[医药]急性毒性试验
对化学药物急性毒性试验的思考
问题： 某些情况下， 用不同剂型来改变活性物质的生 物利用度 （如对胃酸不稳定的药物制成肠溶片） 时，
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对化学药物急性毒性试验的思考
王庆利， 彭 健 （国家食品药品监督管理局药品审评中心， 北京 ! ） " " " # $
［关键词］ 急性毒性试验； 单次给药毒性试验； 半数致死量 ［中图分类号］% ； & ’ ! % & ( ’ ) # ［文献标识码］* ［文章编号］ （ ） ! " " # + # , # . " " ! ! + " & ( ! + " -
［ ，］ ! 经典急性毒性试验及其局限性 "# ! $ ! 经典急性毒性试验及其意义
! $ % 经典急性毒性试验的局限性 经典的急性毒性试验及其 B @ ’ "值的精确测定 曾经是各国药品注册法规的组成部分， 在新药开发 中发挥了重要作用。但随着科学的进步， 越来越多 的新药研发机构和管理当局意识到经典的急性毒性 试验 存 在 局 限 性： " 对 于 上 述 的 绝 大 多 数 目 的， 其可用性十分有限。 B @ ’ "值均不能给予有效的信息， 万方数据
如果可能， 建议采用临床拟用剂型进行试验； 如果使 用创新的辅料， 建议将该辅料作为 ! 种新活性物质 来评价； 如果受试物为复方制剂， 建议进行各成分单 独给药的试验和按复方制剂比例联合给药的试验， 以提示有无增毒作用， 或是否出现新的毒性。此时， 可根据动物和人之间药动学和药效学的差异设计试 验方案； 如果受试物在贮存条件下易发生降解， 建议 考虑评价其降解产物的毒性， 可从急性毒性试验开 始评价。 ! " !
[医药]急性毒性试验
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有毒（LD50 25～ 200）
非啮齿类
（发现毒理学研究）
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4
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5
怎么做？
急性毒性试验的基本要求
※两种动物 ※两种性别 ※两种给药途径
啮齿类 非啮齿类
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6
两种动物：充分暴露受试物毒性, 若未采 用非啮齿类动物进行急性毒性试验，应 阐明其合理性。
两种给药途径：通常，给药途径应至少 包括临床拟用途径和一种能使原形药物 较完全进入循环的途径（如静脉注射）。 如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此 一种途径即可。
个途径 ※如不能静脉给药可改为其它途径
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10
怎么做？
剂量
※化学药物最高剂量 静脉给药：2 g/kg 口服给药：2-5 g/kg
※临床拟用剂量的100-300倍
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11
怎么做？
给药容量：各剂量组应按等容量，不等浓 度的给药原则
最大给药容量：可参考相关的文献
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怎么做？
口服（包括灌胃）给药前通常禁食过夜 （至少小鼠3-4 h），但不禁水，给药后 仍需禁食2-4 h（小鼠1-2 h）
原因： ※胃内容影响给药容积 ※胃内容可能会影响药物的吸收
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13
怎么做？
观察期限
※一般给药后连续观察14天
※如给药第2周内发生动物死亡或出现新的 毒性反应时，应延长观察期限
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怎么做？
观察终点 ※死亡 ※明显毒性征状
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怎么做？
观察指标
※死亡情况 ※体重等一般情况 ※征状（Sign） ※实验室等检查
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19
近似致死计量法
※方法： 选取剂量序列表中的某个区段，每个剂 量（也可每隔一个剂量）给一个动物
急性毒性试验相关要求进展
近年来，急性毒性试验相关法规及指南不断升级，为了更好地保障人类及动 物安全，我们有必要了解并跟进这些变化。
什么是急性毒性试验？
1 定义
通过将化学物质口服、皮肤接触或注入目的动物体内，观察剂量与反应之间的关系，以 确定化学物质对人体的急性毒性。
2 目的
评估化学物质的急性毒性，确定其属性以及对人类及环境的潜在风险，并为毒性评估提 供数据。
急性毒性试验的操作流程
1
试验前
认真阅读试验样品的安全资料，并着手
试验中
2
准备试验用具和设备。
按照指南操作自检，记录实验数据，观
察动物反应情况，检查实验安装。
3
试验后
达到指标要求后，停止试验，处理安全 废料，并对实验数据进行统计分析。
毒性试验的标准剂量的确定
通常标准剂量是根据: • 实验动物的体重 • 化学物质的性质和用途
2
风险评估需要考虑以下因素：
受试动物的种类和数据可信度；药剂和其代谢物的物理化学特性；适用性评估；确定潜在毒 性的作用因素；可能出现的对健康、环境和人体的风险等等。
急性毒性试验的未来发展趋势
基于现有的权威的指南和最佳实践，急性毒性试验已经简化了很多流程，同时丰富了许多新的结构和技术。 • 新的评估方法探索和建立 • 新的替代试验方法探索和推广 • 技术手段的升级和扩充
等数据而计算出的药剂量。以保护动物、人类和环境安全为基础。
毒性试验的分组方法
正常组
于药剂量前和药物注入后，观察 实验动物正常或异常行为。
试验组
涉及注射、口服、皮肤或吸入测 试物体等操作。
对照组
使用无害的溶剂、载体等进行操 作，即“空白试验”。
实验二 经口急性毒性LD50测定
实验二经口急性毒性LD50测定实验二经口急性毒性LD50测定一、试验目的1. 熟悉急性毒性LD50测定的剂量设计2. 掌握小鼠灌胃技术3. 掌握改进寇氏法计算LD50的方法二、试验原理选择健康的实验动物，依据LD50计算的设计原则，将实验动物随机分成数个染毒组和一个阴性对照组。
一次或24小时内多次给予实验组受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。
根据受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。
三、材料和试剂1. 实验动物:健康成年小鼠60只，雌雄各半2. 器材:灌胃针(小鼠适用)、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、分析天平、台秤、外科手术剪、镊子3. 受试物:(敌百虫或克佰威)4. 染色剂:苦味酸酒精饱和溶液、0.5%品红溶液四、实验内容1. 实验动物称重、编号和随机分组2. 染毒剂量设计及试剂配制3. 小鼠灌胃染毒技术4. 毒性反应的观察及LD50计算五、试验方法(一)预实验1. 探索剂量范围先找出100%与0%的致死量(或阳性反应的剂量)为实验的上、下限剂量(Dmax和Dmin)。
据经验或文献定出一个估计量，取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax;如降低一档剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。
以次类推，找出Dmin。
2. 剂量分组一般染毒组数(G)以5-8组为宜，组间剂量比值为r。
在确定组数后，按下列公式计算r。
1/(G-1)r = (Dmax/Dmin) 3. 受试物溶液的配制配制等比浓度的敌百虫溶液，并使每只动物在给药容量上相等(如0.5ml/20g)。
剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6,0.9，设5个剂量组。
简述 药物急性毒性试验研究主要设计要点
简述| 药物急性毒性试验研究主要设计要点急性毒性（Acute toxicity）是指药物在单次或24小时内多次给予后一定时间内所产生的毒性反应。
拟用于人体的药物通常需要进行单次给药毒性试验。
单次给药毒性试验对初步阐明药物的毒性作用和了解其毒性靶器官具有重要意义。
单次给药毒性试验所获得的信息对重复给药毒性试验的剂量设计和某些药物临床试验起始剂量的选择具有重要参考价值，并能提供一些与人类药物过量所致急性中毒相关的信息。
实验设计注意事项01受试物受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并须有研制单位的COA。
来自于市售的辅料、溶媒等应具有相关的说明和规格。
02实验动物年龄| 试验应使用年轻健康成年的动物，如果是儿童用药，必要时采用幼年动物进行试验。
种属| 可根据药代或药效结果选择合适的动物种属，试验应采用至少两种哺乳动物，从多个方面暴露药物动物毒性，选择一种啮齿类和一种非啮齿类动物，如未采用非啮齿类动物进行动物试验，应该说明理由。
性别| 通常采用雌性和雄性动物进行试验，雌雄各半。
若采用单性别动物进行试验，应阐明其合理性。
动物数| 根据研究目的，选择合适的动物数，比如小动物每组动物10只，大动物每组动物4只。
动物数应符合试验方法及其结果分析评价的需要。
体重| 试验中的啮齿类动物初始给药时的每组平均体重差异不应超过或低于平均体重的20%。
03给药途径通常情况下给药途径应至少包括临床拟用途径，或者增加一种能使药物较为完全进入全身暴露的途径如静脉给药。
急性经口给药前啮齿类动物应禁食一段时间，但禁食时间可能会影响暴露量，受到药物代谢酶的活性和受试物肠道内吸收的影响。
04给药剂量水平常用的试验方法有最大给药量法、最大耐受量法、半数致死量法等。
根据不同的试验方法选择合适的剂量，为了充分暴露毒性，高剂量可选择出现严重毒性的给药剂量或达到最大给药量，低剂量可选择未见毒性剂量，同时设空白和/或溶媒（辅料）对照组。
含马钱子中药关节止痛胶囊急性毒性实验研究
含马钱子中药关节止痛胶囊急性毒性实验研究关节止痛胶囊是经卫生行政部门批准的医院制剂，应用于临床治疗风湿、类风湿病已有十多年的历史，其处方组成为：地龙38.5g，马钱子（制）27g，骨碎补11.5g，五加皮11.5g，防己11.5g，乳香（制）11.5g，没药（制）11.5g，红花27g。
由于该制剂处方中含有马钱子，马钱子又名苦实、番木鳖，主要功能为通络止痛，散结消肿。
《医学衷中参西录》提出“其毒甚烈…开通经络，透达关节之力，实远胜于它药也”，主要用于治疗风湿顽痹等症1。
现代医药学文献研究表明，马钱子含多种生物碱，药理作用广泛，主要有效成分也是毒性成分为番木鳖碱和马钱子碱，其毒性剧烈，中毒量与治疗量接近，用之得当可获良效，用之不当往往可引起惊厥、抽搐等中毒反应，甚至危及生命2。
近年来有关马钱子毒性的病例报道不断增多，影响马钱子及其成药的临床安全使用及国际准入，因此，开展有关马钱子及其成药的安全性研究工作以制定国内外公认的保证其安全的控制标准，并严格限定其服用剂量，是提高药品疗效，降低毒性反应的保证。
故对关节止痛胶囊进行了急性毒性实验研究。
急性毒性试验是指受试动物在1次大剂量给药后所产生的不良反应和死亡情况。
药物毒性的大小，常用动物的致死量来表示，因为动物生与死的生理指标较其他指标明显、客观、容易掌握。
致死量的测定也较准确。
在测定致死量的同时，还应仔细观察动物是否出现耸毛、倦卧、耳壳苍白或充血、突眼、步履蹒跚、肌肉瘫痪、呼吸困难、昏迷、惊厥、大小便失禁等不良反应。
致死量的测定常以半数致死量为标准。
半数致死量是指能够引起试验动物一半死亡的剂量，药物致死量对数值，用符号LD50表示。
由于LD50的测定较简便、可靠，而且稳定，现已成为标志动物急性中毒程度的重要常数。
资料与方法药物：关节止痛胶囊：张掖市人民医院制剂室提供，规格1.5g。
仪器：电子天平、水浴锅、2K-82B型电热真空干燥箱等。
动物：昆明种小鼠，由兰州大学医学院动物中心提供。
中药的、天然药物急性毒性研究技术指导原则
中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则二OO五年三月指导原则编号:【Z】G PT 2 -1目录一、概述 (1)二、基本原则 (1)（一）实验管理 (1)（二）具体问题具体分析 (1)（三）试验设计 (2)三、基本内容 (2)（一）受试物 (2)（二）实验动物················································································ (2)（三）试验分组 (2)（四）给药途径 (2)（五）给药容量 (2)（六）观察期限 (3)（七）观察指标 (3)（八）结果处理及分析 (3)四、不同情况的中药、天然药物急毒试验的要求 (4)五、参考文献 (5)六、附录················································································ (5)附录Ⅰ (5)急性毒性试验一般可测定的几个反应剂量附录Ⅱ (7)急性毒性试验的一般观察结果与可能涉及的组织、器官、系统七、著者 (8)中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则一、概述急性毒性是指动物一次或24小时内多次接受一定剂量的受试物，在一定时间内出现的毒性反应。
苯甲酸钠的急性毒性实验
防腐剂苯甲酸钠的急性毒性试验研究摘要: 本研究采用小鼠急性经口毒性试验方法对食品防腐剂苯甲酸钠进行了食品安全毒理学检测，结果显示：1、小鼠急性经口毒性试验：苯甲酸钠对小鼠经口的LD_(50)为2512mg／kg。
结论：根据急性毒性分级标准，苯甲酸钠毒性为3级，属于低毒物质。
中毒症状出现的时间与灌胃剂量存在直接线性关系：剂量越大，死亡就越快，死亡率就越高.。
关键字：苯甲酸钠急性毒性引言：1、苯甲酸钠的用途:主要用作食品防腐剂，汽水、果汁等所有的饮料和绝大部分的食品如蛋糕、果脯、肉松、肉干等都使用没有苯甲酸钠的话，食品中微生物很快生长繁。
也用于医药工业和植物遗传研究，也用作染料中间体、杀菌剂，也可作为饲料的防腐剂、医药工业的杀菌剂、染料工业的媒染剂、塑料工业的增塑剂，也用作香料等有机合成的中间体。
2、急性毒性实验：急性毒性试验是指一次或24小时每多次染毒的试验，是毒性研究的第一步。
要求采用啮齿类或非啮齿类两种动物。
通常为小鼠或大鼠采用经口、吸入或经皮染毒途径。
急性毒性试验主要测定半数致死量（浓度），观察急性中毒表现，经皮肤吸收能力以及对皮肤、粘膜和眼有无局部刺激作用等，以提供受试物质的急性毒性资料，确定毒作用方式、中毒反应，并为亚急性和慢性毒性试验的观察指标及剂量分组提供参考。
实验动物染毒方法之一：经口染毒其接触目的是研究外来化合物能否经胃肠道吸收及求出经口接触的致死剂量(LD50)等。
灌胃是将液态受试化合物或固态、气态化合物溶于某种溶剂中，配制成一定浓度，装入注射器等定量容器，经过导管注入胃内。
在每一试验系列中，同物种实验动物灌胃体积最好一致，即以单位体重计算所给予的毫升数应一致，即ml/kg或ml/g计。
这是因为成年实验动物的胃容量与体重之间有一定的比例。
按单位体重计算灌胃液的体积，受试化合物的吸收速度相对较为稳定。
小鼠一次灌胃体积在0.2~1.0ml/只。
二、实验材料1、实验试剂（1）苯甲酸钠溶液150m g／ml。
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怎么做？
观察期限
※一般给药后连续观察14天
※如给药第2周内发生动物死亡或出现新的 毒性反应时，应延长观察期限
怎么做？
观察终点
※死亡
※明显毒性征状
怎么做？
观察指标 ※死亡情况 ※体重等一般情况 ※征状（Sign） ※实验室等检查
症状(symptom)
怎么做？
病理指标 ※病理学检查 ●所有动物（计划处死、濒死、死亡）都 应进行大体解剖 ●大体解剖发现异常时应进行组织病理学 检查
※5000 mg/kg剂量水平限度试验 ●方法：
①
存活
②
③
全存活
结束
④ ⑤
非全存活
●结果判断：同2000
mg/kg
上下法—主实验
※动物数：10只左右 ※剂量序表 ● 1.75、5.5、17.5、55、175、550、 2000 mg/kg
●
1.75、5.5、17.5、55、175、550、 1750、5000 mg/kg
半数致死剂量法（LD50）
经典的急性毒性实验方法
※LD50值的意义 ●用于比较药物毒性大小 ●用于计算TI（治疗指数）LD50/ED50 ●为设置I期临床试验的起始剂量提供依据
LD50法
※LD50法的不足 ●动物用量大 ●观察重点—死亡 ● LD50值受较多因素的影响，差别可达 2.44∼8.38倍 ● LD50的意义不如NOAEL和MLD
怎么做？
动物选择 种类
※对受试物敏感的动物 ※啮齿类和非啮齿类各一种 ※非啮齿类动物种类应与长期毒性试验一 致
怎么做？
动物选择 年龄 ※通常选用健康成年动物 小鼠 5-6周龄 大鼠 6-8周龄 犬 6-8月龄 猴 3-4岁 ※拟用于儿童的药物可选用幼年动物
怎么做？
给药途径
※如临床拟用静脉给药则可仅此一种途径 ※一般采用临床给药途径加上静脉给药两 个途径 ※如不能静脉给药可改为其它途径
500 mg/kg
存活 死亡
2000 mg/kg 存活 50 mg/kg 50和500的中间剂量
死亡
5 mg/kg
固定剂量法
※预试
●两剂量间隔至少24小时
●观察期至少7天
固定剂量法
※正式实验
●动物：至少10只，雌、雄各半
●剂量：根据预试，选择可产生明显毒性
但不引起死亡的剂量
固定剂量法
※正式实验 ●结果判断
LD50法
※观察—观察期14天 ●观察重点：死亡 ●体重 ●征状 ※结果：分性别根据各剂量组的死亡率用 Bliss法计算LD50
固定计量法
●动物：首选大鼠 ●剂量：5、50、500和2000
mg/kg ●观察终点：明显的毒性反应 ●实验： 预试 正式实验
固定剂量法
※预试 ●动物：雌性，每次1只 ●剂量：根据资料选择初试剂量或
最大给药量法（限度试验）
※适用条件 ●在合理的最大给药浓度和合理的最大给 药容量的条件下仍达不到上述剂量要求 ●更高的剂量所产生的信息不具有更进一 步的价值
最大给药量法
※方法 ●一般使用10-20只动物 ●连续观察14天 ※结果 ●无动物死亡—MLD大于限度剂量 ●动物死亡<50%--LD50>限度剂量 ●动物死亡>50%需要重新设置限度剂量或改用其 他方法
怎么做？
剂量 ※化学药物最高剂量 静脉给药：2 g/kg 口服给药：2-5 g/kg ※临床拟用剂量的100-300倍
怎么做？
给药容量：各剂量组应按等容量，不等浓 度的给药原则 最大给药容量：可参考相关的文献
怎么做？
口服（包括灌胃）给药前通常禁食过夜 （至少小鼠3-4 h），但不禁水，给药后 仍需禁食2-4 h（小鼠1-2 h） 原因： ※胃内容影响给药容积 ※胃内容可能会影响药物的吸收
（发现毒理学研究）
怎么做？
急性毒性试验的基本要求
※两种动物 ※两种性别 ※两种给药途径
啮齿类 非啮齿类
两种动物：充分暴露受试物毒性, 若未采 用非啮齿类动物进行急性毒性试验，应 阐明其合理性。 两种给药途径：通常，给药途径应至少 包括临床拟用途径和一种能使原形药物 较完全进入循环的途径（如静脉注射）。 如果临床拟用途径为静脉给药，则仅此 一种途径即可。
累积剂量法
※结果 ●无动物死亡：MLD（minimum lethal dose 最小致死剂量）和LD50大于最高剂量 ●某一剂量动物全部死亡：MLD和LD50在该 剂量和前一剂量间 ●某一剂量动物部分死亡，MLD在该剂量和 前一剂量间，LD50位于首次出现死亡和全 部动物死亡的剂量间
累积剂量法
※结果 ●如无动物死亡，常以最高剂量给予动物 5-7天，以确定后续的重复给药试验中高 剂量的选择
上下法—主实验
※给药，每次一只动物给药
※起始剂量：序表中低于但接近LD50估计 值的剂量，或从175 mg/kg开始 ※剂量变化：动物存活，下一动物给予高 一档的剂量，反之，给药低一档的剂量， 给予低一档的剂量
上下法—主实验
※停止实验标准 满足以下标准之一可停止实验 ●连续3只动物存活 ●任意6只动物中有5只连续发生存活/死亡， 轮换
用2000 mg实 验
上下法（阶梯法）
※主要用于： ●口服化学药物的急性毒性试验 ●动物死亡发生于给药后1～2天内的药物 ※优点：节省动物
上下法
※动物 ●种类：啮齿类，一般选用大鼠 ●性别：单一性别，一般选用雌性 ●周龄：实验时8～12周 ※实验 ●限度实验：适用于毒性可能较小的受试物 ●主实验：适用于估计有明显毒性的受试物
LD50法
※动物 ●种类：小鼠 ●体重：18∼22 g/只 ●分组：一般6组 ●每组动物数：10∼20只（每组动物数相等） ●性别：雌、雄各半
LD50法
※剂量组 ●最高剂量：达到或接近使动物100%死亡 ●最低剂量：达到或接近动物0%死亡 ●中间设3个剂量组 ●另设对照组
LD50法
※剂距：0.60∼0.90，常用0.70 ∼0.8 各组间成等比级数 ※给药容量：0.2 mL／10gBW 灌胃最大容量可达0.8 mL/只
上下法—主实验
※结果： 用该方法的LD50计算软件计算LD50
累积剂量法（金字塔法）
※动物 ●种类：非啮齿类 ●数量：8只 ●性别：雌、雄各半 ●分组：分对照、给药2组 ※观察终点：死亡
累积剂量法
※剂量： 1、3、10、30、100、300、1000、 3000 mg/kg 或10、20、40、80、160、320、640、 1280 mg/kg ※方法： 从低剂量开始，隔日给予下一剂量， 直至动物死亡
上下法—限度实验
※2000 mg/kg剂量水平限度试验
●动物数：最多5只
●方法：每次1只动物给药，量动物间隔
48h，给药后观察14d
上下法—限度试验
※2000 mg/kg试验 ●结果 X OOO OXOXX OOXO OXXX OXXOO : : 进入主实验 LD50>2000 mg/kg
上下法—限度试验
急性毒性试验 （单次给药毒性试验）
定
义
研究动物一次或在24小时内多次 给予受试物后，一定时间内所产 生的毒性反应。
目
的
※观察药物毒性及其毒性靶器官 ※为其它安全性试验的剂量和观察项目的 设计提供信息 ※为I期临床起始剂量的设计提供信息
什么时候进行？
※药物安全性研究中首先进行的试验 ※啮齿类 非啮齿类
剂量 存活<100% 存活100%毒 性明显 存活100%无 明显毒性 5 50 500 2000 用500 mg实 验 无严重急性 毒性危险性 高毒 有毒或高毒用 有毒或有毒 （LD50≤ 25） 5 mg实验 用50 mg实验 有毒（LD50 25～ 200） 用50 mg实验 有害 （LD50 200～ 2000） 用于500 mg 实验 LD50 >2000
近似致死剂量法
※动物 ●种类：非啮齿类 ●数量：一般6只 ※观察终点：死亡
近似致死剂量法
※剂量： 根据文献和啮齿类动物急性毒性试验结 果，估计可能出现明显毒性反应到发生 死亡的剂量范围，按50%递增法列出剂量 序列表
近似致死计量法
※※结果： 近似致死剂量范围—最高非致死剂量与 最低致死剂量间的范围