植物病毒病检测方法

植物病毒病检测方法

植物病毒病是农业生产上一种重要病害，严重影响农作物的产量和质量, 目前还没有1种治疗效果较理想的药剂，对发病植株做到早期诊断及提前检测就显得尤为重要。植物病毒学历经近百年的发展，植物病毒的检测方法与手段也在不断发展与改进。常用的方法有侵染力测定法、血清学方法、电子显微镜计数和分子生物学法等。

1.4.1侵染力测定法

侵染力测定法是将病毒样本接种在植物上，根据侵染力的大小定量。它的灵敏度在所有定量法中是比较高的，而且是其他定量法的基础。设计一种新的定量法，如果不经过侵染力的验证，将无法判断测定的是病毒或者是具有侵染力的病毒。侵染力测定法包括局部枯斑法、淀粉－碘斑法、系统感染率的测定法等。侵染力测定多用粗汁液来接种，为了避免抑制物质的作用和使半叶枯斑数目控制在一定范围，须用缓冲液稀释接种物。

局部枯斑法1929年F.O.Holmes发现TMV在心叶烟（Nicotiana glutinosa）接种叶片上引起局部坏死斑点，在一定的病毒浓度范围内，所产生的斑点数目与病毒浓度成正比例。这一发现成为病毒侵染性定量测定的基础（田波，1987）。所有机械传染的病毒都有可能应用局部斑点法，但实际上只有少数病毒具有可用于定量测定的局部斑寄主。一个待测样品所形成的斑点数目除取决于接种物中病毒浓度外，还受试验植物种类、环境条件和接种物中是否含有病毒抑制物质的影响。

淀粉－碘斑法当所研究的病毒没有过敏性枯斑寄主时，采用此法。Holmes（1931）发现TMV接种的烟叶上有时形成明显的黄化斑块，但不能用于计数。将这种接种叶用95％乙醇加热到80℃固定，然后用I2和KI混合液（10克I2，30克KI，1500毫升H2O）染色时，则侵染点处出现淀粉－碘的蓝色反应。当下午采摘叶片，褪色过夜，然后用碘液染色，则侵染点较周围组织着色浅；当采摘叶片前，植株先在黑暗中放几个小时，再用碘液染色，则侵染点组织着色深。这是由于病毒侵染既降低光合组织中碳水化合物的形成，也降低碳水化合物从光合组织中的运出。淀粉－碘染色的强弱受环境条件的影响较大，不如局部枯斑法可靠，但在标准化条件下仍可用于侵染性的定量测定。

侵染性滴度法当上述方法都不适用时，可采用侵染性滴度法。即把欲测定样品用缓冲液稀释，可用十倍稀释、成倍稀释、半倍稀释或更低稀释。这种方法的缺点是需用大量实验

植物，但可得到较好的结果。此方法可用于介体传染的病毒。

1.4.2血清学方法

血清学方法原理是利用抗原抗体的体外特异性结合检测植物病毒。主要包括沉淀反应、凝聚反应、酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫电镜（IEM）、放射免疫测定（RIA）、PCR（聚合酶莲式反应）法等。

沉淀反应将可溶性抗原与相应的抗体混合，当两者的比例合适，并有盐类存在时，即有沉淀物出现，叫做沉淀反应。由于沉淀物主要是由抗体球蛋白所组成，为了保证有足够的抗体，因此试验时通常要稀释抗原，不稀释抗体。

凝聚反应在微生物细胞悬液中，加入含有特异性抗体的血清，有一定浓度的电解质，微生物细胞凝聚成团，叫做凝聚反应。分为直接凝聚反应与间接凝聚反应。由于病毒是可溶性抗原，必须把病毒的抗体先吸附于一种与免疫无关的颗粒表面，然后与相应的抗原结合反应。用于吸附抗体的颗粒有皂土、乳胶、炭末、红细胞等。

酶联免疫吸附试验（Enzyme linked Immunosorbent assay，简称ELISA）将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合,既保持了酶催化反应的敏感性,又保持了抗原抗体反应的特异性,因而极大的提高了灵敏度；同时它又是一种非均相分析过程,即在反应中的每一步之后都有洗涤过程,从而排除了未反应物质的干扰。自1976年Voller和Clark等首次将ELISA应用于植物病毒检测,已形成多种测试方法。常用的方法有有细胞直接法、细胞间接法、竞争法、酶抗酶法、双夹心法（Double sandwich method）、双抗体夹心法（Double antibody sandwich method）测定方式(侯义龙,2000)。这种方法的灵敏度高（可测出1－10纳克/毫升的浓度），特异性强，操作简便，已广泛应用于病毒测定和诊断（盛树力，1978；马德芳等,1981）。

免疫电镜（IEM）是用电镜检测抗体特异性结合于抗原的技术。Anderson等（1961）和Lafferty与Oertelis（1961）发展了这一方法。其灵敏度高于ELISA。

放射免疫测定（RIA）在抗原抗体反应体系中，当同位素标记抗原（Ag*）与有限量的抗体相互作用时，形成有标记抗原的复合物（Ag*Ab）。如下式所示：

Ag*＋Ab Ag*Ab

Ag AgAb

1.4.3 电子显微镜计数

本世纪三十年代初电子显微镜的发明，使我们能够观察到病毒的分子及其细微结构。1940年Kausche和Melcher首次在电子显微镜下观察到烟草花叶病毒的颗粒。电镜技术的建立对病毒学的发展起了巨大的推动作用。

在实际生产过程中，根据病毒的种类与特点的不同，往往需要把几种方法结合起来，就可望建立一套快速、灵敏、准确、高效的水体植物病毒的检测方法。

1.4.4.分子生物学法

分子生物学检测法能够检测病毒的侵染能力。此方法灵敏度最高，能检测到pg级甚至fg级[1ｆｇ(飞克)=1×10-15ｇ]的病毒,特异性强，检测速度快，操作简便，可用于大量样品的检测(侯义龙,2000)。目前,常用的分子生物学方法有核酸分子杂交技术、dsRNA电泳技术、多聚酶链式反应技术等。侯义龙.果树主要病毒RT-PCR检测体系的建立、优化及病毒特异DNA片段克隆测序研究.[博士学位论文].沈阳:沈阳农业大学,2000.6

核酸分子杂交技术具有一定同源性的2条核酸单链在一定的条件下(适宜的温度及离子强度等)可按碱基互补原则退火形成双链。此杂交过程是高度特异性的。杂交的双方是使用的探针和要检测—的核酸。待测核酸可以是克隆的基因片段,也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。根据使用的方法,被检测核酸可以是提纯的(膜上印迹杂交或液相杂交),也可以在细胞内杂交(细胞原位杂交) (卢圣栋，1999)。

双链RNA(dsDNA)电泳技术ssRNA病毒在植物体内增殖,通过核酸互补而形成一种健康植物没有的碱基配对dsRNA。DsRNA经提纯、电泳、染色后,在凝胶上所显示的谱带可以反映每种病毒组群的特异性,并且有些单个病毒的dsRNA在电泳图谱上也显示一定的特征。因此,利用病毒dsRNA的电泳图谱可以检测出病毒的类型和种类（董颖苹,2001；李鹏翔，2000）。此法已用于一些病毒组(如黄化病毒组、马铃薯Y病毒组、番石竹潜病毒组、烟草坏死病毒组、黄瓜花叶病毒组、绒毛烟斑驳病毒组)的分类研究。

多聚酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，是近10年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一(吴乃虎，2000；)。由于它具有强大的扩增能力,并且可与其它分子生物学方法(如核酸杂交)和免疫学方法(如ELISA)相结合应用,使其敏感性和特异性都大大增强；因而广泛地应用于生物医学领域的各个学科（梁国栋，2001）。灵敏度最高, 仪器价格昂贵，试验技术要求高。