD14、CD15等。
这些标记物可以帮助医生确定白血病患者的分型，指导后续的治疗和预后评估。
2. 横向免疫分型横向免疫分型则是通过比较不同类型的白血病细胞表面的免疫表型，辅助鉴别白血病的类型和亚型。
在横向免疫分型中，医生通常会检测同一类别不同亚型的白血病患者的共同抗原和独特抗原，以确定其具体的亚型。
3. 免疫细胞化学分析免疫细胞化学分析是一种通过检测白血病细胞内特定抗原的染色反应，来确定白血病的类型和亚型的方法。
白血病免疫分型
正常人血液白细胞CD45-SSC设门散点图
R1：淋巴细胞 R2：单核细胞 R3：中性粒细胞 R4：嗜酸性粒细胞 R5：原始细胞
正常人骨髓有核细胞CD45-SSC设门散点图
R1：淋巴细胞 R2：粒系细胞 R3：单核细胞 R4：原始细胞 R5：幼红细胞
白血病细胞的特性
白血病细胞的异常表现在： 抗原系列异常和时间异常
CD15
CD1a
CD64
2008年WHO细胞系别确定标准
髓系：MPO（流式细胞术、免疫组化或者细胞化 学） 或单核系分化（非特异性酯酶弥漫性阳性， 或者CD11c、CD14、CD36、CD64、溶酶体， 两个及以上阳性） T系：胞浆CD3（流式使用抗CD3ε链的抗体；免 疫组化使用的多克隆抗体会检测到非T细胞特异性 的CD3ζ链） 或胞膜CD3（MPAL中比较罕见） B系：CD19强表达加下述标志中至少一个强表达： CD79a、胞浆CD22、CD10 或CD19弱表达加下述标志中至少两个强表达： CD79a、胞浆CD22、CD10
髓片
POX染色
AML-M0
AML-M1
AML-M2
AML-M3
AML-M3v
AML-M4EO
AML-M4b
AML-M5b
AML-M6
AML-M7
AML免疫分型总结
192例AML病例中免疫分型结果示髓系抗原CD13、CD33、 MPO最常见，其次CD117也是髓系比较敏感的指标，在 原始细胞百分比高的AML亚型中有较高的阳性率。
白血病免疫分型---CD45-SSC设门
CD45是白细胞的共同抗原成分,所有人类白细胞均表达CD45，包括 淋巴细胞、单核细胞、多形核细胞、嗜酸、嗜碱性细胞、胸腺细胞、 脾细胞、扁桃腺细胞以及骨髓前体细胞。 造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高低紧密相关，即分化 程 度 高 的 细 胞 CD45 表 达 量 高 ， 分 化 程 度 低 的 细 胞 CD45 表 达 量 低 （淋 巴细胞>单核细胞>成熟粒细胞>原幼细胞，在红细胞中不表 达。 SSC是侧向角参数，反应细胞的颗粒度（成熟粒细胞>单核细胞>原 幼 细 胞 > 淋 巴 细 胞 ） 。 目 前 ， 国 际 上 采 用 CD45—SSC 设 门 （Gating），可将白血病细胞与正常细胞分开，增加白血病免疫分 型的准确性。
急性白血病免疫分型
T-ALL旳免疫表型特点：
T-ALL分类
免疫表记
TdT+ 、CyCD3+ 、CD7+
Pro/Pre-T-ALL
CD2-、sCD3- 、CD1a-
T-ALL
CD2+、 sCD3+ 、 CD5+/- 、CD8+/- 、CD4+/- 、 CD1a+/-
-
+
+
-
T-ALL
+
-
-
+
-
-
+
AML
-
+/-
+
-
-
-/+
-/+
R1 门为成熟淋巴细胞 R2 门为正常单核细胞位置 R3 门正常粒细胞位置 R4 门为幼稚淋巴细胞出现位置 R5 门为有核红细胞或细胞碎片位置 R6 门为幼稚髓细胞出现位置 白血病细胞一般会在R4 R6 两门位置处出现
正常骨髓经CD45/SSC射门旳散点图
CD45/SSC 图中可见 CD45 强阳性SSC 低信号旳细胞群为淋巴细胞褐色细胞群体 中档强度旳CD45 体现SSC 信号最强旳细胞群体为粒细胞蓝色及红色细胞群体 CD45 体现与SSC 信号介于淋巴细胞与粒细胞之间旳是单核细胞群体绿色细胞群体 CD45 阴性SSC 信号最低旳有核红细胞和细胞碎片
ANLL旳免疫分型特点
FAB-M1/M2旳免疫表型特点：CDl3+、CD15+、CD33+、 HLA-DR+、CD34+，其中CD34在M1中旳体现强于M2，而CD15在M2旳体现较强。
ANLL旳免疫分型特点
我国急性白血病免疫分型的四色方案
我国急性⽩⾎病免疫分型的四⾊⽅案中国流式细胞术急性⽩⾎病免疫分型四⾊⽅案由于多参数流式细胞术(MFC)免疫分型具有客观、敏感、准确等特点，免疫表型已成为诊断急性⽩⾎病的重要依据之⼀。
因准确的诊断需要选择⼀定数量的抗体，涉及多个造⾎系列的抗原。
但⽬前国内甚⾄国际上没有规范化的⽅案可以借鉴。
⽽国内不同的医疗单位所⽤的抗体数量和种类均有较⼤的异质性，有些单位由于应⽤的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的判断。
鉴于国内的实际情况，中国免疫学会⾎液免疫分会临床流式细胞术学组经过多次的讨论，提出以CD45/SSC为基础的中国流式细胞术急性⽩⾎病免疫分型四⾊⽅案，供参考。
本⽅案不包括标本的采集、保存、制备、试剂和仪器的调整及急性⽩⾎病的诊断标准，这些对免疫分型同样重要，可参考相应的指南。
1．适应范围：1.1急性淋巴细胞⽩⾎病(ALL):z B系：早B前体-ALL(Pro-B), 普通-B-ALL(Common-B),前体B-ALL(Pre-B),及与Burkitt淋巴瘤进⾏鉴别z T系：早T前体-ALL (Pro-T), 前体T-ALL(Pre-T),⽪质-T-ALL和髓质-T-ALL.1.2急性早幼粒细胞⽩⾎病（APL）1.3急性髓细胞⽩⾎病（AML）z AML微分化型（AML-M0）z AML伴粒系和单核细胞分化型（AML-M1/2和AML-M4/5）z急性红⽩⾎病（AML-M6）z急性巨核细胞⽩⾎病（AML-M7）1.4前体树突细胞肿瘤1.5急性嗜碱性粒细胞和肥⼤细胞⽩⾎病1.6 混合表型⽩⾎病1.7 对上诉急性⽩⾎病治疗后检测MRD的标志进⾏筛查2.抗体的选择：根据检测的⽬的，需要检测不同的抗体：2.1 鉴别急性、慢性⽩⾎病:对于急性髓细胞⽩⾎病，可以根据CD45/SSC图型进⾏初步判断。
髓系⽩⾎病细胞CD45的表达较弱，往往位于正常淋巴细胞下⽅，且多数⽩⾎病细胞SSC较低（除去⼤颗粒APL 患者）。
四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识(完整版)
四色流式细胞术用于急性白血病免疫分型的中国专家共识（完整版）白血病免疫分型是利用不同单克隆抗体检测白血病细胞胞膜和胞质抗原，通过流式细胞术(FCM）分析其表型，实现对白血病细胞系列来源及其分化程度的诊断。
白血病免疫分型已成为诊断白血病的必要依据，同时也可为微小残留病（MRD)的检测以及白血病的治疗和预后提供重要信息。
白血病免疫分型是细胞形态学分型的重要补充和进一步深化，以荧光标记技术联合FCM检测并判定白血病免疫表型，具有准确、快速、客观、重复性好、特异性强等特点，提高了白血病诊断的准确性[1, 2]。
采用不同数量及组合的荧光标记免疫抗体处理白血病细胞并进行荧光检测及分型是免疫分型的关键环节。
准确诊断需要选择一定数量的抗体，白血病免疫分型涉及多个造血系列的抗原，但目前国内甚至国际上均无规范化的方案可以借鉴；国内不同的医疗单位所用的抗体数量和种类均有较大的异质性，有些单位由于应用的抗体数量较少或抗体选择不当，影响对疾病的诊断、分期和预后的判断。
鉴于国内的实际情况，中国免疫学会血液免疫分会临床流式细胞术学组经过多次讨论，提出以CD45/侧向散射光（SSC）为基础的中国FCM急性白血病免疫分型四色方案，本方案以2组表面抗原作为筛查抗原，试图利用相对少的抗体，达到对各个类型白血病进行较全面的检测，具有快速、客观、准确的特点。
已在国内的多家医疗单位试用，证明此方案能够满足临床的需要[3, 4]。
目前，虽然国际上有八色甚至十色方案[5, 6, 7]，但对仪器及操作人员的技术要求较高。
鉴于国内的实际情况，我们首先提出中国FCM急性白血病免疫分型四色方案，供从事急性白血病免疫分型的实验室参考，以期促进我国急性白血病免疫分型诊断的规范化及整体水平的提高。
一、四色方案的基本要求理想的急性白血病免疫分型方案应满足以下几点要求：①识别白血病细胞，能将其与正常细胞或反应性细胞相区别；②鉴别白血病细胞的系列来源；③根据细胞的分化程度对疾病进行亚型分型；④鉴别用于检测MRD 的白血病相关免疫表型(LAIP) ;⑤帮助判断某些特异分子改变，即基因型检测；⑥提供预后相关及治疗靶点的免疫标志检测结果。
白血病免疫分型
CD11b
CD117
CD45
CD11b
CD5
Side scatter
+
Common B-ALL
急性前B细胞白血病
+
Pre B-ALL
急性B细胞白血病
+
B-ALL
++ +/- + -/+ + --
- -+ -+ +- -/+ +
意义：Common B-ALL 预后相对较好，CD34+B-ALL比CD34预后好，但CD34+患者伴Ph1+预后差。B-ALL预后相对 差，但随化疗方案改进，预后有所改善。
(二）.正常T细胞标志：根据在胸腺内发育阶段分4期
CD7 CD2 CD5 CD34 CD1a CD3c/m CD4 CD8
I期 ： + + + +
-/+
II期： + + + - + -/+
III期： + + + - + +/+ + +
Ⅳ期： + + + - -
+/+ +/- +/-
泛T：CD2，CD5，CD7， cCD3 幼稚T：CD34，TdT，CD1a, CD4/8， 成熟T：CD3，CD4，CD8
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临床意义
用于血液病的诊断和分型诊断
方案（Protocol）
2．首先每管中加入标本(骨髓或外周血)100ul(根据细胞的多少决定)，5ulCD45-PC5抗体。室温避光20分钟。
3．每管中加入固定液100ul，剧烈振荡混匀，室温避光15分钟。
4．各管中加入PBS4ml。
5．300g离心5分钟后，弃去上清液，振荡混匀。透膜剂100ul，轻轻混匀，室温避光5分钟。
采集部位骨髓采血
抗凝剂EDTA或肝素抗凝
要求1．样本量1ml。
2．样本应在采集后6小时内处理，冷冻或溶血的标本不能用。
3．样本白细胞计数应在4.0-10.0×109/L之间。若>10.0×109/L，样本需要稀释，用PBS稀释；若<4.0×109/L，应分离单个核细胞。
试剂
品牌剂型规格贮存
贝克曼库尔特
白血病免疫分型测定
方法
流式细胞仪(BeckmanCoulter，贝克曼库尔特)
原理：
双色直接免疫荧光法。荧光素标记的各种单克隆抗体加入到全血中，与细胞膜上或膜内相应的抗原结合，经过溶血、洗涤（和固定）等步骤后，在流式细胞仪上进行分析，从而得到百分数。
标本采集与处理
受检者的准备检查对象生活饮食处于日常状态。
2．首先每管中加入5ulCD45-PC5抗体。
3．然后，按管上的标记，加入相应抗体各10ul(注意：必须是FITC和PE标记的抗体搭配)
4．各管中加入标本(骨髓或外周血)30～100u1(根据细胞的多少决定)，振荡混匀，室温避光20～30分钟。
5．溶血：a. OptiLyse C(按说明书步骤溶血)
7．加抗体，阴性对照管中加入10ul，其余各管加入相应抗体各10ul，室温避光15分钟。
8．各管中加入4mlPBS，振荡混匀。
9．300g离心5分钟后，弃去上清液。
10．各管中加入PBS500ul，振荡混匀。
11．上机测样
报告结果
报告百分数
操作性能
精密度批内五次重复CV<2％
参考值
CD34+<5%MPO+<5%
b.使用COULTERQ—PREP制备系统
开机---显示READY灯亮---选择35SEC灯亮---开门---放入试管关门---自动进行溶血---显示READY灯亮---开门---取出试管---再进行下一个样品测定。
（*溶血前确认A/B/C管路充满并能打出液体）
细胞浆和核抗原
1．准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体，其中一管是同型对照。
3：鞘液(No.8546859)液体20L室温
4：清洗液(No.8546930)液体5L室温
5：荧光微球(No.6605359)液体10ML2-8℃(Flow-Check)
仪器
BeckmanCoulterEPICSXL/FC500/Altra
操作-样本制备：
细胞膜表面抗原
1．首先准备所需的管，并在管上标记上欲加入的抗体。
成分1：单克隆抗体液体2—8℃
(CD34No. IM1871CD45-PC5No.IM2653/IM2652
Flow-Count荧光微球No.7547053)
2：全血溶血试剂(Q-Prep)液体(No.7546946)
A：甲酸液体70ML室温
B：碳酸钠等液体32ML室温
C：多聚甲醛液体14ML室温
(OptilyseC No.IM1401)液体室温