酿酒酵母不对称遗传分析(设计)
酵母遗传和细胞生物学
酵母遗传和细胞生物学酵母是一种单细胞真核生物，由于体积小、生命周期短、基因组相对简单且遗传工具成熟，因此成为了生物科学研究的一个热门对象。
在酿酒中功不可没的酵母菌，也是许多生物学家和遗传学家的长期研究对象之一。
在遗传学上，酵母菌是一个非常有用的模式生物，因为它们具有相对短的生命周期、容易进行突变和遗传实验、能够进行高通量遗传屏幕和分析，而这些都是其他生物难以比拟的。
在酵母的遗传研究中，有两个主要的遗传策略：自然遗传和基因改造遗传。
自然遗传是通过对酵母自然发生的遗传变异的分析来了解遗传信息的特性。
基因改造遗传是通过让酵母在实验室中发生人工干涉的基因改变，来了解特定基因和遗传信息对于细胞功能和生物学行为的影响。
酵母的遗传是以细胞为基础的。
每个酵母细胞都有核和质体，核内包含一套基因组，是核酸遗传信息的存储和传递中心。
在核内，基因信息呈线性排列，所以一个线性染色体的完整拷贝含有全套的基因。
酵母菌有16条染色体，其中仅有数百到上万个基因，因此酵母基因间距相对较大。
质体则负责维持酵母细胞结构和代谢，以及进行细胞分裂、生长等功能。
酵母的生殖方式是丝状菌的两性配子体，即两个细胞体融合形成的新细胞，它具有不同的细胞型态和大小，以及不同的染色体组成。
在配子体形成时，基因组重组和重分配会导致分生孢子具有不同的染色体和基因组组合，这是酵母遗传多样性的主要来源。
遗传实验中，我们可以通过敲除基因或者引入新的基因来分析不同基因的功能和相互作用。
如同人类基因组计划，酵母菌基因组也被分离和定序，因此我们可以利用基础遗传学方法以及高通量技术来对特定的基因进行研究。
敲除与添加基因只是遗传工具箱中的一部分，“诱发突变”也是遗传实验的一个常用策略。
实验者用不同的化合物或者条件诱发细胞突变，然后筛选出具有目标特性的突变体，这也是了解基因功能和相互作用的有效手段。
酵母的遗传观察需要进行细胞生物学的化验。
我们用细胞显微镜来观察酵母细胞内部结构以及细胞行为。
酿酒酵母的遗传学和分子生物学
酿酒酵母的遗传学和分子生物学酿酒酵母，即啤酒酵母，是一种用于酿制啤酒、葡萄酒、烈酒等酒类的微生物。
其细胞大小约为 5-10 微米，单细胞体积大约是压缩奶油的十倍。
在酒类的制作过程中，酿酒酵母会通过发酵将糖类转化成酒精，还能产生引人入胜的风味和气味。
因此，酿酒酵母是和酿造工艺一样重要的组成部分，对于制作高品质的酒类有着至关重要的作用。
酿酒酵母的遗传学和分子生物学是研究酵母发育、代谢、遗传变异等方面的学科。
在这个领域的研究者们潜心探索着酿酒酵母的生物学机制，以更好地了解酿酒酵母的种类和特征，并进一步改良酵母，提升其性能，以生产更加出色的葡萄酒、啤酒及其他酒精饮品。
酿酒酵母的基因组酿酒酵母的基因组大小为 12 Mb，共有 16 条染色体。
在 1980年代初期，基因测序技术得到急速的发展，使得研究者们可以通过快速、高效的方式获得酿酒酵母的整个基因组序列信息。
自此，遗传学和分子生物学领域的研究在酿酒酵母上得到了广泛开展。
酿酒酵母分子遗传酿酒酵母不同于动植物，其细胞有两种状态：有性和无性。
酿酒酵母有两个性别，分别为雄性和雌性，它的有性生殖主要通过雌雄交配进行，其无性繁殖则通过分裂方式实现。
酿酒酵母的基因体系也与其它真菌不同，首先，虽然酿酒酵母的基因数并不多，但其负责基因转录的RNA聚合酶数量却有之多。
其次，酿酒酵母基因编码中90%以上的编码区宁静3个核苷酸呈现出非常强的保守性，这就意味着不同的进化压力会引起基因启动子、基因间区域以及非编码RNA区域的巨大差异。
鉴于此，基因调控和基因结构研究成为分子遗传学的重要部分。
酿酒酵母基因的复制和表达DNA复制及细胞周期相关基因是其中一个研究的方向。
酿酒酵母基于调节因子的复制信号，在复制起始点启动复制，然后发生双链断裂，而后在起始点就地造成新的复制部分，在复制起始点分裂后继续对整个基因组进行复制。
酿酒酵母还可以调节经典试验中典型的细胞周期。
非常引人注目的是，细胞周期的控制区域Cdc28本身是一种酵母菌蛋白激酶，调节G1期到S期进程中需要大量的因子。
葡萄酒酿造中酿酒酵母的遗传改良研究及应用前景
葡萄酒酿造中酿酒酵母的遗传改良研究及应用前景葡萄酒是一种著名的发酵酒，其酿造过程中，酿酒酵母起到了至关重要的作用。
酿酒酵母可以发酵葡萄中的糖类，转化成酒精和二氧化碳。
在葡萄酒酿造的过程中，酿酒酵母的遗传改良已经成为了一个研究热点。
一、酿酒酵母的遗传改良：背景和意义酵母是一种单细胞真菌，生长快、繁殖易、代谢活跃，因此广泛应用于食品和药品工业。
酿酒酵母作为一种特殊的酵母，是葡萄酒酿造的主要微生物。
虽然酿酒酵母已经被广泛使用了几百年，但是其基因组和代谢途径的深入研究直到本世纪初才展开。
利用基因工程技术可以改变酵母的基因组和代谢途径，进而改善其酿酒性能。
酿酒酵母的遗传改良有以下几个意义：1. 提高酵母的酿酒效率。
通过遗传技术改变酵母的代谢通路，可以提高其在发酵过程中产生酒精的速度和效率，缩短酿造时间。
2. 提高酒的品质。
通过遗传技术改变酵母的代谢通路，可以提高其产生酒精和香味物质的效率，进而改善酒的品质。
3. 减少酒的生产成本。
通过遗传技术改变酵母的代谢通路，可以使酵母在酿造过程中更加耐受高温、低温和低pH等环境，减少生产成本。
二、酿酒酵母的遗传改良实践1. 酒精代谢通路的改良酒精代谢通路是酿酒酵母的重要代谢通路，主要包括糖的分解、乙醇发酵和产氧呼吸等环节。
在酿造葡萄酒的过程中，酿酒酵母会在糖的分解过程中产生二氧化碳和酒精。
传统上，酵母在发酵初期会优先进行糖的分解，以此产生能量和生长物质。
然而，这种代谢方式会降低酒精的产量。
为了提高酒精的产量，研究人员通过改变酵母糖的分解途径，使其能够更快地产生酒精。
2. 香味物质产生通路的改良除了酒精之外，还有很多香味物质对葡萄酒的口感和品质起着至关重要的作用。
研究人员通过遗传改良酿酒酵母的香味物质产生通路，使其更高效地产生这些物质。
例如，研究人员通过遗传改良Hexose transporter基因，使酵母能够更快地转运糖类，进而提高香味物质的产生速度。
三、酿酒酵母的遗传改良应用前景随着生物技术的发展，酿酒酵母的遗传改良已经成为了一个研究热点。
酿酒研究报告
酿酒研究报告
酿酒研究报告
摘要:
本研究旨在对酿酒过程中涉及的微生物群落进行系统性的分析和研究,以了解酿酒过程中微生物的作用和变化规律。
通过对酿酒酵母、霉菌、细菌和古菌等微生物群落的分析,我们发现酿酒过程中存在着多种微生物,它们共同协作完成酿酒过程,并随着酿酒过程的进行而发生变化。
本研究还通过对酿酒酵母的遗传多样性的分析,我们发现酿酒酵母存在着多种不同的亚种,它们遗传多样性的变化规律也对酿酒过程有着重要的影响。
正文:
1. 酿酒过程的概述
酿酒是指利用酵母或其他微生物将粮食或其他原料转化为酒精和其他饮料的过程。
酿酒过程中涉及到多种微生物,包括酵母、霉菌、细菌和古菌等。
其中,酵母是最常见的微生物,它在酿酒过程中起着重要的作用。
酵母通过发酵过程中产生的酒精和其他代谢产物,控制着酿酒过程中的酒精浓度和发酵速率。
霉菌和细菌在酿酒过程中也发挥着重要的作用,它们可以分解酒精、产生氨基酸和其他代谢产物,同时还可以防止酒的变质。
古菌在酿酒过程中也起着重要的作用,它们可以控制酿酒过程中的微生物群落结构,并影响着酒精发酵和代谢产物的产生。
2. 酿酒酵母的群落结构及遗传多样性分析
2.1 酿酒酵母的群落结构
在酿酒过程中,酵母的群落结构会随着酿酒过程的进行而发生变化。
在刚刚开始的酿酒过程中,酵母的亚种数量较少,但随着酿酒过程的进行,酵母的亚种数
量逐渐增多,并且不同的酵母亚种之间也会逐渐发生变化。
此外,在酿酒过程中,酵母的遗传多样性也会发生变化。
酵母菌遗传多样性研究
酵母菌遗传多样性研究：探索酒精发酵的奥秘酿酒是人类文明历史的重要组成部分，而酵母菌则在酒精发酵过程中起到了重要的作用。
酵母菌在发酵过程中是以无性繁殖的方式进行的，通过遗传多样性研究，不仅可以深入了解酿酒的过程和机制，也可以为培育更加优良的酵母菌品种提供科学依据。
本文将从酵母菌遗传多样性的基础、研究方法、意义等方面进行探讨。
一、酵母菌遗传多样性的基础酵母菌是一类单细胞真菌，它们吸收有机物或者碳物质，进行发酵作用，产生酒精、二氧化碳等有用物质。
从基因组水平来看，酵母菌的核基因组呈现为一个二倍体状态，其次还存在一个质粒组分。
酵母菌的基因组大小一般为10-20Mb，在菌落的不同部位，其基因组序列也会发生不同。
尽管酵母菌的基因组存在一定的保守性，但是仍然具有较大的遗传多样性。
酵母菌主要以无性繁殖方式进行，这种繁殖方式称为分裂，能够保证其基因组的稳定性和完整性。
但是在环境、温度、压力等因素的影响下，酵母菌还会进行有性繁殖，这种繁殖方式会引发基因组的重组，进而导致酵母菌的遗传多样性进一步增加。
二、酵母菌遗传多样性的研究方法酵母菌的遗传多样性主要可以通过两种途径进行研究，一种是全基因组测序，另一种则是根据特定遗传标记位点进行基因型分析。
全基因组测序可以全面掌握酵母菌基因组序列的信息，这种方法可以在种属间、不同株系之间进行遗传多样性的比较。
较新的次代测序技术可以在较短时间内完成大规模的测序工作，且精度也得到了极大的提高。
目前，全基因组测序已经广泛应用于酵母菌在进化、毒理等领域的研究中。
基因型分析则是通过检测酵母菌的遗传标记分别检测个体之间的遗传差异，这种方法也是目前广泛应用于中的一种。
尽管这种方法的精度相对较低，但是其操作相对方便，数据量也较小，较容易处理，因此不失为一种有力的研究工具。
三、酵母菌遗传多样性对酿酒业的意义酵母菌的遗传多样性研究具有重要的理论和实践意义。
从理论上来说，探究酵母菌的遗传多样性可以揭示其进化、繁殖机制的奥秘，对生命科学领域的研究具有重要的参考意义。
酿酒酵母的分子遗传学
酿酒酵母的分子遗传学酿酒酵母是生物学中的一个非常重要的物种，它在人类的饮食文化中发挥着巨大的作用。
酿酒酵母可以将复杂的碳水化合物转化为酒精和二氧化碳，从而使得酒类饮料得以生产。
在近代化工生产中，酿酒酵母也是非常重要的微生物工厂，可以合成很多重要的化学品。
由于酿酒酵母具有这样的重要作用，在分子生物学研究中也受到了广泛的关注。
分子遗传学是研究遗传物质的分子结构和功能以及基因调控的科学。
在酿酒酵母研究中，分子遗传学是一门非常重要的学科。
它可以帮助我们深入了解酿酒酵母的基本生理功能、遗传调控机制以及遗传流行病学等方面的知识。
酿酒酵母的基因组研究当前，在遗传学研究领域中，最重要的任务之一是对酿酒酵母的基因组进行解析。
在2001年，人类和酵母基因组测序计划公布了酿酒酵母的全基因组序列。
这是第一个完全测序的真核生物基因组，也是为其他真核生物基因组的测定打下了非常坚实的基础。
通过对酿酒酵母基因组的解析，可以为我们进一步了解它的基因调控机制、细胞周期调控以及其它重要的生物学过程奠定基础。
酿酒酵母的重要基因酿酒酵母是一个单细胞真核生物，它的基因组包含了6000多个基因。
这些基因不仅控制着酿酒酵母的一些基本生物学功能，还影响到了和酿酒酵母有关的酒企业发展。
下面是介绍几个酿酒酵母的重要基因：1.糖化酵母酵素（AMG）糖化酵母酵素是酿酒酵母中重要的酶之一，负责将葡萄糖转化为乙醇、二氧化碳和一些副产物。
在英美等发达国家，由于发展了先进的从葡萄种植到酿酒的成熟生产技术，所以酿酒工业可以完成高效率的生产。
但是在我国的酿酒生产中，添加的AMG并不能达到最佳状态，所以酒精含量偏低，口感甜度比较高。
2.乙醇脱氢酶（ADH）酿酒酵母通过乙醇脱氢酶（ADH）将糖份转化为乙醇，最酿制出各种酒类。
不同类型的乙醇脱氢酶会影响到酿造的酒类口感、风味、气味甚至产量等，成为了酿酒酵母分子遗传学研究中非常重要的一部分内容。
3.细胞壁蛋白基因（CWP）酿酒酵母的细胞壁蛋白基因对于细胞壁建造和酿造工艺中的一些物理化学作用具有很重要的作用。
酵母实验-学生版
酵母实验-学⽣版酵母系列⼤实验设计PCR介导的酿酒酵母基因敲除1、实验⽬的学习理解酿酒酵母中PCR介导的基因⼀步敲除法的原理，掌握酵母的转化⽅法，了解酵母⽣长及遗传学特性。
2、实验原理酵母菌作为最简单的真核⽣物，能以单倍体和⼆倍体两种形式稳定存在，其中单倍体含有两种交配型，可以⾃由的在单倍体和⼆倍体之间进⾏转换，在⽣物学研究中有着得天独厚的优势。
⾸先酵母菌⽣长速度很快。
对数期⽣长的单倍体菌株在YPD（富营养天然培养基）90分钟分裂⼀代，在合成培养基中140分钟分裂⼀代。
其次，酵母的基因组很⼩，遗传背景相对简单，是⼀种很容易进⾏遗传操作的模式⽣物。
酿酒酵母的基因组只有12052 Kb,其基因组序列早在1996年测序完成,已有约6000个超过100个氨基酸的ORF被报道，只有不到5%的ORF含有内含⼦，其中有约5700个蛋⽩编码基因，分散在16条染⾊体上。
上世纪90年代末，由数个实验室联合进⾏的酿酒酵母基因组敲除项⽬的完成是酵母遗传学研究的⾥程碑事件。
在这个项⽬中，四个基因敲除菌株库被成功构建：两种交配型的单倍体菌株库、杂合⼦⼆倍体菌株库以及⾮必需基因的纯合⼦⼆倍体菌株库。
这个项⽬⼏乎完成了全部ORF的敲除，为⽣物学研究，特别是组学研究，提供了⼗分强⼤的系统性研究⼯具，为后续基因功能的研究奠定了坚实的基础。
此外，酵母作为真核⽣物，与⾼等⽣物在很多代谢通路和蛋⽩表达调节等⽅⾯是⾼度保守的，为⾼等⽣物相关基因，例如疾病基因，功能研究具有提供了简单、易于操作的系统。
⽬前，酿酒酵母已经具有⼀套⼗分灵活快速的遗传操作体系。
酵母允许外源质粒以独⽴复制⼦游离于基因组之外存在，也允许其整合到基因组中。
但跟其他⽣物相⽐，酵母⽐较独特且强⼤的特点是外源序列的整合依赖于同源重组机制。
之前提到的基因组敲除项⽬的完成就是依赖于⾼效率的同源重组，如图-1所⽰。
⼈们利⽤PCR的⽅法，在筛选标记基因两侧引⼊待敲除基因（YFG，your favorite gene）特异性序列；随后将PCR产物通过转化传递到酵母细胞内部；在同源重组的作⽤下，⼀些细胞的对应基因位点的内源性序列被含有同源臂的外源序列直接取代，并通过选择培养基筛选出来。
酿酒酵母菌基因分析报告
酿酒酵母菌基因分析报告引言：酿酒是一项源远流长的发酵工艺，酿酒酵母菌作为重要的微生物参与其中起到至关重要的作用。
随着现代分子生物学和基因工程技术的发展，我们可以通过对酿酒酵母菌基因进行分析，深入了解其中的机制和调控网络。
本文将对酿酒酵母菌基因进行分析，并探讨其在酿酒过程中的作用和潜力。
一、酿酒酵母菌基因组结构酿酒酵母菌的基因组由DNA分子构成，通过基因的编码和调控，控制酵母菌的生长、发育和代谢等重要生物过程。
酿酒酵母菌基因组包含了许多基因，其中包括编码各类酶的基因、编码调控因子的基因以及其他功能基因等。
通过对酿酒酵母菌基因组的测序和比对，我们可以了解基因组的大小、结构和功能。
二、酿酒酵母菌基因的编码和表达酿酒酵母菌基因的编码是指将DNA序列转录为RNA分子，再通过翻译作用转化为蛋白质分子的过程。
酿酒酵母菌基因的表达是指基因在不同生长阶段和环境条件下的活动程度。
通过对酿酒酵母菌基因的编码和表达进行分析，我们可以揭示基因的功能和调控机制。
三、酿酒酵母菌基因的功能和调控网络酿酒酵母菌基因承担着多种功能，其中包括酵母菌的生长、发育、代谢和应激等方面。
通过对酿酒酵母菌基因的功能分析，我们可以了解各个基因在酵母菌生理过程中的作用和相互关系。
另外，酿酒酵母菌基因的调控网络是指各类调控因子对基因表达的影响和调控。
通过对酿酒酵母菌基因的调控网络进行分析，我们可以揭示调控因子之间的相互关系和调控机制。
四、未来展望和应用价值酿酒酵母菌基因分析为我们深入了解酵母菌生理过程提供了重要的工具和方法。
未来我们可以通过基因工程技术对酿酒酵母菌基因进行改造，以生产出更符合市场需求的酿酒产品。
同时，对酿酒酵母菌基因的深入研究还可以帮助我们理解其他微生物的生理过程，为微生物工程和发酵工业的发展提供理论基础和技术支持。
结论：通过对酿酒酵母菌基因的分析，我们可以深入了解酿酒过程中的生理过程和调控网络。
基因分析为我们解决实际问题和推动酿酒工业的发展提供了新的思路和方法。
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酿酒酵母不对称遗传分析
生物科学10300700042 周博言周五下午108 注：这个实验设计我上传了百度文库，老师如果在百度发现和我这个一模一样的设计不要误会，那个就是我设计的，不是我抄袭。
原理
在酵母细胞出芽过程中，细胞衰老造成的损伤在母细胞和子细胞之间的分配是不对称的，绝大部分损伤被母细胞所保留。
然而，这种不对称遗传也不总是这样，在母细胞衰老到达一定程度时，它所产生的子细胞将不可避免地带有母细胞的部分衰老物质。
酿酒酵母很早就被当做研究衰老的模式生物，早在1989年，Egilmez和Jazwinski就提出了“细胞质衰老因子”假说。
1997年，Sinclair等人提出了酵母复制衰老的ERC积累学说，认为染色体外rDNA环——ERC可能就是“细胞质衰老因子”。
酿酒酵母rDNA座占整个基因组的10%，由编码rRNA的9.1kb重复单元串联重复100~200个拷贝组成，定位于染色体ⅩⅡ。
ERC可以通过胞内DNA加工系统的作用，由串联重复的rDNA经同源重组从基因组中切出。
而ERC具有自身ARS（autonomously replicating sequence），能在每一次S期复制1次，而在母细胞内呈指数型增长。
同时由于酵母细胞出芽分裂的不对称遗传，ERC在分裂时保留在母细胞中而不进入子细胞，从而使母细胞中大量积累ERCs。
但随着母细胞持续地衰老，这种不对称遗传将无法维持下去，最终极度衰老的母细胞产生的子细胞中也将不可避免地带有ERCs。
本实验将通过培养酿酒酵母，分离检测ERCs，对比不同代数母细胞产生的子细胞及衰老母细胞中ERCs的含量，验证酿酒酵母的不对称遗传。
注：
关于ERCs的不对称遗传的机制，Shcheprova等人提出了一种氯苄乙胺依赖的细胞核扩散屏障，它阻碍了母细胞核孔通向子细胞的通道。
而环形DNA分子，比如ERCs，缺乏一种着丝粒序列而无法通过该屏障，最终被留在了母细胞中。
尽管ERCs如何造成酵母细胞衰老的机制尚未明确，但很多假说已被提出。
一种猜测是，ERCs会与那些在复制、转录过程中起重要作用的因子发生物理上的相互作用，从而使它们无法行使正常的功能。
另一种可能性是，过多的ERCs导致了rRNA和核糖体蛋白之间数量的不平衡，进一步削弱了核糖体其本身的功能。
而Ganley等人的研究则认为，ERCs通过诱导rDNA使其不稳定性限制了酵母细胞的RLS（复制型寿命），并且，他们认为这正是衰老的最根本的原因。
材料
酿酒酵母细胞
培养基1（单位均为g）：葡萄糖25、酵母浸粉2、（NH4）2SO42、KH2PO45、MgSO4•7H2O0.4、CaCl20.2、1000ml蒸馏水
培养基2（单位均为g）：葡萄糖10、酵母浸粉2、（NH4）2SO42、KH2PO45、MgSO4•7H2O0.4、CaCl20.2、1000ml蒸馏水
仪器与试剂
1.仪器
恒温摇床，高速离心机，振荡器，电泳仪，电泳槽，透视式紫外分析仪（或凝胶成像仪），离心管，摇瓶
2.试剂
蔗糖、酵母质粒小提试剂盒中相关试剂（北京庄盟国际生物基因科技有限公司，也可采用其他公司试剂盒，那样步骤中数值可能要作改变）、琼脂糖、溴化乙锭等
操作程序
1.酵母细胞的培养与分离
（1）活化：取适量酵母菌体，接入培养基1的摇瓶中，于30℃在150r/min摇床中培养24h，菌体密度约为4×107个/ml。
（2）蔗糖梯度制备：于15ml（内径1.4cm，长11cm）离心管中自上而下铺加40%蔗糖溶液1.5ml，再加20%、10%及2%的蔗糖溶液各3ml制成不连续梯度。
（3）离心筛选：收集菌液，在800g离心力下离心5min，收集菌体重悬于1.5ml无菌水中。
将菌体铺在蔗糖梯度溶液顶层，60g离心5min，收集最上层清液（约占
总体积5%~10%），得到的为刚脱离母体的芽殖细胞。
（4）同步培养：将得到的菌液转入50ml培养基2摇瓶，30℃下150r/min摇床中培养。
2.ERCs的提取（参照部分质粒提取操作，部分地方改动以适应ERCs的提取）
（1）取1-5 ml 酵母培养物（不超过5×107 酵母细胞），12,000 rpm (~13,400×g )离心1分钟，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离
心管中）。
（2）酵母细胞壁的破除：酶法：向菌体中加入300 μl Lytic ase buffer，充分混匀，并在摇床上220rpm/min，30℃处理1 小时。
4000 rpm(~1500×g)离心10 钟，弃上
清，收集沉淀。
加入250μl 溶液1（请先检查是否已加入RNaseA）重悬沉淀。
注
意：根据酵母菌株和酵母细胞数量的不同，所用Lyticase buffer 的浓度和孵育时
间应该进行适当调整。
（3）向管中加入250 μl 溶液2，上下翻转6–8 次使菌体充分混匀，室温放置5－10 分钟。
注意：混匀，略微用力。
此时菌液应变得清亮粘稠。
（4）向管中加入350 μl 溶液3，略微用力上下翻转6–8 次，充分混匀，此时会出现白色絮状沉淀。
9,000 rpm (~13,400×g )离心15 分钟。
注意：溶液3 加入后应立即
混合，避免产生局部沉淀。
（5）小心地将上清液加入吸附柱中（吸附柱放入收集管中），9,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
（6）向吸附柱中加入500 μl 去蛋白液W1，12,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟，倒掉废液。
（7）向吸附柱中加入600 μl 漂洗液W2（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm (~13,400×g )离心1 分钟，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。
重复此步聚一次。
（8）将吸附柱放入收集管中置于12,000 rpm (~13,400×g )离心2 分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。
（9）将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50–100 μl 洗脱缓冲液TE，室温放置2 分钟，12,000 rpm (~13,400×g )离心2 分钟将质粒溶液收集
到离心管中。
3.实际步骤顺序
（1）进行操作1——酵母细胞的培养与分离。
（2）取第0代细胞，即同步培养0h的细胞，提取ERCs，电泳并紫外检测（具体步骤
不再赘述）。
（3）24h后，取菌液进行步骤1（3）——离心筛选，取上清液和下层液体，分别提取ERCs，电泳并紫外检测。
（4）48h后（可略提前），取菌液进行步骤1（3）——离心筛选，取上清液和下层液体，分别提取ERCs，电泳并紫外检测。
结果预测与分析
1.0h：检测不到正常条带，因为此时出芽细胞中不带有ERCs，且酵母本身质粒拷贝数较低，
无PCR基本难以检测，所以应该不会出现固定位置的明显条带。
2.24h：上清液中为出芽细胞，若以酵母代时2h计算，此时经过12代，还未足够衰老，
ERCs不会进入所出芽体中（详细见原理），所以也不会出现固定位置的明显条带。
下层液体中为已经一定程度衰老的细胞，产生ERCs，所以应该出现9kb左右条带，考虑超螺旋，应该显示小于9kb，但由于衰老程度不高，可能难以检测出，条带不够明显。
3.48h：上清液中的出芽细胞为高度衰老的酵母细胞产生，将会带有部分ERCs，可能出现
9kb左右条带，考虑超螺旋，应该显示小于9kb，但因为量不是很多，条带可能不够明显。
下层液体中大多为高度衰老的细胞，含有大量ERCs，应该会检测出比较明显的略小于9kb的条带。
实验失败分析与建议
以上实验结果为比较理想状况，但实际可能会出现一些问题。
1.酵母本身质粒对结果影响有多大，具体不是很清楚，如果酵母量较大可能会出现6kb左
右条带。
2.此次电泳条带分子量较大，所选marker也要相应改变，而且要延长电泳时间或提高电
泳电压。
3.根据理想状况，酵母代时2h，25代为极度衰老状态，所以我估计24h为中度衰老，48h
（也就是24代）为高度衰老，但实际代时可能并不是这样，若提前衰老则可能死亡后ERCs进入上清液，则24h和48h的上清结果会受影响，若代时比2h长，则可能出现衰老程度不够，ERCs积累量不足的情况，使检测结果受到影响。
所以时间可能要根据实际情况做相应调整。
4.由于ERCs是环状DNA而且只是比质粒略大，因此提取方法参考了质粒提取，实际情况
可能会有些不同，虽然已经对数值及操作细节做了改动。
5.虽然ERCs最终是在酵母细胞中大量积累，但究竟能提取多少，显示情况如何我也不是
很清楚。
如果量不足，可能要进行PCR再检测，那样实验复杂程度会进一步增加，可以考虑改编成一系列实验。
6.衰老细胞虽然是处于下层液体中，但具体在什么位置不是很清楚，可能需要进一步实验
摸索，来确定所取下层液体合适的位置及合适的量。
涉及的实验技术
酵母细胞同步培养及分离、质粒提取技术、凝胶电泳及检测、（可能会用到PCR）
参考文献（主要）
1.Matt Kaeberlein —Lessons on longevity from budding yeast -NATURE|Vol 464|25 March
2010
2.李伟军等—酿酒酵母单细胞生长动力学的初步研究—《化工冶金》2000年21卷第2期。