tasiRNA研究进展
靶向白血病特异性转录调节因子融合蛋白siRNA的研究进展
Ｍ Ｌ Ａ ６ Ｍ Ｌ Ａ １ 等融合蛋白。研究表明针对 Ｌ／ Ｆ 和 Ｌ ／ Ｆ ｑ 具有酪氨酸激酶作用的异位融合蛋 白干扰可降低 白 血病细胞的增生 ； 白血病特异性转录调节因子融合 对
蛋 白干扰可 降低 白血 病细胞 的增生并 促其分 化 ， 针 如
・
特别 关 注 ・
靶 向 白血病 特 异性 转 录调 节 因子 融合 蛋 白 ｓ Ｎ 的研 究 进展 ｉ Ａ Ｒ
赵 午莉 邵荣光
白血病是 血 液 系统 的恶 性疾 病 。在 各种 致 癌 因 子 的作用下 ， 血细胞 分 化受 阻且增 生 能力 增 强 ， 导致
对 Ｂ Ｒ—Ａ ＬｍＲ Ａ的 ｓ Ｎ Ｃ Ｂ Ｎ ｉ Ａ可 以显 著地 降低 白血 Ｒ 病 细胞 的增 生 ， 进 白血病 细 胞 的凋亡 ＿ ； 对 Ｔ Ｌ 促 １针 Ｅ
基 金 项 目： 家 重 点 基 础 研 究 发 展 计 划 （ ７ 国 ９ ３计 划 ）项 目 （０ ９ Ｂ ２ ８７ ； ２ ０ Ｃ ５ １０ ） 国家 自然科学研 究基金项 目（０ ７ ５３）教 育部博 ３７ ２ ８ ；
士点 基 金 （０ ７０ ３ １ ） ２０ ０２ ０ ７
结合位点未受影响， 提示 Ａ Ｌ／ Ｔ ８ Ｍ １Ｍ Ｇ 在潜在的致 白 血病作 用 中除了抑制 野生 型 Ａ １的作 用外 ， 影 响 ＭＬ 也 Ｍ Ｇ 对血细胞转 录的调控 。Ｈ ｉ ｎｅ ｈ 采用 Ｔ８ ６ ｅ ｅｒ ｃ 等 Ｊ ｄ ｉ
—
血细胞无限增生且替代 了原有的正常细胞 ， 了白 诱发 血病 。与大多数 实 体 瘤不 同 ， 过 ５ ％ 的 白血 病病 超 ０
例 有明显 的特 异 染 色 体 改 变 ， 比如 染 色体 异 位 和 翻 转， 而且 白血病 和实体 瘤相 比具 有更强 的变异基 因稳
siRNA与癌症治疗
04
的最新进展
针对特定癌症类型的最新研究
肺癌
研究显示，sirna可靶向肺癌细胞中的致癌基因， 抑制其表达，从而抑制肿瘤生长。
乳腺癌
sirna被用于沉默乳腺癌细胞中致癌基因的表达， 降低肿瘤细胞的增殖和转移能力。
结直肠癌
sirna被用于抑制结直肠癌细胞中致癌基因的表达， 降低肿瘤细胞的生长和扩散。
联合治疗策略的探索
特性
sirna具有高度的特异性，能够针对特定的基因进行调控。此外，sirna还具有稳 定性、易于合成和低毒性的特点，使其成为一种有前途的生物治疗手段。
SIRNA的作用机制
识别
sirna通过碱基配对与mRNA结合，特异性地识别并 抑制特定基因的表达。
沉默
sirna与mRNA结合后，引发rna降解，从而在转录后 水平抑制特定基因的表达。
胞的抗原表达，增强肿瘤细胞对免疫细胞的识别和杀伤敏感性。
SIRNA在癌症治疗中
03
的挑战和前景
克服生物屏障
稳定性和保护
在体内环境中，sirna容易受到核酸酶的降解，因此需要采 取措施来保护sirna不被降解。
穿透细胞膜
sirna需要通过细胞膜才能进入细胞，但细胞膜对sirna的通透 性较低，因此需要寻找有效的方法来提高sirna的细胞膜穿透能
调节
sirna可以调节细胞内多种基因的表达，包括致癌基因 和抑癌基因，因此对癌症治疗具有重要意义。
SIRNA的优点和局限性
优点
sirna具有高度的特异性，能够针对 特定的基因进行调控；同时，sirna 还具有稳定性、易于合成和低毒性的 特点。
局限性
sirna的作用机制较为复杂，目前对其 作用机制的理解尚不完全；此外， sirna的体内稳定性、细胞摄取率和靶 向特异性等方面仍需进一步改进。
siRNA脱靶效应研究进展
收稿日期： ２００７－０１－２８ 作者简介： 邹凌云（ １９７９－） ， 男， 湖南人， 博士研究生， 研究方向： 生物信息学； Ｔｅｌ： ０７３１－４５７４９９１； Ｅ－ｍａｉｌ： ｚｏｕｌｉｎｇｙｕｎ＠ｎｕｄｔ．ｅｄｕ．ｃｎ 通讯作者： 王正志（ １９４６－） ， 男， 上海人， 教授， 研究方向： 生物信息学； Ｔｅｌ： ０７３１－４５７４９９１
siRNA的应用研究进展
siRNA的应用研究进展RNA干扰（RNA interference，RNAi）是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。
它是指小分子双链RNA可以特异性地降解同源mRNA,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。
人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mRNA的小分子干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA），抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。
显然，在理论上，通过siRNA 可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等等，因而siRNA受到学术界普遍的关注，是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。
因为siRNA在生物功能研究、疾病治疗和新药研发方面具有非常重大的应用价值，2002年，著名的美国《科学》杂志将其评为世界十大科技成果之首。
2006年，发现RNA干扰现象的美国科学安德鲁·法厄被授予诺贝尔生理及医学奖。
一般地，科学家从成果发表到获得诺贝尔医学奖需要等待20多年以上的时间，但安德鲁·法厄从发现RNA干扰现象到获得诺贝尔医学奖只用了8年的时间，是迄今为止获得诺贝尔医学奖最快的科学家，这充分证明了国际科学界对RNA干扰成果的认可。
一、siRNA载体的应用分析如上所述，作为抑制基因表达的有效工具，siRNA具有非常广泛的应用。
目前，几乎所有的分子生物学实验室和核酸药物开发厂商，都会用到siRNA作为研究手段。
但是，siRNA不能单独应用，它必须与运载工具也就是载体搭配才能转运到机体组织和细胞内发挥作用。
因而，siRNA的应用领域就是其载体的应用领域。
具体地说，siRNA与载体结合可用于以下研究：1、基因功能研究：由于siRNA具有很好的特异性和有效的干扰活力，可以使特定基因沉默，获其功能丧失或降低突变，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。
已有研究表明siRNA能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，而且抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，产生类似基因敲除的效应。
siRNA脱靶效应研究进展
路径上的调控因子的大规模基因敲除实验中， 筛 选 出 来 的 一 些 候 选 因 子 被 证 实 是 由 于 ｓｉＲＮＡ 沉 默 了 决 定 ＨＩＦ －１ 活 性 的 氧 调 节 亚 单 元 ＨＩＦ －１α而 表 达 的 ［３］。 而 在 一 个 以 持 家 基 因 Ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ Ｂ 和 ＤＢＩ （ ｄｉａｚｅｐａｍ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ） 为 靶 的 ＲＮＡｉ 实 验 中 ， ｓｉＲＮＡ 诱 导 了 一 个 与 靶 无 关 的 细 胞 发 育 表 型 ， 是 由 于 其 与 序 列 互 补 度 高 的 非 靶 基 因 作 用 引 发 的［４］。 其 它 一 些 类 似 的 研 究 也 都 表 明 ， ｓｉＲＮＡ 作 用 过 程 中 存 在非特异性， 可能与非靶基因之外的其它基因作用 而非特异地阻断基因表达， 产生意料之外的效用， 称 为 ｓｉＲＮＡ 脱 靶 效 应 （ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ， ＯＴＥｓ） 。目 前 已 知 脱 靶 效 应 在 ｍＲＮＡ 水 平 和 蛋 白 质 表 达 水 平 上 都 能 够 检 测 出 来［５］。ＲＮＡ 干 扰 的 这 种 非 特 异 性 可 能 导 致 无 法 正 确 解 释 基 因 功 能 ， 以 及 导 致 ＲＮＡｉ 技 术
Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｒ ＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｓｉＲ ＮＡ ｏｆｆ－ ｔａｒｇｅｔ ｅｆｆｅｃｔｓ
ＲＮＡ 干 扰 （ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， ＲＮＡｉ） 过 程 中 ， 短 干 扰 ＲＮＡ（ ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ， ｓｉＲＮＡ） 与 靶 基 因 的 结 合 是 高 度 特 异 的 ， 因 此 ， ＲＮＡｉ 技 术 被 广 泛 用 来 抑 制 特 定 基 因 的 表 达 。该 技 术 的 出 现 被 认 为 在 治 疗 肿 瘤 和 其 他 疾 病 方 面 有 着 光 明 的 应 用 前 景 ［１］。 最 初 人 们 认 为 ＲＮＡｉ 需 要 ｓｉＲＮＡ 和 靶 ｍＲＮＡ 在 序 列 上 高度一致才能实现， 因而最初所观测到的一些脱靶 基因沉默都被当作不合理的事件给忽略掉了。 Ｊａｃｋｏｎ 等 人 利 用 基 因 表 达 切 面 研 究 人 体 细 胞 内 ｓｉＲＮＡ 引 导 的 基 因 沉 默 的 特 异 性 性 质 ， 得 到 的 转 录 剖 面 显 示 出 ｓｉＲＮＡ 特 异 信 号 而 不 是 靶 特 异 信 号 ， 其 中 包 括 拥 有 少 于 １１ 个 连 续 核 苷 酸 与 ｓｉＲＮＡ 一 致 的 非 靶 基 因 直 接 沉 默 ［２］。 在 使 用 ＲＮＡｉ 技 术 识 别 人 类 低 氧 诱 导 因 子 （ Ｈｙｐｏｘｉａ －ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ －１ ， ＨＩＦ －１ ）
SiRNA研究进展
SiRNA研究进展摘要：小分子干扰RNA是外源性双链RNA 的加工产物，在细胞内能介导RNA干扰效应，识别特异性mRNA，沉默同源基因表达。
其特异性和高效性显示出很高的实用价值，siRNA已成为许多疾病潜在的治疗手段。
对于siRNA的应用，尽管还需要在减少非特异反应,发掘高效递送载体，应对新的基因变异等方面进行深入研究，但其可望在抗病毒、肿瘤治疗和癌症治疗等许多领域发挥治疗作用。
关键词：小分子干扰RNA，RNA干扰，基因治疗，递送载体Abstract: Small interfering RNA ( siRNA ) is the processing product of exogenous double strand RNA( dsRNA ). siRNA mediate the RNA interference( RNAi ) , induce the degradation o f endogenous mRNA with homology showing high specificity and thus generate excited potential of therapeutic application . Although the obstacles including reduce non-specific effect establish high-efficient delivery system and facing the new mutation are needed to harnessed , recent preclinical studies suggest that siRNA hold great promise for the treat ment of various diseases.Key words:SiRNA, RNAi, gene therapy, delivery carriers1 SiRNA简介及RNAi作用机理SiRNA是一种小RNA分子（21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA 具有特异性的酶）加工而成。
纳米材料转运siRNA在肿瘤治疗中的研究进展汇总
纳米材料转运siRNA在肿瘤治疗中的研究进展摘要RNA干扰及其作用机制被发现以来，外源性的小干扰RNA(siRNA)已广泛地用于从基础研究到临床实践的很多领域。
然而，如何有效地、特异地将siRNA转运至靶细胞始终是使用者关注的重点，并已逐步成为siRNA应用于临床治疗的瓶颈问题之一。
虽然基于病毒载体的RNA 干扰既具有靶向性也显示出高转染效率，但病毒可能引起突变或者免疫原性等问题。
纳米材料是典型的非病毒载体，尺寸小、易修饰，而且能够有效携带siRNA进入细胞并诱导RNA干扰。
近年来，人们利用siRNA研究癌基因的功能，在癌症治疗方面取得了重大进展。
本文回顾了纳米材料转运siRNA在癌症治疗领域相关研究。
关键词：纳米材料，siRNA，siRNA转运，RNA干扰1998年Fire等人发现在秀丽隐杆线虫中进行反义RNA抑制实验时，作为对照加入的双链RNA相比正义或反义RNA显示出更强地特异性阻断相应基因表达的效果，并且将这种现象命名为RNA干扰[1]。
2001年，Elbashir等将人工合成的21个核苷酸的双链RNA导入到哺乳细胞中，同样发现了这种序列特异性地阻断基因表达的RNA干扰现象[2]。
自从RNAi发现以来，制药公司对siRNA药物的研发热情空前高涨，siRNA 药物在基因疾病、艾滋病、肿瘤等人类目前束手无策的疾病上显现出极大的应用潜力。
短短十几年，人们已经利用siRNA 作为药物治疗多种疾病。
本文总结了最近纳米材料转运siRNA在癌症治疗领域的相关研究。
首先，简单介绍了siRNA的作用机制及其在癌症治疗方法的发展；然后，介绍了无机及有机纳米材料转运siRNA的研究工作；接下来，介绍了纳米材料转运siRNA在临床治疗中的应用；最后，对纳米材料转运siRNA在癌症治疗领域应用的挑战和前景进行了展望。
siRNA作用机制及其癌症治疗潜力长的双链RNA被Dicer酶剪切成21-23个核苷酸组成的双链RNA 或者直接导入人工合成的siRNA后，与细胞质中的若干个蛋白组成的沉默复合体(RNA.induced silencing complex，RISC) 结合，并且RISC中的Argonaute 2蛋白将siRNA解旋成单链，其正义链被剪切下来并在细胞质中被降解掉。
siRNA的名词解释
siRNA的名词解释siRNA（short interfering RNA），也称为短干扰RNA，是一种短小的双链RNA分子，通常由21到23个碱基对组成。
与其它类型的RNA分子不同，siRNA在细胞内发挥着关键的调控作用。
在过去的几十年里，科学家对siRNA进行了广泛的研究，并且已经发现了许多关于siRNA的重要发现。
1. siRNA的发现和起源siRNA最早是在1998年由美国的科学家发现的。
当时，他们发现引入双链RNA分子到寄生虫的细胞中，能够抑制特定基因的表达。
这个发现引起了科学界的广泛关注，并且开创了RNA干扰研究的新领域。
之后的研究表明，siRNA并不仅存在于寄生虫中，而且在许多其他的生物中也有广泛存在。
这些研究揭示了siRNA起源的普遍性和重要性。
2. siRNA的作用机制siRNA发挥作用的机制可以分为两个阶段：siRNA的合成和siRNA的靶向降解。
首先，siRNA通过一个复杂的合成过程来产生。
通常，siRNA是由一种酶（Dicer 酶）切割长的双链RNA前体，形成短双链RNA。
然后，短双链RNA被一个蛋白质复合体（RNA诱导沉默复合体）识别。
该复合体将siRNA中的其中一个链条加载到复合体中，并将其用作导向靶标基因降解的模板。
一旦siRNA和复合体形成，它们会与目标mRNA相互作用。
通常情况下，siRNA与mRNA的特定部位产生互补配对，形成siRNA-mRNA复合体。
这个复合体随后会被其他蛋白质复合体（RNase H和Exonuclease）识别和降解，以此来抑制目标mRNA的翻译和功能。
通过这种机制，siRNA能够选择性地沉默或抑制目标基因的表达。
这使得siRNA成为一种非常有潜力的生物分子工具，在基因功能研究、疾病治疗和生物技术应用等方面有着广泛的应用前景。
3. siRNA在基因功能研究中的应用由于siRNA能够有效地沉默特定基因，它被广泛应用于基因功能研究中。
科学家可以设计并合成特定的siRNA分子，用于沉默感兴趣的基因。
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在此次研究中，我们使用一个修饰过的人工合成的tasiRNA (syn-tasiRNA)系统来检测对tasiRNA形成很重要的T AS转录本的特征。
不可译性能促进tasiRNA的形成，非编码序列能用来人工合成T AS基因（Montgomery et al., 2008b）。
然而翻译是怎样影响tasiRNA形成的还没有被系统的研究出来。
通过将一段syn-tasiRNA cassette插入到编码区和编码蛋白质的基因（HT A6–GFP）的3`UTR不同位点，我们确定了翻译是怎样抑制tasiRNA形成的。
结果与之前的预测恰恰相反，结果表明翻译能促进tasiRNA的形成。
当syn-tasiRNA cassette 插入到紧跟终止密码子之后（construct B），能观察到tasiRNA合成的最高的效率。
与之作对比，将syn-tasiRNA cassette插入到终止密码子下游的16nt处（construct C）能够引起tasiRNA合成的大幅度降低。
预测到绑定到3`UTR前面的15nt的RISCs仍然在核糖体途径中（Grimson et al., 2007; Bartel, 2009）。
在这种意义上说，核糖体将会到达与重组体B 的转录本绑定的miR173-RISCs，而对于重组体C的转录本，核糖体在到达miR173靶位点边缘之前会游离出来。
尽管确切的机制还是未知的，翻译机制和与miR173关联的RISCs 之间的相互作用可能在将3`切割产物加工进入tasiRNA过程中有正调控作用。
当终止密码子和miR173靶位点之间的距离增加时，tasiRNA的形成会降低，当距离增加到13nt时会达到一个稳定的水平。
这与之前发现的16nt稍微有点不同(Grimson et al. , 2007;Bartel, 2009)。
最近一个使用全基因组核糖体足迹分析（Ingolia et al., 2009）表示核糖体能到达大约终止密码子之后7-10nt。
这些新数据与我们的观察结果相一致。
最近研究发现真核mRNAs的最后大约50个密码子翻译效率最高(T uller et al., 2010)。
这表明如果靶位点放置到这些位点核糖体有更好的机会来与miR173关联的RISC复合体相互作用。
如果miR173的靶位点放在开放阅读框的中间（就像重组体A一样）核糖体几乎没有机会与miR173关联的RISC复合体相互作用。
这种推测有助于解释为什么将syn-tasiRNA cassette插入到开放阅读框中间（重组体A和B+bT AG）效率会降低。
内生的T AS基因为什么都是非编码的，这个问题促进我们去分析被miR173靶向的4个T AS转录本。
我们发现每个转录本都有一个很短的开放阅读框(132–177 nt)，miR173的靶位点靠近终止密码子（终止密码子上游14–23 nt）(Figure S8)。
这表明翻译涉及到miR173引导的从内生的T AS 基因的tasiRNA的形成。
然而，没有试验证据表明这些内生的短的开放阅读框能被翻译。
翻译是否对任何内生的T AS基因有影响仍需检测。
此外，我们实验中用的过表达系统可能诱导次级siRNA的形成。
以后的试验将设计成检测tasiRNA形成和核糖体/翻译活动的直接关联。
导入不成熟的密码子能够显著减少tasiRNA的形成。
这个观察结果与矮牵牛花协同抑制研究中观察的结果非常相似(Napoli et al., 1990; Que et al.,1997)。
协同抑制指的是与一个内生基因相应的一段编码序列的过表达导致转基因和内生基因都沉默的现象。
作者发现早期的错误密码不会影响转基因的丰富度，但是他们能够显著减少协同抑制的频率和程度。
被未知的miRNA或siRNAs所靶向的转基因mRNA可能会诱导tasiRNA的形成，并且能够靶向和使内生基因沉默。
当早期的错误密码子被诱导，tasiRNA的形成受损，将会导致协同抑制水平的下降。
支持这种可能性的是，在矮牵牛花的协同抑制过程中能够检测出phased siRNAs(De Paoli et al., 2009)。
一个有趣的现象是与表达重组体B的幼苗相比在表达重组体C,D或B+T AG的转基因幼苗中tasiRNA形成的抑制是与3`切割产物的过度积累有关的。
这表明miR173引导的切割过程和把3`切割产物加工进入到tasiRNA是两个分离的过程。
被miR173所联合的RISC 的切割过程并不是把3`切割产物加工进入tasiRNA形成途径所必须的。
3`切割产物的积累可能也会指示在5 `→3`核酸外切酶XRN4的消化吸收过程中对5`末端的保护(Souret et al., 2004; Valencia-Sanchezet al., 2006).这个保护过程的效果是与功能性的靶位点与miR173末端之间表现出完美的互补性的观察结果是相关的。
当靶位点突变成能诱发与miR173在末端
的错配（像是173mTb和173mTc）3`切割产物和tasiRNA都没有积累。
这可以解释3`切割产物由于错配而不被保护，反而很快的被降解，因此能够阻止它们加工进入到tasiRNA的可能性。
以前就知道把5`切割产物加工进入次级siRNA需要miR171的3`末端和它的靶基因的完美的互补(Moissiardet al., 2007)。
在大多数植物miRNA和他们的靶基因之间呈现出高度保守的错配(Ronemuset al.,2006)。
这种错配在alignments末端的频率多于中间。
这种高度保守的错配的可能的作用是能阻止切割产物加工进入到siRNAs。
再加上还需要22 nt sRNA的引发，这就解释了为什么大多数的miRNA靶向的转录本不能产生tasiRNA。
这些观察结果可以暗示在种间形成的杂交生物体和异源多倍体中的次级siRNA的形成。
在有分化的基因的植物中，次级siRNA的形成可能会由于在诱导siRNA或靶转录本中序列的变化而被干扰(Haet al., 2009)。
Syn-tasiRNA被提议作为一个有用的RNA干涉的工具(Montgomeryet al., 2008b)，但是其效率仍待提高。
我们使用据Montgomery et al., (2008b)报道的相同的在syn-tasiRNA cassette 中的miR173靶序列，结果是tasiRNA靶向相同的PDS3 mRNA.然而我们研究中黄化现象和PDS3 mRNA降低的效率显著地提高。
大多数T1幼苗在真叶出现之前完全黄化，类似于pds3突变体(Qin et al., 2007)。
三个可能的原因被认为是有助于更高的效率。
（Ⅰ）一个很强大的35s的启动子（Ⅱ）一个能利用烟草蚀刻病毒的翻译链来增强翻译过程的编码蛋白的基因(Carrington and Freed, 1990)更有效率的syn-tasiRNAs（Ⅲ）。
综上所述，这次研究的结果对使用tasiRNAs设计有效的RNA干涉策略时很有价值的。