(标准)斑马鱼胚胎原位杂交material&protocol
模式动物斑马鱼
模式动物斑马鱼斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。
斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。
可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。
斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。
雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。
胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。
受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。
一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。
目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。
AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。
Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。
WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。
此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。
这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。
二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。
ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。
射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。
斑马鱼相关实验操作
斑马鱼人工繁殖、受精和胚胎发育一、实验目的了解斑马鱼的生活和繁殖习性，掌握斑马鱼人工繁殖技术，了解斑马鱼受精、胚胎发育过程和形态模式形成的特点。
二、斑马鱼的生活和繁殖习性斑马鱼（Danio rerio）为热带鱼类，可在一年内多次产卵。
在合适的养殖条件下，4月龄的斑马鱼即性成熟；性成熟后每1-2周可以产卵一次，一条雌鱼一次可以产出数百颗卵子。
斑马鱼产卵受温度和光照长度的调节。
最适产卵水温为28.5℃，产卵的光调节周期为光照14小时，黑暗10小时。
为防止自然产卵，性成熟的雌、雄斑马鱼必须分开养殖。
斑马鱼具有下列特点：1、繁殖周期短，不受季节限制，容易获得所需要的精子、卵子和胚胎材料。
2、小型鱼类，可在实验室高密度养殖，饲养成本低。
3、是脊椎动物，具有和人类相似的器官和组织。
4、体外受精、体外发育，胚胎培养条件简单。
5、胚胎透明，可以在活体上直接观察器官的发育。
6、发育周期短，在28.5℃温度下培养，受精后24小时即可以形成个体的基本结构。
因此，斑马鱼现在选择作为发育生物学研究的模式动物。
三、实验器材和材料斑马鱼养殖系统，大塑料盆（直径约58cm）两个，塑料筛框（直径约36cm）一个，中号塑料盆（直径约36cm）1个，加热棒，加气泵，12cm培养皿若干，9cm培养皿若干，数个胶头滴管。
曝气水10L。
性成熟雌、雄性斑马鱼。
四、实验内容和程序实验前一天的准备：1、在实验前一天的早上向2个大塑料盆中放大半盆干净的自来水，放入气泵和加热棒，将加热棒温度调整至28℃（每个加热棒都有差异，需要放入温度计，根据温度计指示的实际温度调节和校准温度计），以供斑马鱼催产繁殖时使用。
2、曝气水将干净的自来水烧开后冷却，将气泵放入其中进行曝气，以为培养胚胎之用。
3、斑马鱼的选取和催产雌雄鱼的鉴别：性成熟的雄鱼体型修长，腹部较小，而雌鱼腹部较大。
选鱼的时间在实验前一天的晚上，在选取斑马鱼之前需要喂食红虫，喂食后1小时才开始选鱼。
斑马鱼动物模型的应用介绍
斑马鱼动物模型的应用斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。
斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。
可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。
斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。
雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。
胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。
受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。
一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。
目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。
AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。
Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。
WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。
此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。
这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。
二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。
ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。
射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。
斑马鱼原位杂交实验方案
斑马鱼全胚胎原位杂交技术Form Dr. Kevin第一节原位杂交技术的历史Joseph G. Gall被誉为现代细胞生物学的一位奠基人，他在染色体结构和功能领域作出了杰出贡献，并发明了原位杂交技术（in situ hybridization，ISH）。
自Gall同他的研究生Mary Lou Paudue和Susan Gerbi在1969年利用放射性标记DNA在爪蟾组织切片中检测基因表达后，原位杂交技术逐渐发展为一种能使研究人员在一个染色体上定位并确定出基因和特殊的DNA序列的强大方法，推动了分子生物学的巨大进步。
Kathleen H. Cox于1984年发明了用单链RNA探针进行原位杂交的技术。
ISH技术在斑马鱼中的应用始于Westerfield等利用该技术在斑马鱼切片中检测基因的表达。
同年, Nusslein-Volhard 等将Cox 建立的RNA 原位杂交技术进行了改进, 用地高辛（digoxin）标记的RNA 在斑马鱼胚胎中检测基因表达。
2008 年, Bernard Thisse 等将该技术进一步优化, 使之更敏感, 也提高了基因表达检测的分辨率，我们在这里介绍的整胚原位杂交技术主要参照Thisse实验室2008年版本（Thisse, C. and Thisse, B., 2008, High resolution in situ hybridization on whole-mount zebrafish embryo. Nat. protoc. 3 : 59 –69）。
第二节原位杂交技术的原理原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
斑马鱼的原位杂交技术
斑马鱼的原位杂交技术整理人邵明:将特定时期的斑马鱼胚胎在多聚甲醛中C4%4o固定过夜第一天：、洗1PBST2x5min、剥膜2、洗3PBST5min可选步骤蛋白酶处理前的胚胎不处理(: K: 24hpf, 24hpf-的胚胎蛋白酶处理分钟以后的胚胎处理半小时48hpf10ug/ml K15, 48hpf,然后洗PBST3x5min)、C5min4hyb- 65o孵育、C4h（可选步骤: 可将胚胎置于hyb+中-20oC长期储存）5hyb+ 65o孵育、加探针(探针孵育置于冰上65oC10min, 5min, 655oC-孵育过夜65oC先将然后使用).第二天：、回收探针, I2x30min1（探针可以重复使用10次以上）洗液孵育探针的温度、洗液孵育探针的温度2II 1x15min、洗液孵育探针的温度3III 2x30min、室温4MABT 3x5min、封闭液孵育室温5 4h、AP, 4oC (-20oC, 61:2500 Anti DIG-稀释于封闭液中孵育过夜稀释好的抗体保存于可重复使用3次以上。
)第三天、回收抗体1、2MABT 2x30min3、PBST 2x30min、平衡缓冲液左旋咪唑4+0.5mg/ml （60mg/ml左旋咪唑储液稀释120倍）孵育10min、显色液中孵育直到信号足够强为止。
5试剂配方固定液: 4% 多聚甲醛（paraformaldehyde）in 1XPBSWeigh 2 g PFA and dissolve it in 50 ml 1XPBS. (PFA is hard to dissolve.) Incubate the mixture at 65oC for around 2 hours. Shake the mixture during the incubation). After dissolved, the solution is stored at 4oC.10XPBS stock solution: mix 76 g NaCl, 9.9 g Na2HPO4, 3.6g NaH2PO4. Dissolve them in less than 1 liter nanopure water, adjust to pH7.0 and a final volume of 1 liter. Autoclave for 35 minutes to sterilize.130 mM NaCl = 10 X 0.13 X 58.44=76 g NaCl7 mM Na2HPO4 = 10 X 0.007 X 142 = 9.9 g Na2HPO43 mM NaH2PO4 = 10 X 0.003 X 120 = 3.6 g NaH2PO4Paraformaldehyde (PFA) (Mallinckrodt 2621).（注意所用的试剂有没有结晶水）Proteinase K (Sigma P-2308); Stock solution (10 mg/ml = 10 ug/ul): weigh 10 mg proteinase K and dissolve in 1 ml nanopure water. Aliquot 50 ul each and store at -20oC. Thaw at room temperature before usage. Long storage may appear to see white precipitate after thawing. V ortex the tube and make sure the precipitate be mixed evenly.20XSSCFor 1 liter: 1 X 3 mol = 3 X 58.44 =175.3 g NaCl1X 0.3 mol = 0.3 X 294.1 = 88.2 g Na3.Citrate.2H20adjust pH=7 using HCl. autoclave 35 minutes for sterilizeization.（注意所用的试剂有没有结晶水）Yeast RNA: dissolve 50 mg RNA in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oC肝素（Heparin） (Sigma H3393): dissolve 50 mg heparin in 1 ml nanopure water (50 mg/ml); store at -20oCMAB X 2 liters pH7.5100 mM Maleic acid (Sigma M-0375) = 23.2 g (2 X 0.1 X116.1)150 mM NaCl = 17.5g (2 X 0.15 X 58.44)add solid (? g) to adjust pH=7.5, autoclave for 35 minutes to sterlize.Blocking regent (1096 176, Boehringer Mannheim, now Roche?). 10% stock solution. Weigh 10 g blocking regent and dissolve it in 100 ml MAB, shaking and heating in a microwave oven for 1 minutes (?), autoclave for 25 minutes and then aliquot into 14 ml and store at -20oC.50mg/ml 酵母RNA：称取2g酵母RNA干粉（生工），加入40ml去离子水，超声振荡溶解，-20oC保存。
斑马鱼胚胎发育过程中的基因调控机制研究
斑马鱼胚胎发育过程中的基因调控机制研究斑马鱼是一种高度透明、易于研究的水生生物，因此成为了研究生物学的理想模型。
在斑马鱼的胚胎发育过程中，基因调控机制扮演着关键的角色，控制着发育的每个阶段。
本文将介绍斑马鱼胚胎发育过程中的基因调控机制的研究现状和研究进展。
一、基因调控网络的建立要研究斑马鱼胚胎发育过程的基因调控网络，首先需要识别和鉴定参与发育调控的关键基因。
通过全基因组筛选和高通量测序技术，科研人员可以在斑马鱼中鉴定出数千个关键基因并建立基因调控网络。
实例研究：一项研究使用了大规模chIP（染色质免疫共沉淀）测序技术，在斑马鱼胚胎中鉴定了数千个与基因转录调控相关的转录因子和DNA结合蛋白基因。
这项研究为构建斑马鱼基因调控网络提供了基础数据。
二、基因表达调控机制的研究与其他多细胞生物一样，斑马鱼的基因表达调控机制包括转录后修饰、microRNA调控等多种方式。
这些调控机制之间相互交织、紧密联系，共同控制着斑马鱼胚胎发育过程。
实例研究：基因表达调控机制的研究需要集成多种技术手段，如RNA测序、原位杂交、Western blot等。
一项研究通过整合这些技术手段，发现成纱突即成胆突转化过程中，转录因子sox32通过调控mir-21基因的表达，促进了细胞转化的过程。
三、非编码RNA调控机制的研究非编码RNA（non-coding RNA）是指不具有编码蛋白的RNA分子，包括有机体内丰富的microRNA、small interfering RNA等。
在斑马鱼胚胎发育过程中，非编码RNA发挥着重要的调控作用，参与调控基因表达、细胞分化等过程。
实例研究：研究人员使用转录组测序技术，发现在斑马鱼的转变腹盘（metamorphic olfactory placode）转化过程中，miR-130b的表达量显著上调。
miR-130b通过抑制蛋白质转录调节因子Dlx3b的表达，从而协调着细胞转化过程。
四、基因表达时序调控机制的研究在斑马鱼胚胎发育过程中，基因表达的时序也是关键的。
斑马鱼胚胎整体原位杂交_6.22
斑马鱼胚胎整体原位杂交(Whole-mount in situ hybridizations in zebrafish embryos)北京大学遗传与发育生物学实验室整理者：肖安版本：V6.22 Build 2006-8-17说明：小号宋体文字为操作提示，其中下划线标记者为以下数步均需注意的内容；小号楷体文字为影响结果的重要步骤提示，注意控制记录其操作处理的条件和时间，以在重复实验探索最适条件时进行适当调整。
在整个实验中应当注意：(1) 由于环境中存在大量RNA酶，RNA在常温下极易降解。
因此，涉及RNA的操作，在探针去除之前，以及探针的合成与纯化过程，必须严格防止污染。
操作需要要戴乳胶手套进行，使用专用枪头、离心管、电泳槽等，尽量缩短RNA 在常温或37℃放置时间，电泳使用高电压短时间的程序，每次必须更换新电泳液。
实验间隙中RNA放置在-20℃，过夜或更长时间保存在-80℃。
(2)如同时对多管进行吸去溶液和加入溶液工作，应当按照同样的顺序依次操作，以保证其处理时间基本一致。
避免漏加溶液。
(3)注意所加溶液与胚胎温度的差异，应当先预热再使用。
一般溶液加入量为1mL左右，管平放以使胚胎分散与溶液充分接触，但探针杂交一步溶液过少可竖直放置。
(4)吸取胚胎的枪头应剪去尖端以扩大开口。
吸时动作要轻。
任何时候都要防止丢失胚胎，可在换前一管溶液时将后一管竖直放置让胚胎沉降一会以免吸走。
(5)注意保护标签，并且易混淆标签必须设法分辨(如6和9)。
第一天以下操作需戴乳胶手套。
1 水溶液体系重新处理 (Rehydration)。
1.1吸去恢复到室温的胚胎中的甲醇(MeOH)，用70%, 50%, 30%的 MeOH的PBST溶液依次处理5分钟。
梯度稀释的目的是防止胚胎收缩，可适当多添加几个浓度梯度。
稀释时间宁长勿短。
特别注意保护标签，MeOH为有机溶剂，易腐蚀油性笔书写的标签。
1.2 PBST处理5分钟，两次。
2 蛋白酶消化和随后的固定(Proteinase digestion and post fixation)。
模式动物斑马鱼
模式动物斑马鱼斑马鱼（Danio rerio）属于辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤科（Cyprinidae）短担尼鱼属（Danio）的一种硬骨鱼，原产于南亚，是一种常见的热带观赏鱼，因其体侧具有斑马一样暗蓝与银色相间的纹条而得名。
斑马鱼个体小，易于饲养，成体长4-5cm，雄鱼体修长，雌鱼体肥大。
可在有限空间里养殖相当大的群体，可满足样本需求量大的研究。
斑马鱼发育迅速，在28.5℃培养条件下受精后约40min完成第一次有丝分裂，之后大约每隔15min分裂一次，24h后主要器官原基形成，相当于28d的人类胚胎，幼鱼孵出后约3个月达到性成熟。
雌雄鱼通过调控光周期控制14:10（光照:黑暗）产卵时间，成熟鱼每周可产卵一次，一尾雌鱼每次可产卵100-300枚。
胚胎体外受精，体外发育，胚体透明，易于观察。
受精卵直径约1mm，易于进行显微注射和细胞移植等操作。
一、斑马鱼的品系经过30多年的研究应用和系统发展，已有约20个斑马鱼品系，斑马鱼基因数据库-ZFIN （http://zfin/org）里有相关的资料可供查询和下载。
目前研究中常用的斑马鱼野生型品系主要为AB 品系、Tuebingen（Tu）品系、WIK 品系，斑马鱼基因组计划所用品系是Tu。
AB 品系是实验室常用的斑马鱼品系，由单倍体细胞经早期加压法获得。
Tu品系斑马鱼具有胚胎致死突变基因，用于基因组测序前敲除该致死突变基因。
WIK品系较Tu品系具有更多的形态多样性。
此外，还保存有3000多个突变品系和100多个转基因品系。
这些品系资源对于利用斑马鱼开展各种科学研究起着很大的推动作用。
二、斑马鱼突变品系的筛选斑马鱼突变的方法主要有三种：已基亚硝脲（ENU）化学诱导、γ或χ射线照射和插入诱变。
ENU是一种DNA烃基化试剂，在生殖细胞减数分裂前诱导碱基对的替换，诱导产生的突变率为0.1%-0.2%，涉及单个基因的突变。
射线照射导致染色体大片段的缺失或染色体重排，产生突变率达1%。
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公司产品；
１ 显微注射用针，由Ｄｕｍｎ 公司 １ 毛细玻璃管拉制而成； ３ ． ｒｍｏｄ ０ 川
１． ４拉针仪 （ＥＡ Ｐ ） ＨＫ Ｐ ５ ，日本 ＨＫ 公 司产 品； Ｉ ＥＡ １． ５荧光解剖镜 （Ｘ－２ ，日本 ＯＹＰＳ ＳＺ １） ＬＭＵ 公司产 品； １． ６数码相机 （９５ ， 本 ＮＫＮ Ｅ９ ） Ｆ Ｉ ＩＯ 公司产品 ； 主要试剂、试剂盒 、酶 、载体和菌株
１ ．各种限制性内 切酶、 ４ＤＡ Ｔ－Ｎ 连接酶、 ｌ ｏ 片段均为Ｎｗ ｇａｄ ｌｂ 公司 Ｋｅ ｗ ｎ ｅ Ｅ ｌｎ Ｂｏａｓ ｎ ｉ
产 品；
２ ＰＲ 应试剂， ． 反 Ｃ 包括： ａ 酶、 应缓冲液、 ＮＰ Ｔｑ 反 ｄＴ 等均购 自 上海申 能博 彩生物公司： ３ 位杂交试剂：Ｓ６ ．原 Ｐ ＲＡ聚合 （ ５ 反应缓冲液和 ｌ ｍ Ｄ Ｎ 酶含 ｘ ０ Ｍ ０ Ｔ Ｔ溶液） Ｔ Ｒ 、 ７ Ｎ Ａ
Ｓ Ａ Ｔ ｇｎｃ ｏｄ 部分序列 ５ Ａ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｔ３ Ｍ Ｒ Ｏｉ ｕｌｔｅ ｌｏ ｅ ｉ ＇ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ ＴＴ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ －’ － 作为５ ＇ 端
Ｐ Ｒ引物 ，进行 Ｐ Ｒ扩增 ｃ Ｎ Ｃ Ｃ Ｄ Ａ． Ｐ Ｒ反应 体系： Ｃ Ｆｒ－ｔｎ ｃ Ａ ｄ Ｎ ｉｔ ｒ ｓ Ｓａ Ｄ １１ ４ １Ｘ Ｒ ｅ ｂｆ ｒ ０ Ｃ ｕ Ｐ ５１ ４ ５ Ｘ Ｔ Ｍｉ Ｐ ｘ ０ Ｎ ｄ １１ ４
斑马鱼平滑肌特异性基 因 Ｓ ２ 的克隆 、表达和功能研究 Ｍ２ ａ
Ｌｎ，９７０ ｏｇ １９） Ｐ Ｒ产物克隆到 Ｔ ｅａ ｖ ｃｏ Ｃ － ｓｙ ｔｒ上，通过连接 、转化 、小量抽提 、限制性 内切酶 ｅ 酶切、电泳 鉴定出正确克 隆，具体步骤参考 《 子克 隆实验 指南 （ 分 第三版 ） ，并通 过测序 验证 其正确性 。大量抽提 Ｇ Ｔ －ｃ Ｎ Ｔ质粒 ，分 别采 用 限制性 内切 酶 Ｓｌ ＡＡ １ Ａ－ Ｄ ａ ｌ
到吸附 柱上， 离心。再用５０ ＲＥ ０川 Ｐ洗一次。 ０ Ｂａｅ ｅ ５川 ｓ ｆｅ水洗脱， ｒ 测定浓度，
电泳 鉴定Ｒ Ａ质量，－０ 贮存。 Ｎ ７℃ ２ ｃＮ 合成 ． Ａ 及扩增： Ｄ 采用 Ｃｏｔｃ ｎｅｈ公司的方法，在反转录产生第一条链 的时候，加入 ＳＡＴ ｌ ＭＲ
Ｏｉｏｕｌｏ ｉｅ ｌｇｎｃｅｔｄ ，可以有效的保证产生的 ｃＮ 的 ５端序列 比较 完整 ，并且可以通过 ＤＡ ＇
１ ｎ Ｉ ４ 川
１０Ｍ Ｔ ０ｍ Ｄ Ｔ ２１ Ｐ
Ｒ ａｎ ｕｘ ０／ ） Ｎｓ （ ｌ ｉ ４ ｌ １ Ｐ ｌ Ｔ ＲＡ ７ 聚合酶 （ Ｕ ） Ｎ １ 小１ ５ １５Ｉ ． Ａ Ｒ ａ －ｅ ２ ＨＯ Ｎ ｓｆｅ ｅｒ 补足至２Ｐ ０１
ＣＧＧＧ－ ｏ ３＇
反 转录条 （０ 体系） 件 ２川 ：
总 ＲＡ Ｎ １ｇ ４ Ｓ Ｒ Ｏｉｏｕｌ ｔ ｅ ＭＡ Ｔ ｇ ｎｃ ｏｉ ｌ ｅ ｄ １１ ４ 棍匀后 ，７ ０ ２ ２ Ｃ 分钟 。在 冰上冷 却 ２ 分钟。再依次加入 ：
Ｐ 程序为：首先 ９０预变性 ｌｉ，然后 ９０ １ ｓｃ ６０ ６ ｎ ２ 个 Ｃ Ｒ ５ Ｃ ｍｎ ５ ５ ， Ｃ ｍ ，共 ０ Ｃ ｅ ８ ｉ
循环。 ３ Ｐ Ｒ扩增 Ｇ Ｔ－ ｃ Ｎ 片段 ： ． Ｃ Ａ Ａ １ Ａ Ｄ
采用 Ｑａ ｎ ｏｇ 计用于 ｉ Ｌｎ 设 ｉｍ ｇ ｏ 检测 Ｇ Ｔ－ｃＮ ＡＡ１ Ａ的引物进行 Ｐ Ｒ克隆，引物 Ｄ Ｃ 序 列如下， 上游引 ５Ａ Ｇ Ｃ Ｔ Ｔ Ｔ Ａ Ｔ 下游引 ５Ｇ Ｔ Ｔ 物： ＇ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ａ Ｃ Ｇ ３ － Ａ Ｔ Ｃ Ｃ Ａ Ｃ ＇ ， 物： ＇ Ｃ Ｇ － Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｃ Ｔ Ｔ ＇ 采用前面获得的斑马鱼 ｃＮ Ｃ Ａ Ｔ 分钟后， ４ ９℃变性 ３ｓ ６℃退火 ３ｓ７℃延伸 ４ｓ 循环 ３ 轮（ｉ ｍｎ ０， ０ ０， ２ ５， ０ Ｑａ ｉ ｏ ｇ
色素抑制 剂苯脉 胺 ＮＰｅｙｔ ｉｕｅ （Ｔ） 肝素 、酵母 ｔＮ ，蛋白酶 Ｋ －ｈｎｌ ｏｒａ Ｕ 、 ｈ Ｐ ＲＡ ，马来酸 、
斑 马鱼平 滑肌 特异性基因 Ｓ ２。 的克隆、表达和功能研究 Ｍ２
小羊血清、ＤＰ 、左 旋咪畔、多聚 甲醛 、甲酞胺购 自ｓ ｇａ 司： ＥＣ ｉｍ 公 、 ４ ．浪化乙锭 （Ｂ Ｅ ）为 Ｆ ｌａ Ｃ 公司产 品； ｕｋ Ａ Ｈ Ｇ ５ ．酚、氯仿 、异戊醇等 各类有机和 ＮＣ 等无机试剂均 为上 海试剂厂 产品； ａｌ
００ Ｍ ．２ ＤＴＴ
Ｐｗ ｒｃｉ Ｒ ｖｒ Ｔａｓｒ ｔ ｅ ｏ ｅ ｒ ｔ ｅｓ ｒ ｃｉａ Ｓ ｐ ｅ ｅ ｎ ｐ ｓ
ＨＯ ２
补足至 ２川 ０
４＇ １。置于冰上终止 反应 。 ２ Ｃ ｈ ｃＮ Ａ扩增 ：以上面获得 的 ｃＮ Ｄ ＤＡ为模板 ，反转 录引物 ＣＳ Ｄ 作为 ３端 ＰＲ ’ Ｃ 引物，取
５Ｐ Ｒ ｒ ｒ ｅ ＇ ． Ｃ ｉ ｐｍ １１ ４
３Ｐ Ｒ ｍ ｒ ｉ ｅ ＇ ｐ Ｃ ｒ １１ ４ ５ Ｘ ｌ ａ Ｍｉ ｒ ｅ ｘ ０ ｏ ｍｅ ｓ Ｐｙ １１ ４ Ｈ Ｏ ２ ４４ ０１
斑 马鱼平滑肌特异性基 因 Ｓ ２ 的克隆、表达和功能研究 Ｍ２ 。
材料和方法
主要仪 器和 设备 １ ．冷冻 台式离 心机 （８０ ， ０Ｒ ，德 国 Ｅｐ ｎｏｆ ５１Ｒ ５ ４ ） ８ ｐ ｅｄｒ 公司产 品；
２ 式离心 （ｅｔｉｕｅ １ ， ｉ ｉ） ．台 机 ｃｎｒｆｇ ５ ５ ｍｎｓ ｎ，德国Ｅｐｎｏｆ ４Ｄ ｉ ｐ ｐｅｄｒ 公司产品；
１． 粒转化受体菌 Ｍ ｏ ６质 ｔ 实验室提供 。 由本 实验材料
Ａ 系斑马鱼（ａｉｒ ｉ ，由 Ｂ品 Ｄ ｎ ｅｏ ｏ ） 清华大学生物技术系孟安明教授惠赠， ｒ 本实 验室繁殖
培 育。
方法
１ ．斑马 鱼胚胎组织 Ｒ Ａ抽提 （ Ｎ 具体步骤参考 ＱＡＥ 公司 Ｉ Ｎ 组织 ＲＡ Ｇ Ｎ 抽提试剂盒使用
因为 Ｓｃ 酶切后 的产物 有 ３突 出端 ， Ｉ ａＩ ＇ 如果直接转录会将载体序 列一并转录出来，
１． 测序工作送 交上海博亚生物工程公司完成 ： ２ＤＡ Ｎ
１． ＭＴ ａ ｖｃｏ 购 自Ｐｏｅａ ３ｐ Ｅ － ｅ ｙ ｔｒ Ｇ ｓ ｅ ｒｍｇ 公司， 用于克隆 ＰＲ Ｃ 片段；
１． ＧＰＣ质粒为Ｃｏｔｃ公司产品，由 ４ ＥＦ－ｌ ｐ ｌｎｅｈ 本室扩增保存；
１ ｐＡ －－ ２ ５ ＧＴ １ Ｍ 质粒由 ． Ａ Ｇ 清华大学生物技术系孟安明 教授惠赠；
６ ．大量质粒抽提试剂 盒：Ｑａｅ Ｍｘ－ｒｐ ｔ ｉｇｎ ｉ ｅ Ｋ ； ａ Ｐ ｉ
７ ＲＡ ． 抽提试剂盒 为华舜公司产 品： Ｎ
８ ．反转录试剂盒购 自Ｃｏｔｃ 公司； ｌｎｅｈ
９ ＲＡ ． 纯化试剂盒购 自Ｑ ａｅ 公司 ； Ｎ ｉｇｎ
１． 产物及胶回收试剂盒： ｏｈ 公司 ０ＰＲ Ｃ Ｒｃｅ 产品； １． 引 １ Ｃ 物使用相关软件 ０ｉ ０自 ＰＲ １ ． 行设计，由 ｇ６ ｏ 赛百盛公司合成；
ｌ Ｏ ｍＭ ａ ｈ ｅｃ ｄ ＮＴＰ
反 转录引 ＣＳ 物 Ｄ １ 州
１１ ｐ ２１ ４ １１ ４ ｌ１ ４
５ ｉ ｔ ｔ ｎ ｂ ｆ ｒ Ｘ ｒ － ｒ ｄ ｅ Ｆ ｓＳ ａ ｕ
说明） ：
收 －２ｈｆ 集发 育到６ ７ｐ 的斑马鱼胚胎约 ４０ ０ 枚，用 链蛋白 （ｍ／ｌ 酶 ２ｇｍ）去除 外膜， 置于 液氮中 研磨，加 ６０ｌ 液，再 ０ｐ ＲＴ Ｌ 加入ＲａｅＦｅ Ｄａｅ ７匀后， ５１ Ｎｓ ｒｅ ｓ， － Ｎ Ｍ ， 用 ｍ 注射 器抽打数次，离心。取上清加 ３０ ９％ 醇， ０川 ５乙 混匀后上柱，离心。 ５０ ＲＥ 加 ０川 Ｐ 液
ＰＲ Ｃ 的方法进行扩增 ｃＮ。 １ Ｒ 作为模板反转录产生第一链 ｃＮ。 ＤＡ 取 Ｄ 总 Ｎ ｇ Ａ ＤＡ 反转录引
斑 马鱼平滑肌特异性基因 Ｓ ２ 的克隆、表达和功能研究 Ｍ２ 。
物 ＣＳ 序 列 为 ５－Ｔ Ｃ Ａ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｔ － （） －＇ ＭＲ Ｄ ＇ Ｔ Ｔ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ｇｄ ３３ ， ＡＴ Ａ Ｔ ｏ Ｓ Ｏ ｉｏｕ ｌｏ ｉｅ ｌｇｎｃｅｔ ｄ 的序列 为 ５－ Ａ Ｃ Ｇ Ｇ Ｔ Ｔ Ａ Ｃ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ｃ Ｇ ＇ Ｇ Ａ Ｔ Ｇ Ａ Ｃ Ａ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ｇ Ｃ ＴＡ Ｇ Ｃ Ａ
和Ｓ Ｉ ａＩ ｃ 酶切过夜， 酶切产物通过胶回 收试剂 盒回收， 调整终浓度为 ｌ ／ ， 转录 ｕ ｗ 作为 ｇｌ
原位杂交探 针的模板 。 ４ 体外转录 Ｇ Ｔ － 探针 ： ． ＡＡ １
反义 探针反应体系如下 （ 闪体系） ２ ０ ： 模板 （ＡＡ１ Ａ Ｓ ｌ Ｔ－ｃ Ｎ 一／ ｌ Ｇ Ｄ ａ 酶切产物） ５ 反应缓冲液 Ｘ
聚合酶 （ ５ 反应缓冲液和 ｌ０Ｍ Ｔ 含 ｘ ０ｍ Ｄ 溶液 ） ３ Ａ聚合 酶 （ ５ Ｔ 、Ｔ Ｒ Ｎ 含 ｘ反应缓冲 液和 ０ｍ Ｄ 溶液 ） ＲＡ酶抑制 剂 （ ａｉ） Ｒ ＲａｅＦ ｅ Ｄａｅ（ １０Ｍ Ｔ Ｔ 、 Ｎ Ｂ ｓｎ， Ｎｓ－ ｒｅ ｓ 含反应 Ｑ Ｎ
缓冲液及终止缓冲液） 等均购自Ｐｏｅａ ｒｍｇ 公司； 地高辛标记的核糖核昔酸混合物 （Ｉ ＲＡ ｅｉｇ ） ＤＧ Ｎ ｌ ｌｎ ｍｘ、封ｈ － ａ ｂ ｉ 〕 试剂 （ｌｃｉｇ ｂｏｋｎ ｒｇａｔ， ｎ） ｅｅ 祸连碱性磷酸酶的抗地高辛抗体（ｎｉｄｇｘｇｎｎＡ Ｆｂ ｇｅｔ） Ａｔ－ｉ ｉｅｉ－Ｐ ｆａｍｎｓ， ｏ ａ ｒ 显色试剂 （Ｍ ｐｅ ｓｂｔａｅ 购 自Ｒｃ。 Ｂ ｐ ｌ Ａ ｕｓｒｔ） ｕ ｒ Ｐ ｏｈ 公司；
３ ＰＲ ． 扩增 仪 （２３ ） Ｃ ２３１ ，德 国 Ｅｐｎｏ ｆ ｐｅｄｒ 公司产 品； ４ ．电泳仪和 电泳 槽，上海辉煌科学 仪器 公司；
５ 凝胶成像系统，上海复日 ． 公司产品；