不同方法提取谷胱甘肽的比较
不同方法提取谷胱甘肽的比较
不同方法提取谷胱甘肽的比较实验一不同方法提取谷胱甘肽的比较一、实验目的1、掌握从干酵母中粗提谷胱甘肽的各种方法。
2、掌握还原型谷胱甘肽定量的方法。
二、实验原理谷胱甘肽是种重要的三肽，以还原型（GSH)和氧化型（GSSG)广泛的存在于动、植物及微生物。
在生物体内起作用的主要是GSH，是细胞内主要的还原性物质，能保护细胞免受氧化性、毒害性化合物和辐射的伤害，还是酶的辅因子。
GSH在临床上是重要的解毒药物。
谷胱甘肽是小分子物质，水中溶解度较大，细胞表面出现裂缝就能分散到溶剂中，故可用一些温和的方法提取。
本实验采用热处理、冰冻处理、酸处理、有机溶剂处理等方法提取酵母细胞中的谷胱甘肽，比较最后的得率，探讨各种提取方法的优点和缺点。
三、实验器材、材料和试剂1、器材冰箱，离心机，水浴锅，电炉，滴定管，烧杯，玻棒，研钵。
2、实验材料活性干酵母，2%偏磷酸，5%碘化钾，0.0001mol/l碘酸钾溶液，淀粉指示剂，乙酸：乙醇（2:1）,36%乙酸溶液。
四、实验步骤1、热水抽提：1g干酵母与5ml水混合，加15ml沸水，置100℃水浴保温10min，立即放入冰水速冷，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V1。
2、冷冻研磨后有机酸搅拌提取：1g干酵母先在研钵中研细，与10ml水混合，-20℃冷冻成半固体状，研磨5min转入小烧杯，加10ml 36%乙酸搅拌15min，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V2。
3、酸热处理：1g干酵母加20ml2%偏磷酸，60℃水浴中搅拌抽提15min，置冰水速冷，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V3。
4、有机混合液处理：1g干酵母加20ml有机混合液（甲酸：乙醇=2：1），室温搅拌抽提15min，置冰水速冷，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V4。
5、碘量法测定：取5ml待测样品，置于250ml锥形瓶中，加入5ml2%偏磷酸溶液、1ml5%碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂，用0.0001mol/L的碘酸钾滴定至溶液由无色变为蓝色为止。
还原型谷胱甘肽
还原型谷胱甘肽在抗辐射上的应用
辐射对生物体的危害较大，长期接受射线辐照，容易引起头昏乏力、记忆 力减退，心悸失眠多梦，毛发脱落，皮肤干燥，骨关节酸痛，晶状体混浊、 肝脏肿大、齿龈出血、咳嗽等。 还原型谷胱甘肽是一种内源性放射防护物 质，含量高，其放射敏感性差；含量低，其放射敏感性强。原因是由于还原 型谷胱甘肽本身是一种射线保护剂，它可使射线通过直接作用和间接作用在 生物体内产生高活性的各种自由基，通过还原型谷胱甘肽作用后而淬灭。
3.还原型谷胱甘肽的应用及市场前景
谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓 衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。
一 临床医药中的应用
二 在抗辐射上的应用
三 食品中的应用
GSH的应用
四 化妆品中的应用.
还原型谷胱甘肽在临床药物上的应用
目前，已人工研制开发出了谷胱甘肽药物，广泛应用于临床，除利用其 巯基以螯合重金属、氟化物、芥子气等毒素中毒外，还用在肝炎、溶血性疾 病以及角膜炎、白内障和视网膜疾病等，作为治疗或辅助治疗的药物。近年 来，西方科学家，尤其是日本学者发现谷胱甘肽具有抑制艾滋病毒的功能。 最新研究还表明，GSH能够纠正乙酰胆碱、胆碱酯酶的不平衡，起到抗过敏 作用，还可防止皮肤老化及色素沉着，减少黑色素的形成，改善皮肤抗氧化 能力并使皮肤产生光泽。
还原型谷胱甘肽在食品中的应用
GSH广泛应用于食品领域，如加入酸奶和婴儿食品起类似维生素C的稳定作 用；防止水果罐头水果褐变；在面制品中起还原和强化氨基酸作用；缩短面 包混揉时间；GSH在与谷氨酸钠、核酸系呈味物质或其混合物共存时具有肉 类风味；GSH可抑制肉食类、鱼类和海鲜类食品的核酸分解，延长保鲜期以 及提高奶酪质量，防止酪蛋白褐变。
谷胱甘肽简介
谷胱甘肽之答禄夫天创作1.2.界说谷胱甘肽（glutathione GSH） CAS号：70-18-8.谷胱甘肽是一种存在于自然界中的氨基酸复合物,由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸等三种氨基酸组合而成的寡肽.谷胱甘肽在体内以两种形态存在,即还原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione,简称GSSG）.通凡人们所指的谷胱甘肽是还原型谷胱甘肽.还原型谷胱甘肽很容易被氧化,两分子谷胱甘肽的活泼巯基氧化脱氢后以二硫键相连获得的二聚体,即是氧化型谷胱甘肽.其中只有还原型谷胱甘肽才具有生理活性,而生物体内的氧化型谷胱甘肽需经还原后才华发挥生理功能.3.结构和理化性质谷胱甘肽是一种白色晶体,化学名为γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸,其结构如图1所示.相对分子质量为307.33,熔点是192～195 °C（分解）,等电点为 5.93.比旋光度[α]D20为+17.60°(C=0.05,H2O),易溶于水、稀醇、液氨和二甲基甲酰氨,不溶于乙醚和丙酮.谷胱甘肽固体较为稳定,而水溶液在空气中易被氧化,谷胱甘肽在高水分活度下不容易保管,只有将水分活度控制在0.3以下才华长期稳定保管.4.生理功能谷胱甘肽是细胞内存在最丰富的小分子硫醇类化合物,其分子中含有一个特异的γ-肽键,由谷氨酸的γ-羧基与半胱氨酸的α-氨基缩合而成,而且半胱氨酸侧链基团上连有一个活泼巯基,是谷胱甘肽许多重要生理功能的结构基础.4.1抗氧化作用还原型谷胱甘肽结构中含有一个活泼的巯基—SH,易被氧化脱氢.它在体内能够呵护许多卵白质和酶等分子中的巯基不被如自由基等有害物质氧化,让卵白质和酶等分子发挥其生理功能.同时清除自由基.机体内新陈代谢发生的许多自由基会损伤细胞膜,毁坏免疫系统,侵袭生命年夜分子,增进机体衰老,并诱发肿瘤或动脉粥样硬化的发生.由此,谷胱甘肽具有抗衰老和强化免疫系统等作用.4.2整合解毒作用谷胱甘肽半胱氨酸上的巯基为其活性基团（故谷胱甘肽常简写为G-SH）,易与碘乙酸、芥子气（一种毒气）、铅、汞、砷等重金属盐或致癌物质等相结合,并增进其排出体外,起到中和解毒作用.4. 应用4.1 谷胱甘肽在临床上的应用谷胱甘肽在临床上有广泛的作用,对细胞有呵护作用,可防止红细胞溶血,从而减少高铁血红卵白的损失；抑制脂肪肝的形成,改善中毒性肝炎和感染性肝炎的症状；对丙烯腈、氟化物、一氧化碳、有机溶剂、重金属等中毒具有解毒作用；对缺氧血症的不适、恶心、呕吐、瘙痒等症状以及由于肝脏疾病引起的其它症状具有缓解作用；维持乙酰胆碱,胆碱脂酶的平衡,起到抗过敏作用；对放射性治疗、放射性药物、肿瘤药物引起的白血球减少以及由于放射性治疗或药物引起的骨髓组织发炎等能起到呵护作用；可以抑制进行性白内障及控制角膜和视网膜疾病的发展；可以防止皮肤色素堆积,改善皮肤光泽；最近发现谷胱甘肽具有抗艾滋病病毒的功效.4.2 谷胱甘肽在食品工业中的应用谷胱甘肽现在已广泛应用于食品加工的各个领域,在调味食品中,谷胱甘肽与L-谷氨酸钠、核酸等腥味物质或它们的混合物共存时,具有很强的肉类风味；将谷胱甘肽用于肉食类、鱼类和海鲜类食品中可抑制核酸分解、强化食品风味、延长保鲜期；在奶制品中添加谷胱甘肽可强化风味、提高奶酪质量,防止酪卵白的褐变；将谷胱甘肽加入酸奶和婴儿食品中相当于维生素C起稳定作用；由于谷胱甘肽具有氧化还原性,因此将谷胱甘肽加入面制品中,在起到还原作用的同时还能强化氨基酸；利用谷胱甘肽能够防止色素堆积的作用,在水果罐头中加入谷胱甘肽可防止水果的褐变；将它制成份歧类型的功能性食品,如将其添加到饮料、嗜好品（糖果）、乳制品、面类制品和发酵食品中作为保健和营养强化剂,还可用于孕妇、哺乳幼儿、病人的口服保健品,在日本,谷胱甘肽被认为是21世纪最有希望的保健食品之一.4.3 谷胱甘肽在植物生产中的应用谷胱甘肽在饲料工业应用尚较少,仅有少量报道：GSH用于提高牛冷冻精液的活力和受胎率；添加蛋氨酸维持血浆中的GSH水平可增强雏鸡抗球虫感染能力,解除黄曲霉毒素B1对雏鸡的毒性；解除水产植物因一些毒素引起的中毒症.GSH具有清除自由基和解毒,增进氨基酸转运,呵护胃肠黏膜,提高免疫力,介入卵白质合成与降解,调节基因的复制、转录,调节细胞生长等多种生物学功能.因而,GSH在植物生产中将具有良好的应用前景.5.制备谷胱甘肽的制造方法主要有溶剂萃取法、化学合成法、生物发酵法和酶法.早期谷胱甘肽生产年夜多采和化学用溶剂萃取法合成法,目前主要以生物发酵法(尤其是酵母发酵法)生产制取.化学合成法和酵母发酵法生产谷胱甘肽现已工业化,酶法生产正在广泛研究,还没有工业化生产.5.1萃取法萃取法主要以富含GSH的动、植物组织和酵母为原料,通过添加适当的溶剂或结合淀粉酶、卵白酶处置,再分离精制而成.植物种子胚芽,动、植物组织,酵母都可作为原料进行提取,但以酵母作原料居多.萃取法生产谷胱甘肽中所用的酵母一般都未经选育和遗传特性上的改造,谷胱甘肽含量很低,仅为0.5%～1.0%(干重),加上生产步伐繁杂,使得该法总收率很低,若用作药品或试剂,还需离子交换、凝胶过滤等步伐进一步分离纯化.萃取法生产谷胱甘肽已被化学合成法和生物发酵法所替代.5.2化学合成法自还原型谷胱甘肽被发现和说明化学结构以后,就有学者致力于其化学合成的研究,化学合成法制备谷胱甘肽所使用的主要原料有谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸.目前谷胱甘肽的化学合成法生产工艺较成熟,但它存在本钱高、反应步伐多、反应时间长、把持复杂等缺点,而且发生的消旋体需要光学拆分,分离十分困难,造成产物纯度分歧,以及存在着环境污染问题.5.3 酶法酶法合成谷胱甘肽是以L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸为底物,需要两个合成酶分步完成,第一步是在谷氨酸的γ-羧基与半胱氨酸的氨基形成肽键,此反应由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)催化；第二步反应是在γ-谷氨酰半胱氨酸的半胱氨酸真个羧基与甘氨酸的氨基之间形成肽键,由此获得谷胱甘肽,此反应由谷胱甘肽合成酶(GSHⅡ)催化.这两步反应都需要添加三磷酸腺苷（ATP）即提供能量才可合成谷胱甘肽.其反应过程如图2所示.每合成1 mol的谷胱甘肽需要消耗2 mol的ATP,因此,ATP的提供或循环再生是固定化酶生产GSH的关键,在谷胱甘肽合成过程中需要一个提供ATP或再生ATP的有效系统.5.4发酵法由于生物发酵生产谷胱甘肽与早期萃取法、化学合成法及酶法相比具有明显的优越性,如反应条件温和、反应步伐简单、本钱低、转化效率高、生产速率快等,是今后生产谷胱甘肽的主要趋势,因此越来越受到科学家们的重视.生物发酵法生产谷胱甘肽的工艺经过学者们的努力不竭获得改进,已成为现今生产谷胱甘肽的主要方法,也是最具潜力的方法.6.市场前景目前,谷胱甘肽广泛应用于护肝、护眼医药领域和食品、保健品、化妆品行业,其涉及的终端消费规模超越百亿元,而且因为其生理活性不竭被发现,仍然以很快的速度在增长,被市场公认为是下一个疯狂的辅酶Q10.在我国,全国重点城市典范医院用药金额前100位药品排序中,有6种多肽药物榜上有名,其中谷胱甘肽名列第93位.资料显示,全世界谷胱甘肽的年产量在150吨左右,单价800～1000美元/公斤,年销售额10～15亿美元.主要生产厂家有Roche 、Fluka、J.T.BAKER、BHD、SIGMA、和光纯药、IMMNOTEC RESERCH LTD、KRAFT FOOD LTD、KYOWA等.国内主要依靠进口,如复华药业、昆明积年夜制药和重庆药友等,其价格年夜约在5000～6000元/KG.也有个别厂家采纳化学法生产,如浙江东华医药化工有限公司,汕头化工有限公司用合成法少量生产谷胱甘肽.2002年谷胱甘肽国内市场销售额为8.02亿元；2003年谷胱甘肽全国市场销售额为13.55亿元,同比增长69.05%；2004年上半年谷胱甘肽全国市场销售额为8.39亿元,比上年同期增长43.11%.纯真国内几个制药企业的需求,估计月需求量就在3～4吨左右.另有资料显示：1.目前,国内市场上还原型谷光甘肽的原料药价格在4000元/kg 以上,而谷胱甘肽的生产本钱约1500元/kg左右.2,进口谷胱甘肽,试剂级 46000元/公斤；药用9000元/公斤.6结语尽管谷胱甘肽风光无限,可是其产能发展却受到诸多制约,其中最主要是来自于原料药技术方面的障碍.谷胱甘肽本钱昂贵的发酵生产技术一直被日本协和发酵所垄断,化工合成技术则很难将本钱降低下来,中国国内各年夜科研机构和生产厂家对这两种工艺路线投入了年夜量人力物力做开发,收效一直不甚理想,年夜部份到了中试阶段就到达瓶颈,无法放年夜到规模生产,巨年夜的资金缺口也令很多人止步不前.另外,尽管国内萃取法少量生产谷胱甘肽在我国早有胜利先例,但生产工艺落后,规模小,产量低,质量差,目前比力流行的超临界萃取技术尚未获得广泛应用.目前,国内市场几乎全部被日本协和集团垄断,招致国内谷胱甘肽的价格居高不下（作为原料药的价格在250～300美元/kg）,也使该产物推广应用受到很年夜的限制.我国每年花费约4200万美元进口谷胱甘肽.实现GSH的国产化,不单能填补我国在这一领。
食用菌中谷胱甘肽的测定
食用菌中谷胱甘肽的测定谷胱甘肽是一种重要的抗氧化物质，被广泛应用于食品工业中。
食用菌是一类含有高丰富谷胱甘肽的食材，因此测定食用菌中谷胱甘肽的含量具有重要的意义。
本文将介绍几种常用的测定食用菌中谷胱甘肽的方法。
一、硫巴比妥酸法测定谷胱甘肽含量硫巴比妥酸法是目前测定谷胱甘肽含量最常用的方法之一。
该方法的原理是谷胱甘肽与硫巴比妥酸在碱性条件下反应生成黄色产物，通过测定产物的吸光度可以间接测定谷胱甘肽的含量。
具体操作步骤如下：1. 将食用菌样品粉碎并称取适量，加入酸性溶液中，破坏细胞结构释放出谷胱甘肽。
2. 加入碱性溶液和硫巴比妥酸，使谷胱甘肽与硫巴比妥酸反应生成黄色产物。
3. 使用分光光度计测定产物的吸光度，利用标准曲线计算样品中谷胱甘肽的含量。
二、高效液相色谱法测定谷胱甘肽含量高效液相色谱法是一种常用的分离和定量化合物的方法。
该方法的原理是利用色谱柱对样品中的谷胱甘肽进行分离，通过检测谷胱甘肽的峰面积或峰高来定量谷胱甘肽的含量。
具体操作步骤如下：1. 将食用菌样品制备成适宜的提取液，经过离心等处理步骤，获得待测样品。
2. 使用高效液相色谱仪，将待测样品注入进样器，经过一定的流动相条件下，在色谱柱中进行分离。
3. 通过检测谷胱甘肽的峰面积或峰高，利用标准曲线计算样品中谷胱甘肽的含量。
三、氧化还原法测定谷胱甘肽含量氧化还原法是一种直接测定谷胱甘肽含量的方法。
该方法的原理是利用谷胱甘肽与还原剂在适宜的条件下发生氧化还原反应，通过测定反应前后还原剂的含量变化来确定谷胱甘肽的含量。
具体操作步骤如下：1. 将食用菌样品制备成适宜的提取液，通过离心等处理步骤，获得待测样品。
2. 将待测样品与还原剂在适宜的条件下反应，使谷胱甘肽发生氧化还原反应。
3. 通过测定反应前后还原剂的含量变化，计算谷胱甘肽的含量。
在测定食用菌中谷胱甘肽的含量时，需要注意样品的制备过程，确保提取到的谷胱甘肽是代表样品中真实含量的。
同时，选择合适的测定方法，准确、快速地测定谷胱甘肽含量，有助于评估食用菌的品质和营养价值。
谷胱甘肽
GSH在美容上的应用
• 白荻多肽，采用了肌肤色素研究中最新的科学技术,研发出独家 “谷胱甘肽与高浓度苦参精华”以及其它一些独特成份的多重效 果配方,可由内而外双重锁定麦拉宁母细胞,让女人恢复珍珠般的 亮白肤质,并且能够淡化顽固的色斑。 • 白荻多肽就像是一把精密的高端“美白锁”，能够紧密地锁住洛 氨酸酶，阻止洛氨酸酶的渗透，以此来达到抑制黑色素形成的目 的。 • 谷胱甘肽，风行欧美50年，堪称世纪美白祛斑经典。全面补充白 荻多肽和苦参精华，对祛除皱纹、增加肌肤弹性，收缩毛孔、淡 化色素,全身美白有极好的功效. • 美白针由传明酸、VitC、左旋谷胱甘肽、VitB等组成。其中左旋 谷胱甘肽也叫还原型谷胱甘肽，有的配方中不是还原型的就没有 效果。
前体物质的添加：在前体氨基酸中, 半胱氨酸为GSH合成的关键氨基酸, 它的
存在能明显提高细胞内GSH 含量及GSH 的比生产速率, 但阻碍细胞量的增加。 在发酵过程中半胱氨酸的补加策略应以尽量减少对生长的抑制为原则。
谢谢大家
· 发酵法
谷胱甘肽在1888年，由deRey-Pailhade从酥母中分离出谷胱甘肽以后，谷 胱甘肽从酵母中提取的工艺也越来越成熟，并且已经成为目前生产谷胱甘肽 普遍采用的方法。
酵母发酵法生产谷胱甘肽
• 工艺流程图 诱变剂→酵母→高产酵母→热水抽提→离心 →调PH值→树脂吸附→酸洗脱→新鲜的CuO 沉淀→离心沉淀物→H2S置换→离心过滤→ 浓缩→脱色→喷雾干燥→成品
• 谷胱甘肽分子量为307．33，熔点189～193℃(分解)， 晶体是无色透明细长柱状(板状)，等电点(PI)为5．93， 成品见光易分解，易氧化。 在氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽中，只有还原型谷 胱甘肽才具有生理活性，而生物体内的氧化型谷胱甘肽 需要还原后才能发挥其重要的生理功能。因此，我们在 提取谷胱甘肽时，可以在溶液中加入具有强还原性的物 质如维生素C等，当存在这些强还原性的物质时可以保 护谷胱甘肽不容易被氧化。
还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定
还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)的测定关键词：还原型谷胱甘肽GSH氧化型谷胱甘肽GSSG测定2009-04-24 00:00 来源：互联网点击次数：6147GSH和GSSG 参照Anderson等（1992）。
取0.5 g样品，加入3 mL冰冷的6%的偏磷酸（含1 mmol•L-1 EDTA ，pH 2.8），冰浴研磨，匀浆液以20,000 g，4 ℃离心15 min，取上清液来马上测定GSH和GSSG的含量或储存在-20 ℃下等待测定。
总的GSH和GSSG含量测定如下：200 μL提取液加 1.2 mL反应液包含400 μL反应液1（110 mmol•L-1 Na2HPO4•7H20，40 mmol•L-1NaH2PO4•H2O，15 mmol•L-1EDTA，0.3 mmol•L-15,5‘-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）DTNB，0.04% BSA）、320 μL反应液2 （1 mmol•L-1 EDTA，50 mmol•L-1 imidazole 咪唑solution and 0.02% BSA）、400 μL反应液3（5% Na2HPO4，pH 7.5的溶液稀释50倍）、80 μL 9.0 mmol•L-1 NADPH。
测定OD412下的吸收值。
GSSG 含量测定如下：200 μL提取液加入1 mL的2-2乙烯嘧啶（稀释50倍）在25°C下水浴1 h再测定OD412下的吸收值。
GSH的含量可以从总的GSH和GSSG含量中减去GSSG含量获得。
GSH测定方法：取样品0.5 g，加入预冷的5%磺基水杨酸2.5 ml和少许石英砂，充分冰预研磨，转入离心管中，于4℃下20,000×g离心20min，将上清液分装，液氮冷冻后于-20℃保存或直接进行抗氧化剂分析。
取50 μL上清液，用5% 磺基水杨酸定容至100 μL （即加入5% 磺基水杨酸50 μL），加入24 μL 1.84 mol•L-1三乙醇胺triethlene diamine以中和样液，加入50 μL 10% 乙烯吡啶Polyvinyl pyridine （用70% 乙醇配制），25℃水浴1 h，以除去GSH，到时加入706 mL 50 mmol•L-1磷酸缓冲液，pH 7.5，内含2.5 mmol•L-1 EDTA，加入20 μL 10 mmol•L-1 NADPH 和80 μL 12.5 mmol•L-1 DTNB（二硫硝基苯甲酸），混匀，25℃保温10 min，到时加入20μL 50 U•mL-1 GR，总体积为1 mL，立即混匀，读出3 min时的OD值。
谷胱甘肽 (2)
1、简介谷胱甘肽是一种三肽(L - γ- 谷氨酰- L - 半胱氨酰-甘氨酸) 化合物,它广泛分布于动物、植物、谷物和油料种子中,它在细胞中的功能之一就是抵御各种毒素和致癌剂。
有研究表明:谷胱甘肽在小肠中能被完全吸收,并且某些上皮细胞能利用外源谷胱甘肽来去毒,这说明膳食中的谷胱甘肽决定着人体中细胞受损伤的程度。
除作为抗毒剂外,谷胱甘肽还对一些巯基酶有激活作用,可作为保护酶和其他蛋白巯基的抗氧化剂,在生物氧化、氨基酸转运、保护血红蛋白等过程中起一定作用。
另外,谷胱甘肽还具有抑制衰老,预防糖尿病、消除疲劳等作用。
最近研究还发现谷胱甘肽具有抑制艾滋病毒的作用。
因此,研究谷胱甘肽对人类的健康和生活具有重要的意义。
2、谷胱甘肽在自然界的分布谷胱甘肽在自然界中分布很广,主要存在于动物组织和血中,许多植物如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类等也含有,另外酵母中谷胱甘肽的含量也较高。
2 谷胱甘肽的特性及生理功能211 谷胱甘肽的特性谷胱甘肽分子量为307. 33 ,熔点189～193 ℃(分解) ,晶体是无色透明细长柱状(板状) ,等电点(PI) 为5. 93 ,成品见光易分解,易氧化,谷胱甘肽分子中有一特殊的δ- 肽键,即由谷氨酸的δ- COOH 与半胱氨酸的α- NH2 缩合而成,这样的肽键与蛋白质分子中的一个氨基酸中α- COOH 和另一个氨基酸中α- NH2 失水缩合而成的肽键显然不同。
由于谷胱甘肽中含有一个活泼的巯基极易被氧化,2 分子还原型谷胱甘肽(简称GSH) ,脱氢以二硫键( S S ) 相连便成为氧化型的谷胱甘肽(简称GSSG) ,所以谷胱甘肽可分为氧化型和还原型两大类,在生物体中起重要功能作用的是还原型谷胱甘肽。
2.2 谷胱甘肽的生理功能谷胱甘肽的生理功能主要表现在6 个方面:(1) 维持红细胞膜的完整性。
(2) 对于需要巯基的酶有保护与恢复活性的功能。
(3) 谷胱甘肽是多种酶的辅基与辅酶。
(4) 参与氨基酸的吸收及转运。
【doc】谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较、评价
谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较、评价第11卷第2期2003年6月中国临床营养杂志CHINESEJOURNALOFCLINICALNUTRITIONV o1.11.No.2June.20o3谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较,评价樊跃平于健春余跃张琳(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院外科,北京100730)综述?摘要谷胱甘肽是一种非常特殊的氨基酸衍生物,广泛存在于动,植物细胞,在生物体内有许多重要的生理作用.人类组织中GSH的浓度的研究还不广泛.谷胱甘肽的测定有许多方法,目前还没有一种既快速,稳定,特异,又十分灵敏,经济的测定方法.本文对谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法作一综述.关键词谷胱甘肽生理意义测定方法中图分类号Rl51.3文献标识码A文章编号1008—5882(2003)02-0136-04 PhysiologicalandClinicalSignificanceofGlutathioneandEvaluationofV ariousMeasurementsofGlutathioneFanY ue—pingY uJian-chunYuY ueZhangLin(PUMCHospital,CAMSandPUMC,Beijing100730,China) Glutathione(GSH)isaspecialderivantofaminoacid,presentsinmostplants,a nimalsandmicrobes,playsavitalroleinorganisms.Wehavenotwidelystudiedaboutthe GSHlevelinhumantissue.TherearevariousmeasurementsofGSH,bynow,wehavenotbuiltarap id,stable,specificandsensitivemeasurement.Thephysiologicalandclinicalsignificanceofglu tathioneandevaluationof variousmeasurementsofglutathionewerereviewed. Keywordsglutathione;significance;measurementC.,c2inNutr,2003,11(2):136—139谷胱甘肽的生理意义谷胱甘肽是由谷氨酸,半胱氨酸和甘氨酸形成的三肽化合物,广泛存在于动,植物细胞,并于细胞内合成l】],分为还原型谷胱甘肽(GSH)及氧化型谷胱甘肽(GSSG)两类,其中GSH含量占到约99.5%.谷胱甘肽是一种非常特殊的氨基酸衍生物,它的活性成分是半胱氨酸中的巯基,在谷氨酸与半胱氨酸之间存在一个不多见的.肽键,从而保护了GSH被许多肽酶的水解.1921年Hopkins首先发现了谷胱甘肽,1931年Rapkine 第一次报道巯基化合物的浓度在有丝分裂期间发生了变化,这个变化证实了SH/SS(氧化/还原)循环的存在,并提示巯基化合物可能具备一些基本的生物学功能.Baron经大量回顾,总结,于1951年应用资料外推法提出了”GSH激发SH.酶的活性同样在细胞内发生,是细胞呼吸的常规机制”.对GSH的主要研究工作由Krebs,Hems,Vina于20世纪60～70年代在牛津代谢研究实验室展开l2].GSH可于所有器官组织细胞内生成,尤其以肝脏的生成最重要;是细胞内含量最丰富的非蛋白巯基,能够于细胞内经过酶反应而合成.GSH的生理作用是多方面的,如氨基酸的转运,蛋白,核酸的合成,抗氧化作用,维持蛋白巯基的还原状态,亲电子异生化合作用,维持酶的活性状态,保证了单磷酸己糖的分流,保护细胞防止自由基及内毒素的损伤等等.禁食或应激初期,谷氨酸,半胱氨酸,蛋氨酸中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室;#通信作者住院医师,电话:010.65296024,传真010—65140698,电子邮件:*******************2期谷胱甘肽的生理意义及其各种测定方法比较,评价137的供给会受到干扰.肝脏GSH浓度水平不仅依赖GSSG(可由还原酶转化成GSH),而且还依赖肌肉,肠道器官的谷氨酸,半胱氨酸的储备,正由于这些储备,肝脏GSH水平升高,来保护脏器,组织免受应激状态下的氧化损伤.当病情进展时,GSH的合成下降,这是由于机体的氧化还原作用引起的.谷胱甘肽在临床上有广泛用途:作为抗氧化剂,可保护细胞膜,防止红细胞溶血及促进高铁血红蛋白的还原;对放射线,放射性药物或化疗所引起的白细胞减少等症状可起到保护作用;对缺氧血症,恶心及肝脏疾病所引起的不适具有缓解作用;可用于一氧化碳,重金属及有机溶剂中毒的解毒治疗.近几年还发现GSH可能具有抑制艾滋病病毒的功效.人类组织中GSH的浓度的研究还不广泛.国外文献报道人类肌肉组织GSH浓度为(1320±37)mo1每千克湿体重;国内文献报道血浆总谷胱甘肽浓度为4trmol/L.全血谷胱甘肽浓度为0.57mmol/L(500~mol/L一1000~mol/L),而谷胱甘肽几乎全部包含于血细胞,因此血浆浓度只有4.9I~mol/L-5.9~mol/Lt61.DeanP.Jones等报道健康人血浆GSH含量为(2.09+1.14)micomolar.肝脏被看作是谷胱甘肽代谢的中心器官,而血浆及红细胞中GSH 的浓度可以反映肝脏的GSH的合成能力.GSH与临床许多方面密切相关,对人体血浆,组织细胞中含量的测定,研究,可以提供我们关于细胞对氧化,应激的保护及反应状态的信息【3J,并且由于GSH和GSSG在细胞信号传递,基因控制,氧化还原反应和生物平衡方面的重要作用,细胞谷胱甘肽的精确测定是十分必要的【8】.作为机体内对抗氧自由基的一种重要的抗氧化剂,谷胱甘肽对于临床治疗具有重要意义,提供足够量的抗氧化剂能够改善患者的预后,明显降低危重病长时间的炎症反应.谷氨酰胺是合成谷胱甘肽的重要前体物质(可提供谷氨酸),目前已应用于临床(包括静脉及口服制剂).其作用之一,就是通过维持组织,细胞内谷胱甘肽水平从而保护组织细胞,达到免疫营养的目的1.谷胱甘肽的测定有许多方法,如酶循环法,流式细胞法,滴定法,电泳法和近些年发展的高压液相色谱法等,这些方法各有其优点,但也都有不足,目前还没有一种既快速,稳定,特异,又十分灵敏,经济的测定方法,谷胱甘肽的测定方法有待进一步的发展和完善.下面对目前常用的几种主要的测定方法做一介绍,比较和评价.谷胱甘肽测定方法酶循环法.其测定原理为氧化.还原反应:GSH被DTNB(5,5.dithiobis.2. nitrobenzoicacid;5,5.二巯基.2-硝基苯酸)氧化,生成GSSG和稳定的TNB(5-thio-2一nitrobenzoic acid;5-巯基.2-硝基苯酸);GSSG与GSSG还原酶及NADPH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)反应,还原生成GSH.在NADPH与GSSG还原酶维持GSH总量不变的条件下,GSH和DTNB反应生成TNB的速率与样本中总谷胱甘肽成正比.TNB于412nm波长处有最大吸光度,可以通过分光光度计来测定总谷胱甘肽水平(GSH+GSSG)il1].酶法测定谷胱甘肽,样本的制备要迅速,因为GSH很容易氧化而使其浓度降低.本法还可测定GSSG水平.酶循环法最初由Owen和Belcher提出,之后由Tietze和Griffith进行了改进【3】.酶循环法是一种灵敏,快速的方法I】u;其最大优点是灵敏度高,可测定含量仅0.1~mol/L的样品,回收率93%～106%. Manju等¨认为此方法灵敏度高,但特异性不高,这是由于DTNB可与许多含活性巯基基团物质反应.但此法不足之处在于其测定的是谷胱甘肽总量(GSH+ GSSG),不能区分GSH和GSSG;另外样本的准备也比较严格,要求控制采血至测定时间间隔在3min 内,否则将影响测定,使实际应用受到很大限制. MargaretA.Baker等将酶循环法与微量滴定板技术相结合,设计了一种快速,敏感,简便的测定大数量生物样本的GSH,GSSG的方法.其最大优点是可同时测定大量的样本.为了提高灵敏度,Tamara Mourad等n将酶循环法与生物发光检测技术相结合, 测定GSSG,灵敏度达pm(10)水平.高效液相色谱法(HPLC).HPLC是近年测定复杂生物样本中各种巯基物的最好方法ll”.HPLC过程是溶质在固定相和流动相之间由于分配系数,吸附能力,亲和力,分子大小不同,进行连续分离的过程.其试剂材料包括mBBr(monobromobimane;一溴化物)溶液,NEM(N-Ethylmorphline;N-乙基吗啡),标准GSH,标准半胱氨酸溶液,由两个M6000A泵组成的HPLC,721系统控制仪,710BWISP自动样品仪,420荧光测定仪,C18柱.实验过程包括诱导过程和HPLC过程.GSH和其它巯基物水平可通过标准曲线得到.中国临床营养杂志l1卷HPLC法优点是可以区分开GSH,GSSH及2O多种含巯基氨基酸衍生物.其不足是灵敏度不高,样本中GSH含量不得低于50I~mol/L;且样本的前处理过程耗时,测定大样本时不方便,所用的柱特殊.A.Rodrigueuz-Ariza等[141介绍了一种结合电化学法快速测定谷胱甘肽水平的方法.该法应用一套双通道电化学测定仪,可同时测定GSH,GSSG,还可测定PSSG(蛋白结合谷胱甘肽),具有高灵敏度,高选择性,高效的优点.A.M.Dipietra等[11将依他尼酸作为色谱前诱导物,应用HPLC法测定GSH及L一半胱氨酸,认为在灵敏度要求不太高的情况下,可应用依他尼酸,而且只需简单,基本的HPLC设备即可.Chung-shiY ang等[11介绍了一种将HPLC与微透析机联机测定谷胱甘肽.此法缩短了分析测定时间,简化了样本的准备过程,并提供了连续的监测.流式细胞仪法.应用染色剂标记GSH,形成GSH的荧光化合,同时使染色剂尽量对其他巯基物产生最小影响,以便判断染色背景的程度及其线形关系,根据GSH含量与荧光强度的一定的比例关系,从而得到GSH的值.试剂材料包括染色剂(monobromobimane4mmol/L,monoch]orobimane一氯化物4mmol/L,OPT O-酞基二醛100lxmol/L,mercuryorange汞橙100I~mol/L),流式细胞仪.其方法通过化学处理来标记,耗尽GSH,以产生染色背景;应用流式细胞仪,通过不同染色剂的不同波长范围来测定荧光度, 根据染色背景的程度,得到GSH的值.对GSH进行标记的最理想染色剂应具有很好的专一性,另外,要求能够进行定量分析测定.而这些染色剂的专一性是相对的,一个常见问题是它们还可标志细胞内的其他巯基物,尤其是蛋白巯基. Durand和Olive通过对流式细胞仪巯基染色探针的早期研究,表明monobromobimane对GSH具有合理的专一性.TreumerV alet研究了0-phthaldialdehyde (OPT),表明OPT同时与GSH与蛋白巯基结合形成荧光化合物.Rice介绍了monochlorobimane,目前来讲,这是一个最专一的GSH探针.OConnor介绍了mercuryorange,这个染色剂最初用于组织化学巯基染色,后来发现其与GSH反应快于与蛋白巯基反应,在控制的染色条件下具有一定的专一性.另一种染色剂是甲基氯荧光素酯和甲基氯伊红,在细胞内被酯酶水解,产生高分子荧光,在GSH-S转移酶作用下与GSH结合1.流式细胞仪的特点是在短时间内可获得大量数据,统计学意义明显,能进行多参数相关测定.另外,Manju等[121介绍了一种测定谷胱甘肽的特异,灵敏,快速的方法.其原理是GSH-S转移酶(GST)可使GSH与CDNB(1-chloro-2,4-dinitrobenz- ene)结合形成Dnp-SG(S-dinitrophenylglutathione), 而Dnp-SG于340nm处有最大吸光度.此法不需要酸化提取步骤,并且GSH可特异测定,而不受蛋白巯基或其他巯基的影响.综上所述,谷胱甘肽作为一种广泛存在于生物细胞,组织,机体中的特殊氨基酸,有着许多重要的生理作用,作为机体内重要的氧化物质,受到大家的普遍重视.目前对于谷胱甘肽的测定还没建立一个既十分灵敏,特异,又十分快速,稳定,经济的方法.谷胱甘肽的各种测定方法各有其优点,有的灵敏度高,有的快速可靠,有的可区分开各种成分;同时也存在各自的不足,有的样本准备过程复杂,有的测定各成分分离不佳,有的需要昂贵设备.一个快速,稳定,特异,灵敏,经济的测定方法,有待进一步建立.参考文献[1】AndersonME.Glutathione:anovervievofbiosynthesisand modulation[J】.Chemico-BiologicalInteractions,1998,111—112:1-14[2】V alenciaE,MD,MarinA,eto1.Glutathione-nutritional andpharmacologicviewpoints:PartI[J】_Nutrition,2001, 17:428.429[3】BakerMA,CemigliaGJ,ZamanA.Microtiterplateassay forthemeasurementofglutathioneandglutathionedisulfide inlargenumbersofbiologicalsamples[J1.AnalyticalBioch—emistry,1990,190:360—365[4】Jia-LiLuo,HammarqvistE,CotgreaveIA,eto1.Deter- minationofintracellularglutathioneinhumanskeletal musclebyreversed-phasehigh??performanceliquidchromato—graphy[J】.JournalofChromatographyB,1995,670:29—36[5】MeisterA,AndersonME.Glutathione[J】.Ann.Rev. 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实验一不同方法提取谷胱甘肽的比较
一、实验目的
1、掌握从干酵母中粗提谷胱甘肽的各种方法。
2、掌握还原型谷胱甘肽定量的方法。
二、实验原理
谷胱甘肽是种重要的三肽，以还原型（GSH)和氧化型（GSSG)广泛的存在于动、植物及微生物。
在生物体内起作用的主要是GSH，是细胞内主要的还原性物质，能保护细胞免受氧化性、毒害性化合物和辐射的伤害，还是酶的辅因子。
GSH在临床上是重要的解毒药物。
谷胱甘肽是小分子物质，水中溶解度较大，细胞表面出现裂缝就能分散到溶剂中，故可用一些温和的方法提取。
本实验采用热处理、冰冻处理、酸处理、有机溶剂处理等方法提取酵母细胞中的谷胱甘肽，比较最后的得率，探讨各种提取方法的优点和缺点。
三、实验器材、材料和试剂
1、器材
冰箱，离心机，水浴锅，电炉，滴定管，烧杯，玻棒，研钵。
2、实验材料
活性干酵母，2%偏磷酸，5%碘化钾，0.0001mol/l碘酸钾溶液，淀粉指示剂，
乙酸：乙醇（2:1）,36%乙酸溶液。
四、实验步骤
1、热水抽提：
1g干酵母与5ml水混合，加15ml沸水，置100℃水浴保温10min，立即放入冰水速冷，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V1。
2、冷冻研磨后有机酸搅拌提取：
1g干酵母先在研钵中研细，与10ml水混合，-20℃冷冻成半固体状，研磨5min转入小烧杯，加10ml 36%乙酸搅拌15min，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V2。
3、酸热处理：
1g干酵母加20ml 2%偏磷酸，60℃水浴中搅拌抽提15min，置冰水速冷，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V3。
4、有机混合液处理：
1g干酵母加20ml有机混合液（甲酸：乙醇=2：1），室温搅拌抽提15min，置冰水速冷，取10ml离心，取5ml上清滴定，得滴定体积V4。
5、碘量法测定：
取5ml待测样品，置于250ml锥形瓶中，加入5ml2%偏磷酸溶液、1ml5%碘化钾溶液和2滴淀粉指示剂，用0.0001mol/L的碘酸钾滴定至溶液由无色变为蓝色为止。
KIO3+5KI+6HPO3→3I2 +6KPO3 +3H2O
五、结果及分析
1.将各种方法所消耗的碘酸钾的体积数添入下表
2.比较本实验四种提取酵母中谷胱甘肽的方法的优缺点。
六、注意事项
1、待测定的谷胱甘肽提取液置4℃冰箱保存，防止氧化。
2、酸性溶液中，淀粉会水解，使滴定终点的颜色发生变化，故滴定操作要快速完成。