叶部病害分离

间接测定方法有很多种，比如：全氮量和核酸分析，干菌丝体 含氮量是4.5－8.5％，DNA 0.4－0.8％。此外，可以通过分析培 养液中糖的含量的变化，来间接证明菌丝的生长量。
7. 真菌菌种的保存
分离到的真菌要用适当的保存方法，以保持它的生活力和原有 的性状，并避免其他杂菌和螨类的污染。
保存的菌种要注明菌种的种、菌系和保存日期。
有些生活力差的真菌，存放在-20度的低温冰箱中效果最好； 近年来受到重视的是超低温保存法，降菌种通过特殊的处 理后，放入-70－-80度的低温环境中。
一、实验目的
1. 为了证实其病原菌的特性；
2. 为了进一步研究病原菌的形态、生活史、生理和生态特性；
3.Байду номын сангаас为了获得其发酵液等
鉴于以上原因，分离和纯化真菌是必需的，是保证整个实 验能够顺利进行的前提。
二、实验原理
真菌的分离就是将所需要的真菌与其他杂菌分开，供给适 当的条件，使它们繁殖而得到纯培养。
为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、 酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件， 即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只 利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯培养菌 株。
直接测定的方法有以下几种：
① 目力估测
优点：快速；缺点：精确度低。
② 直线生长
优点：能够进行多次测量，精确表明菌丝生长率；缺点：测量 的次数过多，容易造成培养菌的污染。
③ 湿重测定
优点：快，并且菌丝是未经处理而保持其原来的状态；
缺点：精确度低，只能测定一次，不能体现其延续性。
④ 干重测定
优点：比较精确；缺点：同上。
注意事项： ① 待分离组织必需是新鲜发病的。 ② 要掌握培养基的温度。 ③ 要掌握孢子悬浮液的浓度。
（3）细菌污染的排除
在分离过程中，由于细菌生长繁殖速度快于真菌，是获得病原真菌纯培 养最大的障碍。因此，在分离过程中，常采用一些方法来抑制细菌的生长， 从而保证能够获得目的菌株。
① 将培养基调节到酸性反应，在100mL培养基中加3滴25％的乳酸。
注意事项：
① 培养性状的观察与描述需要不断的观察，有一定的时间延续性；
② 最好选用多种培养基；
③ 培养性状的描述要注明培养基的种类、培养温度和有无光照等。
（2）生长量的测定
为了研究真菌的营养要求和环境影响，必需知道他们的生长率。 在一定时间内菌丝体增长的量，就是在这段时间内的平均长率。 真菌和其他微生物生长量与培养时间表现了特定的关系，如果 测量的次数较多，就能得到一个平滑的曲线，曲线的倾斜度就 是真菌菌丝的生长率。 真菌菌丝体的生长量，可以用直接和间接的方法进行测定。
② 培养基中加入适当的抗菌素，以抑制细菌的生长。
常用的抗菌素：
金霉素：浓度为30μg/mL，可以抑制多数细菌的生长；
青霉素：浓度为20μg/mL，可以抑制革兰氏反应阳性细菌的生长；
多粘霉素： 浓度为5μg/mL，可以抑制革兰氏反应阴性细菌的生长；
链霉素：浓度为40μg/mL，可以抑制大部分细菌的生长；
4. 一般分离方法
病原真菌种类繁多，其分离的方法不同，而同一种材料 又可用不同的方法分离。常用的方法可分为两大类，即组织 分离和稀释分离法。
（1）组织分离法
植物病原真菌（尤其是叶部病害）的分离一般都是用组 织分离法，即就是切取小块病组织，经表面消毒和无菌水洗 过之后，移在培养基平板上培养。
注意事项：
原因：主要是尽量减少腐生菌的污染
3. 组织的表面消毒
（1）升汞溶液：一般用0.1％的升汞溶液；升汞表面消毒所需 的时间因材料不同，处理的时间可自30s－30min不等，通常为 3－5min。（现在不用）
（2）次氯酸钠：所用的浓度一般每一次使用的是3％－5％的 水溶液，消毒时间为5－15min。
（3）酒精：常用浓度70％酒精。消毒时间一般很短，只有几 秒钟至1min。
三、实验步骤
1. 分离前的准备工作 （1）工作台的灭菌 （2）培养基的准备 （3）操作人员的清洁 （4）分离所需用具的消毒与灭菌
培养皿、小烧杯、接种针、酒精灯、解剖刀、剪刀、 纱布、记号笔、镊子、酒精、培养基、 表面消毒液
2. 分离材料的选择
（1）必需是新鲜发病的植株、器官或组织
（2）选择的组织必需是病健交界的部位
① 组织大小要适宜，一般为4－5mm的小块。
② 切取的组织块必需是病健交界的部位。
③ 要掌握消毒时间的长短。
（2）稀释分离法
植物病原真菌的分离一般很少用稀释法分离，但对于一些 产孢子量极大的病原真菌和霉菌，可以配制成孢子悬浮液进行 稀释分离。
具体步骤：将寄主组织受害部分的孢子洗下配成悬浮液， 经稀释后与熔化并冷却到45度左右的培养基混合，然后倒在灭 菌的培养皿中。
真菌菌种的常用保存方法如下：
（1）室温保存
温度在16－17℃，相对湿度60％左右；每隔3－6个月需要移植 一次；
存在问题：
① 保存大量的菌种时，定期移植不但工作量大和可能引起性 状的变化，而且容易发生差错和污染。
② 在长期培养和保存过程中，有些真菌可能退化。
（2）低温保存
常规方法：温度4－8度的冰箱中，每6－8个月需要移植一 次；
实验三 叶部病原真菌的 分离、培养、纯化
柯氏准则：
1. 这种微生物经常与某种病害有联系，发生这种病害往 往就有这种微生物的存在；
2. 从病组织上可以分离到这种微生物的纯培养，并且可 以在各种培养基上研究它的性状；
3. 将培养的菌种接种在健全的寄主上，可诱发与原来相 同的病害；
4. 从接种后发病的植物上，能再分离到原来的微生物。
氯霉素：浓度为50μg/mL，可以抑制大部分细菌的生长。
使用方法：除去氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在培养基灭菌后 并冷却至45℃左右时加入。 ③ 双层培养基法 真菌菌丝体能够穿透培养基，而细菌则没有这种能力。
5. 真菌培养性状的观察
培养真菌的目的主要是观察它的性状；研究环境条件对它的影响； 了解其生理生化特性。
（1）培养性状的观察：观察和描述真菌的性状最好是培养在琼胶培养 基上。
观察和记载的项目主要是：
① 菌落的质地；② 菌落形成是凸起的或者是有成簇的菌丝体；③ 形 成成堆的孢子是干的还是粘性的；④ 各种子实体和休眠结构的形成和 所需的时间；⑤ 菌落正面和背面的颜色，有无色素渗入培养基中；⑥ 有无特殊气味；⑦ 菌落中有没有部分呈扇状；⑧ 生长率的快慢。