牙周膜干细胞的研究进展_0
大鼠牙周膜干细胞分离、培养及应用的研究进展
[文章编号] 1674-8603(2016)01-0054-03大鼠牙周膜干细胞分离㊁培养及应用的研究进展刘 努1,李 萌2,赵 盼2,刘 琪1*(1.遵义医学院附属口腔医院牙周科,贵州遵义563003;2.第四军医大学口腔医院组织工程研究中心,军事口腔医学国家重点实验室,陕西西安710032)[摘要] 大鼠牙周膜干细胞的分离㊁培养方法与人牙周膜干细胞有着不同之处,分离㊁培养大鼠牙周膜干细胞存在磨牙小㊁牙周膜组织来源少以及拔牙困难等难点㊂然而,在基础研究中,大鼠牙周炎模型的建立应用广泛,分离㊁培养大鼠牙周膜干细胞用以探讨牙周炎致病机制,明确机体内环境改变是否通过影响牙周膜干细胞的生物学性能导致牙周组织破坏严重与修复困难具有重要作用;另一方面,大鼠牙周膜干细胞分离㊁培养方法建立后,可以尝试从干细胞水平为治疗牙周病与促进牙周组织再生提供可靠的理论依据㊂因此,综述分离㊁培养大鼠牙周膜干细胞的可行方法有着十分重要的意义,有十分可观的应用前景㊂[关键词] 牙周膜干细胞;牙周炎;大鼠[中图分类号] R780.2 [文献标识码] A [doi ] 10.3969/j.issn.1674-8603.2016.01.013基金项目:国家自然科学基金资助项目(81360168)*通信作者:刘 琪 Email:liuqi1964@牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)是牙周组织工程与口腔再生医学中一种重要的种子细胞[1]㊂目前国内外对人PDLSCs 的培养方法已经成熟,主要采用人第三磨牙或正畸患者拔除的前磨牙的牙周膜组织,进行体外分离㊁培养的方式而获得[1-3]㊂由于受到临床取材数量以及医学伦理等方面的限制,无法有效㊁快速㊁大量的获取人PDLSCs 已成为限制口腔再生医学和相关基础研究进程的瓶颈㊂大鼠牙周疾病模型应用广泛,探索分离㊁培养大鼠PDLSCs 的技术,并在此基础上鉴定大鼠PDLSCs 的生物学性能,将为进一步的机理性实验与应用性研究奠定基础㊂本综述就大鼠PDLSCs 的分离㊁培养方法,细胞的生物学性能,以及应用前景做一回顾总结㊂1 大鼠PDLSCs 分离㊁培养大鼠PDLSCs 的分离㊁培养方法远不及人PDLSCs 方便㊁简单㊂最初的研究尝试利用大鼠的磨牙培养PDLSCs,然而大鼠磨牙甚小㊁牙周膜组织少,且拔牙较为困难,使得获取大鼠磨牙的牙周组织成为挑战[4-6]㊂此外,鼠类属于低等哺乳类动物㊂研究表明,低等动物组织细胞的分离㊁培养过程中,细胞不易存活,且状态不佳[7]㊂因此,鼠类PDLSCs 的分离㊁培养较为困难,大鼠PDLSCs 培养过程中对获取的牙周膜组织要求更严格㊁培养条件要求极高㊂近年来,学者提出大鼠门齿相比于大鼠磨牙存在诸多优势:数目较多(4个),体积较大,牙周膜面积大,能获取牙周膜组织较多;大鼠的门齿不断生长,咀嚼行为能刺激牙周膜组织的再生,获取的PDLSCs 的活性可能较好㊂利用大鼠门齿来获取大鼠PDLSCs 成为热点探讨的方法[8-9]㊂当前,利用门齿进行大鼠PDLSCs 的分离㊁培养步骤可归纳如下:拔取年轻大鼠的4个门齿(要求门齿无牙周疾病㊁拔除门齿需完整以及去除牙龈牙槽骨等其他软硬组织),立即置于含3%胎牛血清的无菌PBS 缓冲液中;用无菌拔髓针除尽牙髓组织,并用PBS 反复冲洗髓腔与根面,直至冲洗后的液体清亮为止;刮取门齿根中1/3的牙周膜组织并修剪成1mm 3大小的组织块,使用0.3%Ⅰ型胶原酶与Dispase 酶等量混合在37ħ培养箱中消化60min (每15min 震荡一次);加入等量的含血清培养液终止消化,1000r /min 离心5min,弃上清液;少量培养液重悬组织后,均匀致密铺板于直径较小的培养皿中,加入含有15%胎牛血清的α-MEM 培养液,置于37ħ㊁5%CO 2培养箱中培养㊂隔日观察,3天换液,等待细胞长至皿底面积的80%时进行消化和传代[8-9]㊂这种大鼠PDLSCs 的分离㊁培养方法的主要特点可总结如下:首先,大鼠磨牙小㊁拔牙困难,则采取拔取大鼠门齿的方法,多个门齿的牙周膜组织共同分离㊁消化后同时置于小型无菌塑料培养皿中,利用组织密集性来获取原代PDLSCs;其次,由于门齿的根端呈开放型,为了保证细胞的纯度和活力,需去净牙髓组织再分离牙周膜组织,消化后大鼠牙周膜组织铺板时需具有致密性;最后,大鼠牙周膜组织的消㊃45㊃口腔生物医学2016年3月(第7卷第1期) Oral Biomedicine,Vol.7,No.1,Mar.2016化体系为Ⅰ型胶原酶与Dispase酶的等量混合液,消化时间在人PDLSCs的分离基础上需适当延长,选择使用塑料器皿使之有利于PDLSCs的贴壁生长[8-9]㊂2 大鼠PDLSCs的生物学特性分析使用上述方法分离㊁培养的大鼠PDLSCs与人PDLSCs形态相似:大多数细胞呈现梭形,少数为带刺突或触角的不规则形,细胞胞体较小㊁包浆丰满,种系来源之间无明显差异[10]㊂大鼠PDLSCs与人PDLSCs和大鼠骨髓来源间充质干细胞(bone mar-row mesenchymal stem cells,BMMSCs)功能相近:具备不断增殖更新以及多向分化的潜能,并且具有间充质干细胞干性的生物学特征[10-11]㊂相对来讲,大鼠PDLSCs的增殖能力较人PDLSCs稍弱㊂大鼠PDLSCs不仅在体外能够增殖和成骨㊁成脂分化,而且在体内可再生出类骨组织或牙骨质/牙周膜样组织[8-9]㊂因此,大鼠PDLSCs在大鼠单纯牙周炎以及系统性疾病伴牙周炎的治疗应用中很可能再生牙周组织并修复牙周组织缺损㊂3 大鼠PDLSCs的应用前景牙周病病因的复杂性㊁病理过程的反复性以及临床治愈的困难性一直是研究难点和关注焦点㊂人PDLSCs的发现,为基于成体干细胞治疗牙周组织缺损提供了一个全新的方法,使牙周组织再生进入了一个新的时期㊂尽管如此,复杂的牙周病发病机理仍然不甚清晰,人PDLSCs的研究受伦理以及机体内环境的改变等多方面条件制约而受限㊂为此,分离㊁培养大鼠PDLSCs的意义十分重大㊂3.1 在牙周病机理研究中的应用流行病学调查结果显示,牙周病在我国人群中患病率高于70%,并有逐年上升的趋势[12]㊂近年来临床和基础研究资料表明,牙周病与全身健康和疾病有着双向的密切关联[13-16]㊂研究表明,牙周病与糖尿病之间存在着越来越多的共同危险因素,且互为高危因素[17-19]㊂精神压力也是牙周病发生及发展的重要危险因素[12,20-21]㊂此外,牙周病与骨质疏松症有一些共同的危险因素等[22-23]㊂然而,牙周病与全身各种疾病的相关基础研究与发病机理仍缺乏相关实验研究,当前利用干细胞治疗恢复牙周组织缺损的远期效果尚难以确定,其中取材受限是导致体内实验研究证据不足的主要原因之一㊂因此,从细胞㊁基因与蛋白水平更深入地探索系统性疾病与牙周病的相互作用机制成为一种挑战,基于大鼠PDLSCs分离㊁培养的基础研究成为了临床应用必不可少的环节㊂从门齿进行大鼠PDLSCs 的分离㊁培养为后续的一系列基础实验性及应用性研究奠定了基础,使得模拟人类疾病(如糖尿病伴牙周炎㊁骨质疏松症和抑郁伴牙周病等)和后续的细胞学实验在动物模型上成为了可能㊂此外,大鼠PDLSCs也为基础性研究中提供疾病来源和基因干预的PDLSCs提供了可能㊂3.2 在牙周组织再生中的应用利用人PDLSCs的多向分化能力以及体内再生能力的特性,将人PDLSCs作为种子细胞用于组织修复和细胞治疗的研究已经成为当前研究的热点㊂为了适应基础性研究㊁减少科研成本以及降低免疫排斥反应等,科研工作者们已从鼠类分离㊁培养了多种间充质干细胞,其中以BMMSCs应用最为广泛[24-25]㊂然而,在牙周组织再生中,BMMSCs并不能替代PDLSCs㊂Akizuki等[26]学者将BMMSCs和PDLSCs细胞膜片移植入大鼠或比格犬的牙周组织缺损处,6周后取材结果表明,虽然BMMSCs细胞膜片形成的骨样硬组织多于PDLSCs,但是BMMSCs形成骨样组织不能将软硬组织与牙齿联为一个整体,而只有PDLSCs形成的细胞膜片植入牙周缺损后,能形成牙周附着这种独特的组织结构㊂Dan等[27]和Hasegawa等[28]研究结果也显示,PDLSCs再生形成复杂的牙周膜样组织的能力显著高于其他组织来源的干细胞㊂因此,大鼠PDLSCs将会成为牙周组织工程与再生医学的重要种子细胞,分离㊁培养得到的大鼠PDLSCs有着不可替代的作用㊂4 总结与展望综上所述,通过分离大鼠门齿牙周膜组织,可成功获取㊁培养大鼠PDLSCs,并具有良好的再生应用相关的生物学特性㊂尽管分离㊁培养大鼠PDLSCs 过程较复杂,但是获取的大鼠PDLSCs有着重要的意义:从临床疾病发病的角度来分析,可进一步探索机体内环境的变化如何介导PDLSCs功能变化来影响牙周组织的损伤与再生;从牙周组织再生的角度来研究,大鼠PDLSCs是研究牙周病中牙周缺损和再生的合适种子细胞㊂大鼠PDLSCs的妥善分离㊁培养将给予基础和临床研究以新的希望㊂[参考文献][1] Seo BM,Miura M,Gronthos S,et al.Investigation of multipotentpostnatal stem cells from human periodontal ligament[J].Lancet, 2004,364(9429):149-155.㊃55㊃刘努,等.大鼠牙周膜干细胞分离㊁培养及应用的研究进展[2] Gao LN,An Y,Lei M,et al.The effect of the coumarin-like deriva-tive osthole on the osteogenic properties of human periodontal liga-ment and jaw bone marrow mesenchymal stem cell sheets[J].Bio-materials,2013,34(38):9937-9951.[3] 崔晓霞,杨琨,伍燕,等.糖基化终末产物介导的牙周膜干细胞成骨分化过程中Wnt经典信号通路相关作用机制的研究[J].牙体牙髓牙周病学杂志,2013,23(9):564-568. 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牙周膜干细胞在再生医学中的进展
因素均会对细胞的分化模式、分化方向产生影响，合理调控分 化因素，便于对细胞定向分化的掌控。
维生素是一种维持人体正常生理功能的一类微量有机物， 在维持细胞活 性，延 长 细 胞 寿 命 等 方 面 有 着 重 要 作 用。Wei 等〔10〕研究表明，在维生素 C 的刺激下，PDLSC 的 I 型胶原、整 联蛋白 β1 的表达量均增多，并且干细胞标记 Oct4、Sox2、Nanog 的表达上调，特别是成骨标记 RUNX2、ALP 和 OCN 的表达增 加，与未经维生素 C 处理的 PDLSC 相比，这种类型的 PDLSC 在 组织再生方面具有显著优势。Chadipiralla 等〔11〕从人的乳牙牙 周膜中分离 PDLSC，在维甲酸的作用下连续培养 3 w，结果显 示： PDLSC 在骨源性分化方面具有更大的潜能。
2. 2 PDLSC 的神经分化 多种成体干细胞均具有向神经方向 分化的潜能，特别是在胚胎形成时期，与神经系统同属于外胚 层的细胞更具优势。
Zhen 等〔9〕对 PDLSC 先采用一定的方式进行预诱导，随后 用 β-巯基乙醇进行神经样细胞的定向诱导，诱导 6 h 后，进行 相关蛋白及基因表达的检测。检测结果显示： 经诱导的 PDLSC 表达神经微丝蛋白、神经胶质酸性蛋白以及神经元特异性烯醇 酶，并且表达量远高于对照组； 从形态学角度可见，经诱导后的 PDLSC 有一定的神经样细胞形态。
趋化因子是一类可吸引细胞向特异部位移行的小分子化 合物，特别是在炎症反应中有着重要作用。Du 等〔12〕通过趋化
1 PDLSC 的发现及相关分离鉴定 在 2004 年，Seo 等〔3〕首次从人类牙周膜组织中分离出了一
牙周膜细胞功能研究总结
牙周膜细胞功能研究总结牙周膜是位于牙根和牙槽骨之间的一种结缔组织，其中的细胞成分在维持牙周组织的健康和稳定方面发挥着至关重要的作用。
牙周膜细胞主要包括成纤维细胞、成骨细胞、破骨细胞、成牙骨质细胞以及牙周膜干细胞等。
对这些细胞功能的深入研究，有助于我们更好地理解牙周疾病的发生机制，以及开发新的治疗策略。
成纤维细胞是牙周膜中最丰富的细胞类型，它们合成和分泌胶原蛋白、弹性纤维等细胞外基质成分，为牙周组织提供支持和韧性。
成纤维细胞还参与牙周组织的修复和再生过程，当牙周组织受到损伤时，成纤维细胞会增殖并迁移到损伤部位，合成新的基质以促进愈合。
此外，成纤维细胞还能通过分泌细胞因子和生长因子，调节其他牙周膜细胞的功能。
成骨细胞负责骨的形成和矿化，在牙周膜中，它们参与牙槽骨的重塑和修复。
成骨细胞能够合成骨基质蛋白，如骨钙素和Ⅰ型胶原蛋白，并在骨基质矿化过程中发挥关键作用。
当牙周组织受到炎症刺激或机械损伤时，成骨细胞的活性会受到影响，导致牙槽骨吸收和破坏。
破骨细胞则与成骨细胞的功能相反，主要负责骨的吸收和降解。
在正常的生理过程中，破骨细胞和成骨细胞协同工作，维持牙槽骨的动态平衡。
然而，在牙周疾病中，破骨细胞的过度活化会导致牙槽骨的快速破坏和吸收，加重病情。
成牙骨质细胞是形成牙骨质的主要细胞类型，它们能够合成和分泌牙骨质基质，将牙根固定在牙槽骨中。
成牙骨质细胞的功能异常可能导致牙骨质的形成障碍，影响牙齿的稳定性和牙周组织的健康。
牙周膜干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞群体。
它们可以分化为成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞等牙周膜细胞类型，为牙周组织的再生提供了细胞来源。
近年来，对牙周膜干细胞的研究成为了牙周组织工程领域的热点，通过体外培养和扩增牙周膜干细胞，并将其移植到受损的牙周组织中，有望实现牙周组织的完全再生。
在研究牙周膜细胞功能的过程中，科学家们采用了多种实验技术和方法。
例如，细胞培养技术可以在体外模拟牙周膜细胞的生长环境，研究细胞的增殖、分化和功能；免疫组织化学和原位杂交技术可以用于检测细胞中特定蛋白和基因的表达；动物实验则可以在体内观察牙周膜细胞在生理和病理状态下的行为和作用。
牙周膜干细胞论文：牙周膜干细胞的培养和鉴定
牙周膜干细胞论文：牙周膜干细胞的培养和鉴定【中文摘要】本研究从离体牙的牙周膜上分离出牙周膜细胞群,并对其进行纯化；在此基础上,对纯化后的细胞进行鉴定。
证实该细胞为“干细胞性”细胞,为后续牙周组织工程研究提供实验基础。
方法：1.分离纯化人牙周膜干细胞收集临床因正畸或阻生拔出的无龋病、无牙周病的恒牙,取根中1/3的牙周膜,采用酶解组织块法分离到牙周膜细胞群,然后有限稀释克隆法对牙周膜细胞群进行纯化,通过MTT法分析牙周膜细胞群与纯化后的牙周膜细胞的生长情况。
2.牙周膜来源干细胞的初步鉴定采用流式细胞仪分析细胞周期和细胞表面标记物,经成骨诱导液诱导细胞,对细胞进行初步鉴定。
结果：1.有限稀释克隆纯化后的细胞呈长梭形,通过MTT检测,证明该细胞是慢增殖周期的细胞。
2.流式细胞仪检测纯化后的细胞的周期特点和细胞表面标志物,证实其符合干细胞特性。
3.诱导纯化后的细胞成骨分化,细胞出现单极化,其间有针尖大小的钙结节形成,证实纯化后的细胞具有分化潜能。
结论：1.酶解组织块法有效分离到人牙周膜细胞群,有限稀释克隆纯化获得的牙周膜干细胞保持了其生物学特性。
该细胞具有干细胞周期特点,且有成骨分化潜能。
2.培养出牙周膜干细胞,可为组织工程提供基础。
【英文摘要】:Periodontal ligament cell populations were isolated from the periodontal membrane of extracted teeth and were purified; On this basis, the purified cells wereidentified. This paper confirmed that the cells were “stem cells” cells, to provide a basis for follow-up study of periodontal tissue engineering experimental.Methods:1. Separation and purification of human periodontal ligament stem cells Collecting the permanent teeth removal, without caries and periodontal disease, was indicated in the clinical cases due to orthodontic or impacted. Take the periodontal membrane on the middle 1/3 of the root surface. We separated cells within the periodontal tissue membrane by enzymatic, purified cells by limiting dilution cloning. The growth of periodontal ligament cell populations and purified periodontal ligament cells were analyzed by MTT.2. preliminary identification of Periodontal ligament stem cells:Cell cycle and cell surface markers were detected by flow cytometry. Osteogenic medium induced cells to identified cells.Results:1. Cells purified by limiting dilution cloning appeared Spindle. The results show that the cell is a slow proliferation cycle stem cells by MTT detection.2. The cells purified were detected cell surface markers and cell cycle characteristics by flow cytometry. The result demonstration that the cells accordance with characteristics of stem cell.3. Purified cells were induced by osteogenic medium, cells were unipolar, there have been needlethe size of calcium nodules, confirmed that the purified cells possess differentiation potential.Conclusion:1. Cells which maintain their biological characteristics were effectively isolated by Enzymatic and purified by limiting dilution cloning. And the cells have characteristics of stem cell cycle and potential of Osteogenic differentiation.2. Cultured periodontal ligament stem cells provide the basis for tissue engineering.【关键词】牙周膜干细胞组织工程细胞鉴定【英文关键词】Periodontal ligament stem cells Tissue Engineering Cell identification【目录】牙周膜干细胞的培养和鉴定摘要3-4ABSTRACT4-5缩略词表7-8第1章引言8-9第2章人牙周膜干细胞的分离培养和鉴定9-18第一部分分离纯化人牙周膜细胞9-13 1 材料和方法9-11 1.1 主要试剂和仪器9-10 1.2 细胞的分离和纯化10-11 2 结果11-12 2.1 细胞生长的情况11 2.2 细胞的克隆形成情况11 2.3 细胞生长曲线11-12 3 讨论12-13第二部分筛选纯化后的人牙周膜干细胞的鉴定13-18 1 材料与方法13-15 1.1 主要试剂与仪器13-14 1.2 方法14-15 2 结果15-16 2.1 流式细胞仪分析结果15 2.2 成骨分化诱导后细胞形态15-16 3 讨论16-18第3章结论与展望18-19致谢19-20参考文献20-22附图22-24攻读学位期间的研究成果24-25综述25-34参考文献32-34。
牙周膜干细胞在再生医学中的研究进展
牙周膜干细胞在再生医学中的研究进展郑伟;刘朋飞;冯业童;董超;周余来【期刊名称】《中国老年学杂志》【年(卷),期】2012(032)007【摘要】牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSC)是来源于牙周膜的一类成体干细胞,具有较强的自我更新能力,并且可以进一步分化成为多种具有不同功能特性的细胞.目前研究表明,牙周组织疾病在中老年人中具有较高的发生率,PDLSC在维持牙周膜功能稳定、修复牙源组织损伤和实现功能性细胞更新等方面具有重要意义,该类成体干细胞是牙周组织再生最为直接可靠的一类种子细胞,也是牙周组织疾病细胞治疗和基因治疗模式最为重要的细胞学基础,在组织工程与再生医学中有着重要的应用前景[1,2].【总页数】3页(P1546-1548)【作者】郑伟;刘朋飞;冯业童;董超;周余来【作者单位】通化市口腔医院,吉林通化 134000;吉林大学药学院生物工程实验中心;吉林大学药学院生物工程实验中心;吉林大学药学院生物工程实验中心;吉林大学药学院生物工程实验中心【正文语种】中文【中图分类】R781.4;Q813.1【相关文献】1.基于壳聚糖的纳米材料在骨组织工程与再生医学中的研究进展 [J], 李晓静;王新木;董研;苟中入2.冲击波在骨科-再生医学中的应用研究进展 [J], 杨以萌;张浩;廖伟雄;苏祥正;张宁;李冀;王克涛;张恭谦;朱恒;李众利;3.冲击波在骨科-再生医学中的应用研究进展 [J], 杨以萌;张浩;廖伟雄;苏祥正;张宁;李冀;王克涛;张恭谦;朱恒4.牙髓干细胞在组织工程及再生医学中的应用研究进展 [J], 王付燕;杜立群5.外胚层间充质干细胞在再生医学中的研究进展 [J], 罗玉婷;周智因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究
人牙周膜干细胞的分离培养及生物学特性研究目的：分离筛选人牙周膜干细胞，研究其生物学特性并进行初步鉴定。
方法：采用STRO-1为标记物以免疫磁珠分离筛选人牙周膜干细胞，观察细胞生长及克隆形成情况，流式细胞仪细胞周期、细胞表型分析，免疫细胞化学染色技术检测STRO-1、Vimentin表达，并测定细胞体外多向分化能力。
结果：免疫磁珠法可获得人牙周膜干细胞，细胞具有克隆形成能力，增殖速度低。
细胞周期分析大多数细胞处于G0/G1期,为慢周期性;细胞表型分析证实CD146、CD44高表达，CD34、CD45低表达。
STRO-1及Vimentin均为阳性染色，矿化诱导和成脂诱导证实该细胞具有多向分化能力。
结论：免疫磁珠法是有效的分离纯化牙周膜干细胞的方法。
所分离细胞具有干细胞的细胞周期、表型特点及多向分化能力。
Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells, meanwhile, CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells.Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry研究证实牙周膜内存在具有横向分化能力的干细胞(牙周膜干细胞)，在体外微环境作用下还可分化为成牙骨质细胞或成骨细胞[1-2]。
体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究进展
体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究进展作者：吴玲来源：《中国保健营养·中旬刊》2014年第02期【摘要】牙周膜干细胞因高度自我更新能力和多向分化潜能能形成类似于天然牙骨质牙周膜复合体的结构，使其在临床上具有广泛应用前景，目前在牙周组织工程方面的应用研究已取得一些进展，被认为是牙周组织工程的首选种子细胞，但是牙周膜组织中干细胞含量非常少，如何用成体干细胞替代牙源性干细胞，从而获得大量种子细胞。
本文就目前体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究做一综述。
【关键词】牙周膜干细胞；增殖；细胞因子【中图分类号】R748 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）02-0534-02牙周炎是一种侵犯牙周组织（牙龈、牙周膜、牙骨质和牙槽骨）的慢性炎症性疾病，是由于细菌侵犯牙龈和牙周组织而引起的牙龈发炎肿胀，牙周袋形成、牙槽骨丢失，最终导致牙齿松动脱落病变，牙周炎是成年人牙齿丧失的主要原因之一。
全球重度牙周炎患病率为5-20%。
本文就目前体外培养牙周膜干细胞促进其增殖的研究做一综述。
1.1 釉基质蛋白（EMP）由上皮根鞘内层的成釉细胞分泌，主要成分是釉原蛋白（amelogenin，Am）和非釉原蛋白（non-amelogenin）。
众多实验都已证实EMP对牙周膜干细胞和骨髓基质干细胞[7]有明显的促增殖作用，可以提高干细胞总蛋白的合成，碱性磷酸酶（ALP）的活性以及矿化结节的形成，并且作用的效果呈时间和质量浓度依赖性。
刘兰宁等用不同浓度的EMPs诱导牙周膜干细胞，得出EMPs在一定浓度下可以促进人PDLCs增殖，以100mg/L浓度最佳。
1.2 骨形成蛋白（BMP）除BMP-1外其余均属于转化生长因子-β超家族成员，在胚胎发育期间由多种上皮和间叶组织产生，诱导间叶细胞分化为软骨细胞和成骨细胞，参与软骨与骨发育，参与四肢形成及肺、肝、肾等软组织发育，与交感神经元分化有关。
在BMPs中，BMP-2的诱骨作用最强，是发现的唯一能单独诱导成骨的骨形成蛋白，存在于具有成骨潜质的细胞的细胞质中，可以诱导未分化的间充质细胞向成骨细胞和成牙骨质细胞分化，促进牙周组织新骨的形成。
牙周膜干细胞生物学研究新进展
牙周膜干细胞生物学研究新进展贺慧霞;刘洪臣【摘要】牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSC)是在干细胞理论和技术发展较为成熟的基础上提出的.PDLSCs具有分化形成牙槽骨、牙骨质和牙周膜的潜能,在牙周生理、病理和牙周病再生治疗中发挥极其重要的作用.对PDLSCs生物学的研究是解读这一系列事件的钥匙.本文就PDLSCs生物学作用、来源、组织学定位、分离和鉴定等方面研究的最新进展做一综述.【期刊名称】《中华老年口腔医学杂志》【年(卷),期】2010(008)003【总页数】4页(P176-179)【关键词】牙周膜干细胞;生物学;进展【作者】贺慧霞;刘洪臣【作者单位】解放军总医院口腔内科,北京,100853;解放军总医院口腔医学研究所,北京,100853【正文语种】中文【中图分类】R781.4牙周膜干细胞(periodontal ligamentstem cell,PDLSC)是牙周组织再生最直接、最可靠的种子细胞，也是牙周缺损细胞治疗和基因治疗重要的细胞学基础，在牙周病治疗、种植体周围软硬组织缺损修复、正畸牙移动过程中的修复与改建中均发挥重要作用，是近年来牙周病研究领域的焦点和热点之一。
其中关于 PDLSC的生物学作用、来源、组织学定位、分离方法、分化特性等方面研究都取得了可喜的新进展，为重新认识 PDLSC的生物学特性提供了依据。
1.PDLSC的生物学作用PDLSC是指存在于牙周膜中具有自我更新和横向分化潜能的未分化的干细胞群，是由处于不同分化层次、具有不同分化潜能的祖细胞或前体细胞组成[1]。
目前已证实 PDLSC能分化形成牙骨质、牙槽骨和牙周膜样组织，但对于牙周骨缺损修复细胞来自骨组织还是来自牙周膜一直存在不同意见。
最近有学者[2]通过 PDLSC示踪发现：表达骨髓基质干细胞(bone marrow stem cell,BMSC)表面标志分子CD166、CD105的 PDLSC具有成骨潜能，当牙周损伤导致牙槽骨缺损后，这些PDLSC迁移、分化为成骨细胞修复牙槽骨缺损，而牙周膜中不存在BMSCs。
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牙周膜干细胞的研究进展牙周组织工程是牙周病治疗研究的热点，牙周膜干细胞是其关键种子细胞之一。
本文就牙周组织工程的相关研究和牙周膜干细胞的来源、分离与培养、细胞表型、生物学特性、功能影响因素和分子调控进行综述，并对其面临的挑战和前景作一讨论。
标签：牙周组织工程；牙周膜干细胞；挑战；展望Research progress on periodontal ligament stem cellsDong Zhengmou1，2, Liu Luchuan1.（1. Dept. of Stomatology, Institute of Field Surgery, Daping Hospital, The Third Military Medical University, Chongqing 400042, China; 2. Dept. of Stomatology, People’s Hospital of Hongan, Huanggang 438400, China）[Abstract]The periodontal tissue engineering has been a striking research on the treatment of periodontal dis－ease, and the periodontal ligament stem cell is one of the key seed cells on the periodontal tissue engineering. In this study, a related research on periodontal tissue engineering, and the source, isolated and cultured, cell pheno－type, biological characteristics, influential factor of function, molecular regulation on the periodontal ligament stem cells would be reviewed, meanwhile the challenges and prospects on it would be discussed.[Key words]periodontal tissue engineering；periodontal ligament stem cell；challenge；prospect牙周病是人类口腔疾病中的常见病和多发病，常导致牙周支持组织破坏或缺损，严重影响人类的生理和心理健康。
目前，牙周支持组织重建主要依赖机械、药物或引导组织再生技术，随着分子生物学、组织工程学和干细胞技术的飞速发展，牙周组织再生工程技术成为牙周病治疗研究的热点，牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cell，PDLSC）是牙周组织再生工程的关键种子细胞之一，本文就其研究现状和进展作一综述。
1牙周组织工程学牙周组织工程学是将获得的种子细胞和或调控因子种植于具有良好生物相容性和降解性的支架材料上，并将这种生物复合体植入牙周组织以形成新的具有原来特殊形态和功能组织的技术和方法，为牙周病的治疗研究开辟了新的思路。
1.1牙周组织工程的种子细胞种子细胞是牙周组织再生工程的基础。
牙周膜细胞（periodontal ligament cell，PDLC）分化、增殖能力较强，是常用的牙周组织工程种子细胞[1]；牙龈成纤维细胞、成牙骨质细胞、胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）[2]、牙胚细胞、成体干细胞、骨髓基质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC）[3]、脂肪干细胞等在一定条件下均可成为牙周组织工程的种子细胞。
PDLSC不仅能分化为成牙骨质细胞样和成骨细胞样细胞，而且可分化为成纤维样细胞，形成牙骨质样、骨样和类似天然牙周膜样结缔组织，其形态结构、空间排列类似天然牙周膜-牙骨质复合体结构[4]，显示了PDLSC作为牙周组织工程种子细胞的研究和应用价值，是牙周组织工程较为理想的种子细胞。
1.2生物支架材料生物支架模拟细胞外基质，为组织、器官再生提供一个良好的微环境。
目前，相关支架材料的研究主要有羟磷灰石类、胶原、合成聚酯和复合型材料。
天然衍生型羟磷灰石的骨小梁和晶体结构有利于细胞生长、分化和矿化形成；胶原可保持细胞表型与生物活性，具有良好的可塑性和生物相容性；合成聚酯如聚羟基乙酸、聚乳酸和聚乳酸聚羟基乙酸等材料可预设成形，并可自由调控其强度和降解率；复合型材料结合有机、无机材料的优点，有望更适合细胞生长。
1.3调控因子调控因子可影响细胞分化、增殖、迁移、黏附和胞外基质的合成，能促进牙周组织再生和修复。
目前，与牙周组织再生相关的生长因子包括碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）、釉基质蛋白、胰岛素样生长因子、血小板源性生长因子、转化生长因子-β和Wnt基因家族等[5]。
2来源、分离和培养PDLSC主要来源于牙周膜的成体干细胞，用组织块法、酶消化法或二者联合的方法处理牙周膜可获得前体干细胞，再利用免疫磁珠法、有限元稀释法和流式细胞分离技术可得到PDLSC，进行单克隆扩增即可获高纯度PDLSC[1，6]。
免疫磁珠和流式细胞分离技术分离PDLSC速度较快，但细胞获得率较低；有限稀释法步骤烦琐，速度慢，细胞克隆率较高。
免疫磁珠法和流式细胞分离技术仍然是目前公认的有效的分离方法。
PDLSC可使用含胎牛血清、维生素C、L-谷胺酰胺、青霉素、链霉素的达尔贝科极限培养液，在37℃，5% CO2孵箱内培养；也可在含20μg·L-1表皮生长因子、50μg·L-1的bFGF、10μg·L-1白血病抑制因子的神经微球形成培养系统中培养；Yang等[6]利用发育中的根尖牙胚培养液与PDLSC共培养，发现此种培养液可促进PDLSC的分化和牙骨质形成。
3生物学表型目前PDLSC缺乏特异性标记物，只能从相关生物学特性上进行鉴定：如表达间充质干细胞标志物、腱细胞标志物和BMSC表面标志物等。
Seo等[7]利用免疫组织化学、反转录-聚合酶链反应、RNA印迹和蛋白质印迹等方法研究后发现，PDLC表达间充质干细胞表面分子Stro-1、细胞黏附分子CD146和细胞跨膜糖蛋白18。
Trubiani等[8]利用流式细胞分离法、免疫磁珠分离法、抗体微阵列技术和免疫荧光技术等方法研究后发现，PDLSC表达间质细胞标志物细胞黏附分子CD349，ESC标志物细胞黏附分子CD10、CD26、CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166，阶段特异性胚胎表面抗原-1、4，转录因子Oct-4和Nanog，同时表达表皮细胞生长因子和干扰素诱导蛋白-10，其中间充质干细胞表面分子基质细胞抗原-1、细胞黏附分子CD146、CD105和CD166是公认的鉴定PDLSC 的特异性标记物。
另外，细胞形态、超微结构及动力学特性也是鉴定PDLSC的重要方面，PDLSC常位于小血管周围，体积小，圆形、卵圆或多角形，超微结构上核浆比例低，细胞器少，而且细胞处于G0期，保持静止状态[9]。
4生物学特性4.1多向分化潜能在特定培养环境诱导下，PDLSC具有多向分化潜能，具有分化成成骨细胞、成牙骨质细胞、脂肪细胞、胶原细胞和软骨细胞的能力。
将PDLSC用0.5 mmol·L-1异丁基甲基黄嘌呤、0.5 mol L-1氢化可的松、60 mol·L-1吲哚美辛诱导6周后，可检测到脂肪细胞特异性油红O脂滴，反转录-聚合酶链反应检测发现，特异性核转录因子———过氧化物酶增生物激活受体γ2表达上调[7]。
PDLSC还可表达神经前体细胞和神经胶质细胞标志巢蛋白和胶质纤维酸性蛋白，表明PDLSC具有向神经细胞分化的潜能。
4.2高度增殖能力细胞周期是细胞增殖的重要指标之一，大多数PDLSC处于G0/G1期，即静止期和DNA合成前期，G2、S期细胞数目较少，表明其克隆增殖潜能较大。
PDLSC 在体内具有高度克隆形成能力，在体外同样具有较好的增殖能力，在化学条件下诱导PDLSC，可保持其较高的增殖与黏附能力[10]。
4.3自我更新能力PDLSC、牙髓干细胞、脱落乳牙和牙囊干细胞等都具有自我更新的能力[11]。
将分离扩增的PDLSC在含有无机磷酸盐、地塞米松、L-抗坏血酸等矿化诱导液中培养，经细胞茜素红染色后可观察到有钙结节的形成，这证实了PDLSC具有自我更新的能力[7]。
5影响因素PDLSC是新近发现的成体干细胞，具有多向分化、高度增殖和自我更新的潜能，但这些功能也受多种因素的影响。
5.1牙周微环境不同微环境下的PDLSC可表现出不同的潜能。
牙本质和根尖微环境对PDLSC分化具有诱导作用，经牙本质非胶原蛋白（dentin noncollagenous protein，DNCP）诱导的PDLSC增殖和黏附能力增强，可形成特异矿化组织和穿通纤维结构；由上皮和间充质复合体培养液诱导的PDLSC则表现出较强的增殖和矿化活性，可形成纤维-牙骨质复合体结构[6]。
5.2炎症与免疫因素炎性因子干扰了细胞赖以生存的微环境，影响细胞代谢和功能，炎症在某些情况下可促进PDLSC的增殖活动，但同时又可抑制其向特定细胞分化的能力；虽然PDLSC有很强的分化克隆能力，但其数量常常产生不足，部分原因可能在于免疫损伤的作用[12]。
5.3冷藏保存体外获得稳定生物学性状的PDLSC是其用于牙周组织工程的先决条件，若在活力最佳时期及时冻存种子细胞，则可简化PDLSC在牙周组织工程的研究步骤。
Seo等[13]研究冷藏PDLSC后发现，在一定温度下可以保持PDLSC的各种生物学特性，包括单克隆特性、多分化潜能和牙骨质、牙周膜形成能力等。
5.4年龄因素随着年龄的增长，PDLC的增殖和矿化能力下降，胶原分泌减少、降解酶活性升高；同样，老年个体PDLSC也可出现增殖和矿化能力下降的趋势。
Zheng 等[14]通过比较不同年龄PDLSC的增殖和分化能力，包括形态学、克隆率、细胞周期、成骨成脂能力和相关基因表达，发现随着年龄的增长，上述指标均出现了功能下降的趋势。
6分子调控机制目前，有关PDLSC分子调控机制的研究较少，尚处于起始阶段。
Klein等[15]将人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cell，HPDLSC）和DNCP 一起培养，观察发现，HPDLSC表现出了成牙骨质特性，经DNCP诱导的HPDLSC 在去矿化、去蛋白后，在牙本质表面有较强的分化增殖能力和黏附能力。