培养基的灵敏度检查操作SOP
培养基的灵敏度测试
培养基的灵敏度测试培养基的灵敏度测试是其质量控制的一个重要检测部分。
方法如下：1.用于菌数计数的半固体琼脂培养基促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查（促菌生长检查）。
取预先制备好的琼脂培养基平皿3~5个，用表面涂布法每块平板表面接种30~100个试验菌，同时用已知质量保证的同型号培养基平皿3~5个（如较著名的如MERCK，DIFICOL产品）做对照试验，待培养基表面的菌液被琼脂培养基吸干或风干后，将培养皿倒置于培养箱的使用温度下培养48~72小时，（也可采用浇碟法进行）取出培养后的平皿点计菌落数。
样品培养基上的微生物数量应不得低于对照培养基上微生物生长数量的70%。
否则，需重新检查，或该培养基被视为不符合促生长要求。
2.用于控制菌检查的富集培养基的促菌生长（灵敏度）检查的方法：对每个不同批号的脱水培养基均应进行灵敏度检查。
每100ml培养基内分别接入试验菌小于100cfu，每个菌种接种两瓶培养基，将接过种的培养基置于指定条件下培养。
应在16~18小时后可明显观察到培养基内有微生物生长，则证明此培养基合格。
原则上无论是采用脱水培养基还是按相关处方配制的培养基，一旦制成成品培养基，则应对每个配制批号培养基进行促菌生长（灵敏度检查）试验，以考察培养基的质量。
按脱水培养基的生产批号做灵敏度检查是基于培养基的灭菌程序已经经过验证。
如果实验室使用的是商购的成品培养基，供应商应随培养基提供相应批次的培养基质量检测报告，报告包括培养基的PH值、无菌检查结果和促菌生长（灵敏度）试验结果等项目。
建议在使用某一新的成品培养基（新供应商或新培养基品种）时，应至少考察三个不同批次的培养基质量，只有三批质量均合格方可使用该培养基。
微生物限度检查用成品培养基一旦初试确认合格后，可审查供应商的质检报告，而不必每批再作无菌检查和灵敏度检查，但半年应至少检查一次，以复核其质量。
用于无菌检查试验的每批培养基，均必须按规定进行灵敏度检查试验，此规定同样适用于实验室自行配制的培养基。
培养基灵敏度验证方案
培养基灵敏度验证方案1．验证目的：通过对培养基的灵敏度验证来增加无菌检查的可信度。
2．原理：不同种培养基内加入符合其生长条件的已知菌株做生长实验，根据加入定量细菌的生长情况来评价该培养基灵敏度。
菌量越少说明培养基灵敏度越高。
3．仪器设备：无菌室(操作间净化级别小于10000级，局部净化小于100级，室温18-26︒C，相对湿度40-60%)、恒温培养箱（30-35︒C）、恒温培养箱（20-25︒C）、高压灭菌器、干烤箱（250︒C）、相差显微镜等。
培养基：需气菌、厌氧菌培养基（硫乙醇酸盐培养基，中国药品检定所购买，生产批号：980115）；真菌培养基（改良马丁培养基，中国药品检定所购买，生产批号：980115）。
测试菌种：金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、白色念珠菌、生孢梭菌。
4．验证实施4．1培养基配制：分别称取硫乙醇酸盐培养基7.5克，改良马丁培养基7.0克，分别加250ml蒸馏水,热溶解，分装10ml/管，高压灭菌116︒C 20 分钟。
4．2测试菌的培养：在无菌操净台内，分别取金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、生孢梭菌菌液少量，接种在硫乙醇酸盐流体培养基（10ml/管）中，在30-35︒C培养24小时；取白色念珠菌菌液少量，接种在改良马丁培养基中在20-25︒C培养24小时。
此时的培养液称为原菌液。
4．3测试菌计数：采用原菌培养液直接稀释、计数板计数法：1．分别取已经培养好的原菌液1 ml，用生理盐水稀释10倍。
2．用一片干净的盖玻片盖在一干净计数玻片上。
3．吸少量含菌培养液接触盖玻片的边缘。
4．在相差显微镜400倍下观察，并且按一小方块所见的每一个细菌大约相当2 107细菌/ml 计算细菌浓度。
4．4原菌液稀释：将上述原菌液根据细菌计数结果，分别用生理盐水稀释至 10~100个菌/ml。
4．5灵敏度实验：分别将（4）稀释菌液1ml接种到（1）配制的10 ml/管培养基中，每种菌液接种3管培养基，以未接种的培养基为阴性对照，按规定的条件培养5天并逐日记录。
SOP-QC-03000培养基灵敏度检查标准操作规程471
SOP-QC-03000培养基灵敏度检查标准操作规程471 GMP标准文件分发号: 流水号:471 编码: SOP-QC-03000 共2页第1页题目: 培养基灵敏度检查标准操作规程制定人 QA审核批准人制定日期审核日期批准日期颁发部门质量技术部颁发日期生效日期质量技术部分发部门目的:建立培养基灵敏度检查标准操作规程，保证无菌检查结果的准确性、可靠性。
范围:适用于培养基灵敏度检查。
职责:QC无菌检验员。
规程:1 实验设备及用具:高压蒸汽灭菌器、恒温培养箱、注射器、针头、注射器盒、试管、试管架、搪瓷托盘、时钟、75,酒精棉球、无菌服。
2 培养基:需气菌、厌气菌培养基(硫乙醇酸盐液体培养基)、真菌培养基，培养基的配制详见《培养基配制标准操作规程》。
3 测试用菌种3.1 藤黄微球菌[CMCC (B) 28 001]3.2 生孢梭菌[CMCC (B) 64 941]3.3 白色念珠菌[CMCC (F) 98 001]4 操作4.1 取藤黄微球菌的营养琼脂斜面和白色念珠菌的真菌培养基琼脂斜面的新鲜培养物，分别用0.9,无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液;将生孢梭菌不含琼脂的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，吸至无菌离心管，离心，弃去上清液,菌体用0.9,无菌氯化钠溶液制成均匀的菌悬液。
分别取上述菌悬液,用0.9,无菌氯化钠溶液稀释至与细菌浊度标准管相同的浓度，然后作10倍系列稀释，制成1ml中含10-100个菌并计数。
4.2 取藤黄微球菌、生孢梭菌的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物，白色念珠菌的真菌培养基的新鲜培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液作10倍系列稀释，制成1ml中含10—100个菌并计数。
4.3 将藤黄微球菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的需气菌、厌气菌培养基3管，生孢梭菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别GMP标准文件接种至每管装量为12ml需气菌、厌气菌培养基3管，白色念珠菌的上述4.1或4.2的稀释菌液各1ml，分别接种至每管装量为9ml的真菌培养基3管，以未接种的培养基作对照，按规定的温度培养5天并逐日记录结果。
培养基的灵敏度检查操作SOP
培养基的灵敏度检查操作SOP1 目的建立培养基灵敏度试验的操作规程，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。
2 适用范围本标准适用于2015版中国药典培养基灵的敏度检查。
3 责任者 QC检验人员。
4 内容试验设备及用具：无菌培养皿、移液枪或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、培养箱等。
使用的菌株：金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003,铜绿假单胞菌CMCC(B)10104，枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501，·生孢梭菌CMCC(B)64941，白色念珠菌CMCC(F)98001，黑曲霉CMCC(F)98003，培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。
检测频率每批新买的培养基配制、灭菌后均应做灵敏度测试。
操作方法对照标准培养基用已经过试验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基。
试验培养基将琼脂类的试验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20mL，备用。
液体类的培养基直接使用。
'菌悬液的制备购买对应的商业化定量菌株。
使用时直接稀释成规定菌含量的菌悬液。
目前有进口的bioball和国产的microball等。
使用方便，定量精确。
培养基的生长促进实验琼脂类培养基的生长促进试验每株菌用2个试验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，取出平皿点计菌落数。
试验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的70%-150%范围内。
（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录1）液体类培养基的生长促进实验每株菌用2管（或瓶）试验培养基，接种的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。
培养基灵敏度验证
注意： 注意：
1. 培养基配置应使用洁净的玻璃容 不能使用金属容器。 器，不能使用金属容器。配置好的 培养基应尽快进行灭菌处理， 培养基应尽快进行灭菌处理，以免 长菌。 长菌。 2. 灵敏度检查是基于培养基的灭菌 程序已经经过验证。 程序已经经过验证。
3. 如果实验室使用的是购买的成品 培养基， 培养基，供应商应随培养基提供相 应批次的培养基质量检测报告， 应批次的培养基质量检测报告，报 告包括培养基的PH值 告包括培养基的PH值、无菌检查 结果和促菌生长（灵敏度） 结果和促菌生长（灵敏度）试验结 果等项目。 果等项目。同时应注意培养基有效 期。
6. 配制好的培养基应保存在2～25 配制好的培养基应保存在2 避光的环境， ℃、避光的环境，一般在三周内使 生化鉴别用培养基， 用。生化鉴别用培养基，应在一周 内使用； 内使用；选择性分离鉴别培养基最 好当日使用， 好当日使用，必要时于冷暗避光处 保存，最多不得超过三天。 保存，最多不得超过三天。
3. 如对实验结果有怀疑，可将新、老 如对实验结果有怀疑， 将新、 批号培养基在相同的条件下同时进行 试验。 设立对照培养基（ 试验。或设立对照培养基（如进口培 养基）。 养基）。 4. 标准菌株（如 ATCC 或NCTC标准 标准菌株（ NCTC标准 菌株或CMCC） 菌株或CMCC）及经过准确鉴定的临 床分离菌。试验前对菌种进行传代培 床分离菌。 对照菌株必须使用新鲜培养物。 养，对照菌株必须使用新鲜培养物。 一旦发现对照菌株污染或存在问题， 一旦发现对照菌株污染或存在问题， 则应立即更换。 则应立即更换。
培养基灵敏度检查所用的菌株传代次 数不得超过5 数不得超过5代（从菌种保存中心获得 的冷冻干燥菌种为第0 ），并采用适 的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适 宜的菌种保藏技术， 宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株 的生物学特征。 的生物学特征。实验用菌应是生命活 力旺盛的新鲜培养物， 力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三 代的培养物。 代的培养物。
质量SOP规程：SOP-ZL-JY016-1 培养基灵敏度查标准操作规程
目的：建立培养基灵敏度检验标准操作规程，保证检查结果的准确性和可靠性。
应用范围：适用于培养基灵敏度的检查。
责任人：QC无菌检验员。
编订依据：《中国药典》2010年版二部、《中国药品检验标准操作规范》2010年版。
内容：
1 细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的灵敏度检查及适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应检查。
2 菌种试验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。
大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B) 44 102]
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B) 26 003]
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B) 63 501]
白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F) 98 001]。
培养基适用性检查规程
培养基适用性检查规程目的：建立一个培养基的灵敏度检查，确保培养基性能可靠。
范围：适用于微生物检验。
责任：微生物检验员。
依据：《中国药典》2010年版一部附录、2010版GMP实施指南规程：1.不应在同一无菌室内同时操作2个或2个以上菌株。
2.菌株传代次数不得超过5代（以菌种保存中心获及的冷冻干燥菌种为第0代）。
一、计数培养基的适用性检查1、菌液制备取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30-35℃培养18-24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时，取上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50-100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在两小时内使用；若保存在2-8℃，可在24小时内使用。
2、适用性检查取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml（50-100cfu）,分别注入无菌平皿中，立刻注入待检查营养琼脂培养基和对照营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备4个平皿（其中2个注入待检查营养琼脂培养基，另两个注入对照营养琼脂培养基）。
30-35℃培养48h，计数。
取白色念珠菌1ml（50-100cfu）,注入无菌平皿中，立刻注入待检查玫瑰红钠琼脂培养基和对照玫瑰红钠琼脂培养基，平行制备4个平皿（其中2个注入待检查玫瑰红钠琼脂培养基，另两个注入对照玫瑰红钠琼脂培养基）。
23-28℃培养72h，计数。
3、结果判断若被检培养基上的菌落数不小于对照培养基上的菌落数的70%，且菌落大小、形态两者一致，判断该培养基的适用性检查符合规定。
二、控制菌检查用培养基的适用性检查1.菌液制备取大肠埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物少许接种至营养肉汤或营养琼脂培养基中，30-35℃培养18-24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时，取上述培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10-100cfu、每1ml50-100cfu和每1ml大于100cfu（菌落形成单位）的菌悬液。
培养基灵敏度检验记录
空 （白 不对 接 种）
白色念珠 菌
黑曲霉
空白对照 （不接种）
1
2
3
4
备注: 培5 养结 果阳性用“+”
培养皿编号 24H菌落数 48测试
1
2
3
结果判定(Result):
检 测/
复核/日 期:
生效日期：2016年05月18日
2.2
取每管装量9ml的TSB培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空 白对照，培养5天，逐日观察结果并记录.
3. 培养情况
培养仪器 培养箱编号
生化培养箱
校验有效期至
培养温度
30℃～35℃
23℃～28℃
天数
菌种 金黄色葡萄球 菌
铜绿假单胞 菌
枯草芽孢杆 菌
生孢梭 菌
KANGGU
嘉兴康谷医用材料有限公司
产品描述
培养基灵敏度检查记录
批号
QMR-098-00
数量
生产商
检测依据
2010版中国药典
检测日期
1. 检金测黄用色菌葡种萄球 菌
铜绿假单胞菌
枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
白色念珠菌
黑曲霉
2. 程序
2.1
取每管装量为12ml的TSB培养基9支，分别接种小于100cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢 杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天，逐日观察结果并记录.
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培养基的灵敏度检查操作SOP
1 目的建立培养基灵敏度试验的操作规程，是为了规范、统一培养基灵敏度检测，确保微生物检测准确、安全进行。
2 适用范围本标准适用于2015版中国药典培养基灵的敏度检查。
3 责任者QC检验人员。
4 内容
4.1 试验设备及用具：
无菌培养皿、移液枪或无菌注射器、无菌玻璃涂布器、培养箱等。
4.2 使用的菌株：
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003,
铜绿假单胞菌CMCC(B)10104，
枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501，
生孢梭菌CMCC(B)64941，
白色念珠菌CMCC(F)98001，
黑曲霉CMCC(F)98003，
培养基灵敏度检测所用的菌株传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术，以保证试验用菌株的生物学特性。
4.3 检测频率
每批新买的培养基配制、灭菌后均应做灵敏度测试。
4.4 操作方法
4.4.1 对照标准培养基
用已经过试验证明合格的培养基或购买的有质量证书的成品平皿培养基作为对照标准培养基。
4.4.2 试验培养基
将琼脂类的试验培养基加热融化后，冷却至45℃左右，以无菌的方式在无菌培养皿中注入15～20mL，备用。
液体类的培养基直接使用。
4.4.3 菌悬液的制备
购买对应的商业化定量菌株。
使用时直接稀释成规定菌含量的菌悬液。
目前有进口的bioball和国产的microball等。
使用方便，定量精确。
4.4.4 培养基的生长促进实验
4.4.4.1 琼脂类培养基的生长促进试验
每株菌用2个试验培养基平皿，用表面涂布法在每个平皿表面接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，取出平皿点计菌落数。
试验培养基上的微生物数量应为对照培养基上微生物生长数量的70%-150%范围内。
（注：每种培养基生长促进实验的具体菌株见附录1）
4.4.4.2 液体类培养基的生长促进实验
每株菌用2管（或瓶）试验培养基，接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌），同时用2个对照标准的培养基或用已知合格的酪蛋白大豆消化琼脂平皿做对照，接种相同量的菌悬液试验，在规定温度下培养，对比或计数，在规定时间内能生长菌落为合格。
4.4.5 培养基的生长促进和抑制特性试验
4.4.
5.1 液体培养基的生长促进特性试验
接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌）于一定量适合的培养基。
在特定温度下培养，培养时间不超过试验中规定的最短期限。
与对照标准的培养基获得的微生物生长相比，接种微生物的生长应明显。
4.4.
5.2 固体培养基的生长促进特性试验
采用表面涂布法，在每一块平皿上接种0.1-0.5mL的菌悬液（约10-100CFU试验菌）适宜微生物。
在特定温度下培养，培养时间不长于试验中规定的最短期限。
接种微生物的生长与对照标准的培养基获得的微生物生长相当。
4.4.
5.3 液体或固体培养基的抑制特性试验
用适当培养基接种至少100 CFU适宜微生物。
在特定温度下培养，培养时间至少为试验中规定的最长期限。
无受试微生物生长。