双元表达载体 - 360文档中心

青蒿CYP71AV1和CPR基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建

第31卷第8期西南大学学报(自然科学版)2009年8月Vol131No18Journal of Southw est U niv ersity(N atural Science Edition)Aug12009文章编号:1673-9868(2009)08-0073-05青蒿CY P71AV1和CPR基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建¹任肃霞1,2,3,杨春贤1,2,3,陈敏4,廖志华1,2,311西南大学生命科学学院,重庆400715;21重庆市甘薯研究中心,重庆400715;31三峡库区生态环境教育部重点实验室,重庆400715;41西南大学药学院,重庆400716摘要:采用RT-P CR方法从青蒿中克隆紫槐二烯氧化酶基因和细胞色素P450还原酶基因编码区序列,正向插入经改造后获得的双元三价植物高效表达载体p1304*中,构建植物表达载体p1304*-CP R-C YP71A V1,并将该表达载体导入根癌农杆菌L BA4404,获得可直接用于遗传改良青蒿的工程菌p1304*-CPR-CYP71A V1-LBA4404,为利用植物基因工程技术提高青蒿素产量奠定了基础.关键词:青蒿素;紫槐二烯氧化酶;细胞色素P450还原酶;载体构建中图分类号:Q94312文献标识码:A青蒿素是从药用植物青蒿即黄花蒿[1](A r temisia annua L1)中提取的新型抗疟疾特效药,需求量很大,而野生青蒿植株中青蒿素的含量很低,只占其干质量的0101%~011%[2],在国际市场上供不应求.因此如何提高青蒿素产量成为研究热点,通过基因工程技术改造野生青蒿是最有潜力的途径之一.紫槐二烯氧化酶(am orpha-4,11-diene C-12o xidase,CYP71A V1)是一种新型的细胞色素p450单加氧酶,可以催化多种倍半萜内酯的生物合成前体物质的氧化反应[3-4].CYP71AV1在青蒿素生物合成过程中催化紫槐二烯的羟基化,同时还可能继续参与催化后续反应,使其依次生成青蒿醇、青蒿醛、青蒿酸[5-6],而青蒿酸则是生成青蒿素的直接前体[7].Dae-Ky rn Ro等成功克隆了青蒿CYP71A V1基因和细胞色素还原酶(Cytochr ome p450r eductase,CPR)基因,并在酵母中表达,通过GC-M S法检测发酵产物.结果发现,在只转化了CPR 基因的酵母中没有检测到青蒿酸,但在CYP71A V1基因和CPR基因共表达的酵母中,检测到的青蒿酸含量达(32?13)mg/L,青蒿醇的含量不及青蒿酸的5%,且完全不生成青蒿醛.证明CYP71AV1与它的氧化还原伴侣即CPR共表达时,能提高青蒿酸的产量[8].本研究旨在构建C YP71A V1基因和CPR基因的双元植物表达载体,并获得重组工程菌,为利用基因工程技术培育高产青蒿素的青蒿奠定基础.1材料与方法111材料红杆青蒿(重庆市中药研究院张明研究员提供)采自酉阳,栽培于西南大学生命科学学院.大肠杆菌DH5a感受态细胞、根癌农杆菌LBA4404、质粒pCAM BIA1304+均为本实验室保存.植物组织RNA提取试剂盒(北京天为时代公司),胶回收(小量)试剂盒、质粒提取(小量)试剂盒(上海华舜), DNA Lig ation试剂盒、pM D18-T Vector试剂盒、RNA PCR试剂盒(TAKARA公司),DNA分子量标准¹收稿日期:2008-09-25基金项目:国家自然科学基金重点资助项目(30771238).作者简介:任肃霞(1984-),女,山西晋中人,硕士研究生,主要从事植物次生代谢产物研究.通讯作者:廖志华,教授.DL2000、荧光染料Goldv iew (上海生工),pfu DNA 聚合酶(T OYOBO 公司),氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)、利福霉素(Rif)、链霉素(Str)(北京鼎国).112 青蒿总RNA 提取自青蒿幼苗各部位混合取样约100mg,在液氮中迅速研磨成细粉,用植物组织RNA 提取试剂盒提取青蒿总RNA.1%甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA 质量(110V,80m A,15min,Goldv iew 染色),紫外分光光度法检测RNA 纯度和浓度.113 引物设计根据已报道的青蒿CYP 71A V1(登录号:DQ268763)和CPR (登录号:DQ318192)编码区序列设计特异性引物(表1).表1 CYP 71AV 1和CPR 基因编码区的克隆引物名称引物序列酶切位点F CYP71A V15-GCT CT A GA A T G A AG AG T A T A CT A A A AG CA -3X ba I R C YP71A V15-CCCGG A T CCCT A G AA A CT T G GA A CG A GT A -3Bam H I F aaCPR5-CCA CT A GT AT GCA AT CA A CA ACT T CCG -3Sp e I R aaCP R 5-GA CGA CCG GT T A CCT T ACCA T A CAT CA CGG AG A T A -3Bs tp I114 青蒿CY P 71AV 1和CPR 基因编码区的克隆用Olig o dT 通用引物反转青蒿总RNA ,得第一链cDNA,以此为模板,利用pfu DNA 聚合酶进行PCR 扩增.反应体系为:5L L 10@pfu buffer w ith M gCl 2,4L L 215mM dNTP,015L L pr im er,015L L 215单位的pfu DNA po lymerase,最后用ddH 2O 补足至50L L.C YP71A V1反应条件为:94e 预变性5m in,然后开始包括94e 变性45s,60e 退火45s,72e 延伸2min 的28个循环,最后72e 延伸10min.CPR 反应条件为:94e 预变性5m in 然后开始包括94e 变性45s,52e 退火45s,72e 延伸2m in 45s 的4个循环,再进行包括94e 变性45s,5915e 退火45s,72e 延伸2min 45s 的24个循环,最后72e 延伸10m in.PCR 产物经电泳检测后回收目的条带,并进行末端加A 反应,反应体系为:10@PCR buffer 2L L,Mg Cl 2112L L,dAT P 014L L,T aq DN A po lym erase 014L L,回收产物10L L,最后用ddH 2O 补足至20L L.反应条件:72e 反应30min.反应产物与pMD18-T 载体连接并转化大肠杆菌DH 5a 感受态细胞,用加有Amp(100mg /L)的LB 平板进行蓝白斑筛选.挑取阳性克隆进行PCR 检测后送上海英骏公司(in -v itro gen)测序,测序结果在NCBI(http://ww w 1ncbi 1nlm 1nih 1go v/)上进行生物信息学分析.115 p1304*的构建pCAM BIA1304+是选用pBI121和pCAMBIA1304为基本元件,由廖志华构建[9].p1304*是以pCAM -BIA1304+为基本骨架改造而来,是用一段含有X ba I 和Bam H I 酶切位点的序列取代pBI121表达盒上编码B -gulcuro nidase 的序列,并命名为p1304*(图1).LB:左边界;RB:右边界;35S P:CaM V35S 启动子;NOS T 、35S T:终止子;H ygr:潮霉素抗性标记基因.图1 载体p1304*示意图116 p1304*-CPR -CYP 71AV 1的构建将测序验证的分别携带有C YP71A V1和CPR 的菌落扩大培养之后抽提质粒,分别命名为CYP71A V1-T 和CP R -T.对p1304*和CPR -T 同时进行Sp e I/B stp I 双酶切,对p1304*和C YP71A V1-T 同时进行X ba I/Bam H I 双酶切,酶切完成后分别回收p1304*中的大片段和目的基因小片段,并分别连接74西南大学学报(自然科学版) 投稿网址http://x bg jxt 1sw u 1cn 第31卷转化大肠杆菌DH 5a,挑取单菌落进行PCR 验证,阳性克隆抽提质粒进行酶切验证,分别获得命名为p1304*-C YP 71A V1和p1304*-CPR 的质粒.再同时对p1304*-C YP71A V1和p1304*-CPR 进行Sp e I/B stp I 双酶切,酶切完成后回收p1304*-CYP71A V1中的大片段和p1304*-CPR 中的小片段,将两个回收片段连接转化,获得命名为p1304*-CP R -CYP71A V1的重组质粒.117 农杆菌工程菌的获得p1304*-CPR -C YP71A V1转化根癌农杆菌LBA4404感受态细胞,涂布在YEP 平板(YEP +Kan 50m g/L+Rif 40m g/L+Str 25m g/L)上,挑取单菌落分别进行PCR 检测.2 结果M :DL2000;1:CP R 克隆;2:C YP71A V1克隆.图2 CY P 71AV 1和CPR 克隆的电泳图谱211 CY P 71AV 1和CPR 基因编码区克隆从青蒿中克隆了CYP71A V1基因编码区,长1488bp,编码496个氨基酸.CP R 基因编码区长2115bp,编码705个氨基酸(图2).根据该序列信息和载体酶切位点信息,带酶切位点黏性末端的引物插入到特异性序列中,因此扩增得到的CYP 71A V1和CP R 基因序列实际长度分别应为1510bp 和2137bp.将这两个序列插入到T 载体上测序验证,结果表明得到的序列与预计结果吻合.将所得序列与已知青蒿C YP 71A V1序列和CP R 序列在N CBI 中进行BLAST 比对,发现克隆得到的目的片段与已知序列同源性高达99%.212 p1304*-CPR -CYP 71AV 1双元表达载体构建首先构建p1304*-CP R 和p1304*-C YP71A V1单元载体,再将CPR 基因酶切,与p1304*-C YP71A V1骨架连接.最终使得CPR 基因正向插入到p1304*上Sp e I 位点和Bstp I 位点之间,C YP71A V1基因正向插入到p1304*上X ba I 位点和Bam H I 位点之间(图3).LB:左边界;RB:右边界;35S -Pro:CaM V35S 启动子;Nos:Nos -T er 终止子.图3 重组质粒p1304*-CPR -CYP 71A V 1示意图M :DL2000;1:重组质粒进行S pe I/B stp I 酶切;2:重组质粒进行X ba I/Bam H I 酶切.图4 重组质粒p1304*-CPR -CYP 71AV1的酶切验证图对质粒p1304*-CP R -C YP71A V1进行酶切验证时,首先进行Sp e I/B stp I 酶切,再对回收的载体骨架大片段进行X ba I/Bam H I 酶切(图4).结果显示CPR 和CYP71A V1都成功转入p1304*,证明双元载体p1304*-CPR -C YP71A V13构建成功.在进行X ba I/Bam H I 酶切时,其模板是线性片段,而Bam H I 在buffer K 缓冲液中酶切效率比X ba I 高,因此还切出一个约3123bp 的条带.213 获得重组工程菌双元载体p1304*-CP R -CYP71A V1转化农杆菌LBA4404后,进行目的基因的和潮霉素基因的PCR 检测,结果在所挑的4个单菌落中,CPR 、75第8期任肃霞,等:青蒿CYP71A V1和CP R 基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建CYP71A V1和H ygr 均为阳性(图5).证明成功获得了可以编码CP R 和C YP71A V1的重组工程菌,命名为p1304*-CPR -C YP71A V1-LBA4404.M :DL2000;+:阳性对照-:阴性对照;1-4:单菌落检测.图5 重组工程菌p1304*-CPR -CYP 71AV 1-LBA 4404的PCR 检测3 讨论青蒿素(artemisinin)是继氯喹、乙氨嘧啶、伯喹和磺胺后最热的抗疟特效药,尤其对脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点,已成为世界卫生组织推荐的药品[10],其生物合成途径属于植物类异戊二烯代谢途径中的甲羟戊酸途径.该途径上从起始物质乙酰辅酶A 到法呢基焦磷酸(FPP)的反应过程已研究得比较清楚,但是对由FPP 到青蒿素的生物合成途径尚不明了.本研究选取青蒿素合成途径上的CYP71A V1和CPR 作为青蒿素代谢工程的靶点基因,是因为现在大多研究认为C YP71A V1和CPR 在从紫槐二烯(amorpha -4,11-diene)到青蒿酸的合成过程中起着举足轻重的作用[11].但是目前研究集中在该基因的酵母表达,并且只能检测到青蒿素的半合成产物青蒿酸,而从青蒿酸如何合成青蒿素更是一个难题.随着人们对青蒿素生物合成途径研究的不断深入和青蒿离体快速繁殖体系的建立[12],通过基因转化技术获得转基因高产株系已成为提高青蒿素产量的最有效途径之一[13].中国科学院北京植物研究所已建立了根癌农杆菌介导的青蒿转化体系,并于近年来获得了转单基因的青蒿再生植株[14].本研究以pBI121和pCAMBIA1304为基本元件,先构建pCAMBIA1304+,该载体可以携带两个外源目的基因,再用一段特异序列取代pBI121表达盒上的序列以利于装载C YP71A V1,构建的pCAM -BIA1304+和p1304*也可以用于携带其他目的基因,为开展植物次生代谢工程提供新的转化载体和策略.从青蒿中克隆到了C YP71A V1和CPR 的编码区,并构建了携带C YP71A V1和CP R 双基因的高效植物表达载体,为进一步研究青蒿素生物合成的分子机理和利用基因工程实现青蒿的次生代谢工程奠立基础.参考文献:[1]周宇杰,丁伟,王春升.青蒿粗提物对朱砂叶螨生物活性的初步研究[J].西南农业大学学报(自然科学版),2006.28(2):305-308.[2] Duke M V ,Paul R N ,Elsohly H N ,et al.L ocalization o f A rt em isinin and A rtemisitene in F oliar T issues o f G landed andG landless Bioty pes o f A r temis ia annua L [J].Int J P lant Sci,1994,155(3):365-372.[3] T eo h K H ,P olichuk D R,Reed D W ,et a l.A r temisia nnua L 1(A steraceae)T r icho me -Specific cDN As RevealC YP 71A V1,a Cyto chr ome P450w ith a K ey Role in the Biosy nthesis of the A nt imalar ial Sesquiter pene L actone A r temis-i nin [J].F EBS L etters,2006,580(5):1411-1416.[4] Bo uw meester H J,W allaart T E,Janssen M H,et al.A mor pha -4,11-Diene Sy nt hase Cataly ses the F ir st P ro bable Stepin A rtemisinin Biosy nthesis [J].P hy tochemistry ,1999,52(5):843-854.[5] H elliw ell C A ,Chandler P M ,P oole A,et a l.T he CYP 88A Cyt ochrome P450,Ent -Kaur eno ic A cid Ox idase,Cata lyzesT hr ee Steps of the Gibberellin 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Swe etpo ta to Res earch Cente r ,Chong qing 400715,China ;31Ke y La bo ratory of E c o -environments in Three Gorge s Rese rvoir Reg ion (Ministry of Educa tion),Chong qing 400715,China ;41Schoo l of Pha ma ceutic al Scie nce s ,Southwe st Unive rsity ,Cho ngqing 400715,ChinaAbstract:T he coding sequences of CYP71AV1(am orpha -4,11-diene C -12ox idase)and CPR (cytochr ome P450reductase)of Ar temisia annua L 1w ere obtained w ith RT -PCR.T he tw ice sequences w er e subcloned into the reconstructed plant binar y ex pression vecto r p1304*to construct the recombinant v ecto r p1304*-CP R -C YP71A V1,w hich w as then intro duced into A grobacter ium tumef aciens strain LBA4404.The eng-i neer ed bacter ia,nam ed p1304*-CPR -C YP71A V1-LBA4404,can be used to genetically tr ansform A 1an -nua L.Key words:artemisinin;am orpha -4,11-diene C -12oxidase;cy to chrom e P450reductase;vector co nstr uc -tion责任编辑胡杨 77第8期任肃霞,等:青蒿CYP71A V1和CP R 基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建。

双元表达载体系统

双元表达载体系统双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T—DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA (T-DNA)两端24bp序列，进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。

之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T—DNA的转移。

另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid),它在T—DNA左右边界序列之间提供植株选择标记女口NPTII基因以及Lac Z基因等。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T—DNA的转移。

与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

|原理1•一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS 和筛选标签的融合蛋白(通常是GFP或Gus)的普通载体。

另一个载体就是双元载体(binary-vector )了。

通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。

然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。

我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等2•双元表达载体系统主要包括两个部分3•一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T—DNA区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T—DNA的转移。

双元表达载体系统

双元表达载体系统双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA（T-DNA）两端24bp序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。

之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。

与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

原理1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通载体。

另一个载体就是双元载体（binary-vector）了。

通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。

然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。

我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等2.双元表达载体系统主要包括两个部分3.一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

双元载体的工作原理

双元载体的工作原理一、什么是双元载体双元载体是一种在基因工程中广泛使用的工具，用于将外源基因导入目标细胞中并使其表达。

双元载体由两个部分组成：质粒和选择标记基因。

其中质粒是一种环状的DNA分子，常常来自于细菌或其他微生物，可以在细胞内独立复制和表达外源基因。

选择标记基因则是用来鉴定哪些细胞成功地接受了质粒，并具备了表达外源基因的能力。

二、双元载体的构建1. 质粒的选择构建双元载体的第一步是选择适合的质粒。

通常情况下，研究人员会选择能够在目标细胞中高效复制和表达的质粒。

质粒的选择还要考虑是否包含适当的启动子和调控元件，以确保外源基因能够在目标细胞中正确地表达。

2. 插入子的克隆插入子是指要导入目标细胞的外源基因序列。

将外源基因插入质粒的过程称为克隆。

常见的克隆方法包括PCR扩增、酶切和连接等技术。

通过这些技术，研究人员可以将外源基因准确地插入到质粒的特定位置上。

3. 选择标记基因的选择为了鉴定接受了质粒的细胞，双元载体通常还会包含一个选择标记基因。

选择标记基因可以使细胞对特定抗生素或药物具有抗性，从而筛选出成功表达外源基因的细胞。

常用的选择标记基因包括抗生素耐药基因和荧光蛋白基因等。

三、双元载体的转染与表达1. 转染将构建好的双元载体导入目标细胞的过程称为转染。

常见的转染方法包括化学转染、电穿孔和病毒介导转染等。

这些方法可以破坏细胞膜，使质粒能够进入细胞内。

2. 外源基因的表达一旦双元载体成功转染到目标细胞中，质粒就可以通过自身的复制和转录机制表达外源基因。

外源基因的表达可以通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达情况，或者通过其他方法如Western blotting验证其表达水平。

四、双元载体的应用双元载体在基因工程中有着广泛的应用。

它可以用于基因功能研究、基因治疗、转基因动物的制备等领域。

1. 基因功能研究通过将外源基因导入目标细胞中，研究人员可以研究该基因的功能和调控机制。

例如，可以通过过表达或沉默某一基因，来研究该基因对细胞生理过程的影响。

双元表达载体系统

双元表达载体系统双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA（T-DNA）两端24bp序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。

之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。

与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

原理1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通载体。

另一个载体就是双元载体（binary-vector）了。

通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。

然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。

我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等2.双元表达载体系统主要包括两个部分3.一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化

双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【摘要】【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。

【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPTⅡ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种＂优引三号＂,对所获得的转基因植株进行PCR检验。

【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。

【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。

%【Objective】The study was done to construct a binary expression vector to improve stress-tolerance of target plants by genetic transformation.【Method】 We introduced HaBADH directly into plant expression vector pCAMBIA2300-35S-OCS,and replaced NPTⅡ with HaCMO,and constructed a binary expression vector.HaBADH and HaCMO were both cloned by our laboratory and pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO was transformed into rice Youyin-3 by Agrobacterium-mediated transformation and transgenatic plants were detected with PCR.【Result】 We constructed the plant binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO successfully,and obtained 5 transgenic rice plants which contained the vector by PCRanalysis.【Conclusion】 This study introduces HaBADH and HaCMO to pCAMBIA2300-35S-OCS,and constructs a binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,and transforms it to rice,which prepares for study synthesis and accumulation of glycine betaine in transgenetic rice.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)006【总页数】8页(P210-216,223)【关键词】梭梭;甜菜碱醛脱氢酶;胆碱单加氧酶【作者】石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【作者单位】宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002 宁夏大学生命科学学院,宁夏银川750021;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002【正文语种】中文【中图分类】Q782在盐渍、干旱等渗透胁迫情况下，许多高等植物会在细胞内大量合成并积累一些有机渗透调节物质，如山梨醇、甘露醇、脯氨酸、甜菜碱等，以提高自身抵抗盐渍、干旱等胁迫的能力。

双元表达载体系统

双元表达载体系统双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA（T-DNA）两端24bp序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。

之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。

与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

原理1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通载体。

另一个载体就是双元载体（binary-vector）了。

通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。

然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。

我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等2.双元表达载体系统主要包括两个部分3.一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

油桐DGAT2基因克隆及其RNAi双元表达载体构建

点在于可快速建立基因与表型间的直接对应关系，明确基因的功能。目前，菜、生（ｒｃｉｈ－油花Ａａｈｓｙ
１３２ｃＮ的合成．．ＤＡ
合成。
ｃＮ合成按ＳｐｒｃｐＤＡｕｅＳｒｔⅡ ｉ
Ｒｖｒｒｎｃｉａｅ反转录试剂（ｎｉｏｅ）明ｅｅｅＴａｓｒｔｓｓｐＩｖｒｇｎ说ｔ１３３ＤＡ２基因的克隆．．ＧＴ根据Ｇｎａｋ中的油ｅＢｎ
较少，近些年来，续在蓖麻（ｉｎｓｃｍｍｎ．陆ＲｃｕｏｕｉＬ，ｉｓＧｎａｋ收录号Ａ９６２）甘蓝型油菜（ｒｓｉｅＢｎＹ１ｌ９、ＢａｓａｃｎｐｓＬ，ｅＢｎ录号Ａ１５２）芥菜（．ｕ — ａｕ．Ｇｎａｋ收Ｆ５２４、Ｂｊｎ
录号Ｅ３５７）油桐（ｅＢｎＵ９７４、Ｇｎａｋ收录号Ｄ３６８）Ｑ５６２
涂料生产要求桐油中桐酸含量高，制造优质生物而柴油则要求单不饱和脂肪酸含量尽量高，因此，据根不同用途和目标调控油桐桐酸生物合成成为油桐品
徐玲娜，汪阳东ｈ，陈益存，张姗姗，
（．１中国林业科学研究院亚热带林业研究所，江富阳浙３１０；．１４０２安徽师范大学生命科学学院，安徽芜湖２１０）４００
关键词：桐；Ａ２ＲＡ；向启动子油ＤＧＴ；Ｎｉ双