实验二 经口急性毒性试验
毒理学实验技术总结
毒理学实验技术总结毒理学是一门研究外源化学物、物理因素和生物因素对生物体产生有害作用的科学。
而毒理学实验技术则是研究这些有害作用的重要手段。
通过一系列的实验操作和观察，我们能够评估物质的毒性、确定安全剂量范围，为保护人类健康和环境安全提供科学依据。
接下来，让我们详细了解一下毒理学实验技术。
一、急性毒性实验急性毒性实验是毒理学中最常见的实验之一，其目的是测定化学物质在短时间内（通常为 24 小时至 14 天）对生物体造成的损害。
实验通常采用两种方法：经口急性毒性实验和经皮急性毒性实验。
经口急性毒性实验是将化学物质以特定的剂量灌胃给予实验动物，然后观察动物在短期内出现的中毒症状和死亡情况。
通过计算半数致死剂量（LD50）来评估物质的毒性强度。
LD50 越小，说明物质的毒性越强。
经皮急性毒性实验则是将化学物质涂抹在动物的皮肤上，观察其对皮肤的刺激性以及可能产生的全身性毒性反应。
在进行急性毒性实验时，需要严格控制实验条件，包括实验动物的种类、年龄、体重、性别等，以及化学物质的给予方式和剂量。
同时，要对实验动物进行密切观察，记录其症状出现的时间、严重程度和持续时间等。
二、亚慢性和慢性毒性实验与急性毒性实验不同，亚慢性和慢性毒性实验的观察周期较长。
亚慢性毒性实验的观察期通常为 90 天左右，而慢性毒性实验则可能持续一年甚至更长时间。
这些实验旨在评估化学物质在长期低剂量暴露下对生物体产生的潜在危害，如对器官功能的影响、致癌性、致畸性等。
实验过程中，需要定期监测实验动物的体重、饮食、行为、血液生化指标等，并在实验结束时对动物进行解剖，检查各个器官的病理变化。
三、遗传毒性实验遗传毒性实验用于检测化学物质对生物体遗传物质的损害作用，包括基因突变、染色体畸变和 DNA 损伤等。
常见的遗传毒性实验方法有：1、细菌回复突变实验（Ames 实验）：通过检测化学物质对细菌基因突变的诱导作用，来评估其遗传毒性。
2、微核实验：观察细胞中微核的形成，以判断化学物质是否导致染色体损伤。
急性经口毒性试验
二、急性经口毒性试验Acute Oral Toxicity Test1 范围本规范规定了动物急性经口毒性试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料安全性毒理学检测。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals ( No. 401, Feb. 1987 )USEPA OPPTS Harmonized Test Guidelines （Series 870.1100, Aug. 1998 )3 试验目的急性经口毒性试验是评估化妆品原料毒性特性的第一步，通过短时间经口染毒可提供对健康危害的信息。
试验结果可作为化妆品原料毒性分级和标签标识以及确定亚慢性毒性试验和其它毒理学试验剂量的依据。
4 定义4.1 急性经口毒性(Acute oral toxicity)：一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的健康损害效应。
4.2 经口LD50（半数致死量，Medium lethal dose）：经口一次给予受试物后，引起实验动物总体中半数死亡的毒物的统计学剂量。
以单位体重接受受试物的重量(mg/kg或g/kg)来表示。
5 试验的基本原则以管饲法经口给予各试验组动物不同剂量的受试物，每组用一个剂量，染毒剂量的选择可通过预试验确定。
染毒后观察动物的毒性反应和死亡情况。
试验期间死亡的动物要进行尸检，试验结束时仍存活的动物要处死并进行尸检。
本方法主要适用于啮齿类动物的研究，但也可用于非啮齿类动物的研究。
6 试验方法6.1 受试物受试物应溶解或悬浮于适宜的介质中，建议首选水，其次是植物油(如玉米油)，或考虑使用其它介质（如羧甲基纤维素、明胶、淀粉等）。
对非水溶性介质，应了解其毒理特性，否则应在试验前先确定其毒性。
每次经口染毒液体的最大容量取决于实验动物的大小，对啮齿类动物所给液体容量一般为1mL/100g，水溶液可至2mL/100g。
通过调整受试物溶液浓度使各剂量组经口染毒的容量一致。
《食品毒理学》经口急性毒性试验
《食品毒理学》经口急性毒性试验一、实验目的和要求掌握给药方法；了解一次或24小时内多次给予受试化学物后，动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因，观察受试动物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死量。
二、主要仪器设备实验动物：成年昆明系实验小鼠（SPF级别）。
器材：注射器（0.25，1，2，5ml）、吸管（0.1，0.2，0.5，1，2，10ml）、容量瓶（10，25，50ml）、烧杯（10，25，50ml）、滴管、灌胃针12号、动物体重秤、解剖剪刀、镊子、手术手套，口罩。
试剂：受试化合物（氯化钡溶液，20mg/mL）。
三、实验原理氯化钡是强电解质，可完全电离出钡离子，导致钡离子在小鼠血液内部引发急性低钾血症，故小鼠会出现肌无力和发作性软瘫，心肌应激性减低，各种心律失常和传导阻滞，由于肌无力，严重中毒的小鼠还会出现呼吸困难乃至死亡等症状。
四、实验内容1．健康动物的选择和性别鉴定。
2．实验动物称重、编号和随机分组。
3．受试化学物溶液的配制。
4．小鼠灌胃操作技术。
（1）预实验，取小白鼠、称重、随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液，摸索小鼠接近100%和0%死亡的剂量范围。
（2）小鼠随机分为5组，每组3只，以灌胃的方式给予等体积、不同剂量的氯化钡溶液。
小鼠灌胃法：将钝头的12号注射针（适用于小鼠），安装在适当容积的注射器上，吸取所需的受试物溶液，左手抓住动物双耳后至背部的皮肤（小鼠仅抓住耳后、颈部的皮肤，用无名指、小手指和大鱼际肌将其尾根部压紧），将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者。
注意使动物的上消化道固定成一直线。
右手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑人食管。
若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，一旦感觉阻力消失，即可深入至胃部。
如遇动物挣扎，应停止进针或将针拔出，千万不能强行插入，以免操作穿破食管，甚至误人气管，导致动物立即死亡。
经口急性毒性试验.
大小鼠标记方法（单色法n>10）
双 色 法
大小鼠标记方法（双色法n<10）
红色表示十位数： 头部染红色为10
左前肢为20
左腰部为30 黄色表示个位数。 大小鼠标记方法（双色法n>10）
其它标记方法
烙印编号法：
体内埋号编号法：
耳孔编号法：
挂牌编号法：
实验动物的随机分组
表1 动物随机分组表 动物号 随机数字 除6余数 分组 动物号 随机数字 除6余数 分组 1 97 1 A 16 27 3 C 2 74 2 B 17 7 1 A 3 24 0 F 18 36 0 F 4 67 1 A 19 7 1 A 5 62 2 B 20 51 3 C 6 42 0 F 21 24 0 F 7 81 3 C 22 51 3 C 8 14 2 B 23 79 1 A 9 57 3 C 24 89 5 E 10 26 2 B 25 73 1 A 11 42 0 F 26 16 4 D 12 53 5 E 27 76 4 D 13 32 2 B 28 62 2 B 14 37 1 A 29 27 3 C 15 32 2 B 30 66 0 F
组 别 A B C D 1 2 7 26 4 5 9 27 14 8 16 鼠 号 17 10 20 19 13 22 23 15 29 25 28
E
F
12
3
24
6 11 18 21 30
具体方法如下：继续抄下随机数字分别除以A、B、C、F组的现有动物数，即： 56/7(7为A组现动物数)整除，余数为0，将A组第7只动物(25号)调配给D组；下一 个：50/6(6为A组现有动物数)余2，将A组第2只动物(4号)调配给D组；接下来 26/6(6为C组现有动物数)余2，将C组第2只动物(9号)给D组。余类推，最后调整
实验二-经口急性毒性试验-Acute-Oral-Toxicity
实习内容
试验动物的选择和性别鉴定。
试验动物的称重、编号以及随机分组方法。 急性毒性试验常用染毒途径和方法。
急性毒性反应的观察和LD50计算。
实验材料
(一) 实验动物：健康成年小鼠或大鼠若干只。
(二) 器材 注射器(O.25，1，2，5ml)、吸管(0.1，0.2，0.5，1，2，
10m1)、容量瓶(10，25，50ml、烧杯(10，25，50ml)、滴管、
灌胃针(大鼠、小鼠适用)、电子天平(感应量1/10000g)、动物 体重秤、外科剪刀、镊子。
(三) 试剂
受试化学物为氟化钠(NaF，分析纯)，苦味酸酒精饱和液 或其它染色剂。
实验动物的选择(提问)
实验动物的性别鉴定
♀
♂
分组成表3所示。雌性动物也按上法分组，然后将雌、雄动物合组进行试验。
表3 调配后30只动物随机分组
组别 A 1 14 鼠号 17 19 23 组别 D 4 9 鼠号 25 26 27
B
C
5
7
8
16
10
20
13
22
15
29
E
F
2
3
6
11
12
18
24
21
28
30
实验动物染毒途径和方法（示教）
常用的染毒途径： 经口染毒 经呼吸道染毒
面向自己,沿着门牙左 边滑入
气管
By LASCO
食道
经皮染毒
注射途径染毒
吸收速率：
静脉注射>吸入染毒>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射> 经口染毒>皮内注射>其他染毒途径如经皮等
受试物的配制
实验二 经口急性毒性LD50测定
实验二经口急性毒性LD50测定实验二经口急性毒性LD50测定一、试验目的1. 熟悉急性毒性LD50测定的剂量设计2. 掌握小鼠灌胃技术3. 掌握改进寇氏法计算LD50的方法二、试验原理选择健康的实验动物，依据LD50计算的设计原则，将实验动物随机分成数个染毒组和一个阴性对照组。
一次或24小时内多次给予实验组受试物后，观察动物所产生的急性毒性反应及其严重程度，中毒死亡的特征以及可能的死亡原因。
根据受试物毒性反应与剂量的关系，求出半数致死剂量(LD50)，并根据LD50值将受试物进行急性毒性分级。
三、材料和试剂1. 实验动物:健康成年小鼠60只，雌雄各半2. 器材:灌胃针(小鼠适用)、注射器、吸管、容量瓶、烧杯、滴管、分析天平、台秤、外科手术剪、镊子3. 受试物:(敌百虫或克佰威)4. 染色剂:苦味酸酒精饱和溶液、0.5%品红溶液四、实验内容1. 实验动物称重、编号和随机分组2. 染毒剂量设计及试剂配制3. 小鼠灌胃染毒技术4. 毒性反应的观察及LD50计算五、试验方法(一)预实验1. 探索剂量范围先找出100%与0%的致死量(或阳性反应的剂量)为实验的上、下限剂量(Dmax和Dmin)。
据经验或文献定出一个估计量，取动物若干，每4只一组，按估计量给药，如出现4/4死亡时，下一组剂量降低，当出现3/4死亡时，则上一剂量为Dmax;如降低一档剂量出现的死亡率2/4或1/4时，应考虑到4/4死亡剂量组在正式实验时可能出现死亡率低于70%，为慎重起见可将4/4死亡剂量乘以1.4倍，作为Dmax。
以次类推，找出Dmin。
2. 剂量分组一般染毒组数(G)以5-8组为宜，组间剂量比值为r。
在确定组数后，按下列公式计算r。
1/(G-1)r = (Dmax/Dmin) 3. 受试物溶液的配制配制等比浓度的敌百虫溶液，并使每只动物在给药容量上相等(如0.5ml/20g)。
剂量按等比级数增减，相邻两剂量比值1:0.6,0.9，设5个剂量组。
乙醇小鼠急性经口毒性评价
六、急性毒性分级和评价：
急性毒性试验求出LD50(LC50）值，通过LD50(LC50）值进行 急性毒性分级，评价化学物的急性毒性强弱，比较化学物的 急性毒性大小。 联合国世界卫生组织（WHO）推荐了一个5级标准。
表3-1
WHO急性毒性分级
我国2003年颁布实施的《食品安全性毒理学评价程序和方法》中 提出急性毒性分级的6级标准
四、霍恩氏(Horn)法
原理：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Horn氏法，又叫平均移动法、剂量递增法，是利用剂 量对数与死亡率(反应率)的转换数(即机率单位)呈直线 关系而设计的方法。
100%
Mortality %
Probit Units
Cumulative distribution
Probit transformed
7 5
50
LD50
0
Log Dose
3
Straight line (easier to analyze)
Log Dose
设 计 原 则:
4个剂量组； 每组动物数相等； 每组5只； 剂量可选用两个剂量系列，其组距分别为2.15倍和3.16 倍。 查表求LD50及其95％可信限。
霍恩氏（Horn）法LD50值计算用表
用5个剂量时，
LDk的可信限= log-1(logLDk + 1.96 S ) (P=0.95) X ----为对数剂量； i-----为相邻两组剂量比值（以高剂量组为分子）的对数； y-----为死亡率相应的机率单位（查附表）； 1、2、3、4、5…为小剂量组到大剂量组的顺序。 yK----为LDk所相当的反应率的机率单位 W----为权重系数（查表）
0.0 0.2 0.5 0.7 0.9 1.59
经口急性毒性试验
实验动物编号标记方法
① ○ ⑧ ②
⑦ ⑨ ③
● ⑥ ⑤ ④
标记部位和对应 的号码
48号鼠标记方法 48号鼠标记方法 ●表示十位 ○表示个位
实 验 步 骤
实验动物 预实验
确定大致的 LD0和LD100
秤体重
编号
分组
组数和剂量 （随机数字表法） 随机数字表法）
灌胃操作
中毒症状观察和死亡纪录
计算LD 计算LD50
体重记录(g)
组 染毒剂量 动物编 性 体重 染毒 别 (mg/kg) 号 别 (g) 时间
……
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
计算LD 计算LD50
（寇氏法） 寇氏法）
lgLD50=1/2Σ(Xi + Xi+1)(Pi+1 - Pi) Σ(X i+1 i+1
式中: 式中:（Xi + Xi+1）为相邻两个试验组剂量之和 为相邻两组死亡率之差。 (Pi+1 - Pi)为相邻两组死亡率之差。
确定组距的方法 确定组距的方法
lgLD100 – lgLD0 d = n-1 式中： 式中： d：为组距 n：为设计时确定的剂量组数
急性毒性实验记录
受试物 名称： 提供单位： 动物种属品系： 动物来源： 相对湿度： 染毒剂量： mg/kg 合格证号：
症状 死亡 及出现时间 时间
染毒途径： 室温：
实验目的
1.掌握化学物毒性评价试验方法 1.掌握化学物毒性评价试验方法 2.掌握经口灌胃技术 2.掌握经口灌胃技术 3.学习中毒症状观察方法。 3.学习中毒症状观察方法。 学习中毒症状观察方法
材料和试剂
•实验动物：健康小鼠 实验动物： 实验动物 •器 器 材： 小鼠灌胃针、 小鼠灌胃针、电子天平 动物体重计、 动物体重计、外科剪刀和镊子 •试 试 剂：受试物
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
毒理学实验二经口急性毒性试验
一、实验目得
1、掌握实验动物分组方法
2、测定LＤ５０得试验设计原则
3、小鼠得经口灌胃技术
二、试剂与材料
1、实验动物:
(1)动物品种:健康成年IＣR小鼠,体重18g～22g
(2)样品来源:首都医科大学实验动物部
2、器材:注射器(1ml)、灌胃针头、烧杯、吸管、容量瓶、烧杯、棉签、动物秤。
3、试剂:敌敌畏(1400mg/ｍｌ)、苦味酸染液(标记用)。
三、实验内容
1、健康实验动物得选择与性别鉴定
选择健康得雄性小鼠(健康标准:毛顺、毛顺、无分泌物、反应敏锐。
动物出现圆圈动作可能为中耳炎,废弃。
)
肛门与生殖孔距离:大者为雄性,小者为雌性
2、实验动物称重、编号与随机分组
选择体重在1８-22 g得小鼠,采用随机分组得方法(动物按体重分为几个体重段,再从每个体重段分出各组动物),每组10只小鼠,用黄色得苦味酸饱与液标号１
~9,10号小鼠不标记、
3、受试化学物溶液得配制
(1)确定灌胃量:0、１mｌ/10ｇ
(2)确定最高给药量,计算溶液浓度,估计给药总体积
(3)药品称量及稀释
4、小鼠灌胃技术
左手固定,右手持灌胃器,插入动物口腔,沿咽后壁徐徐插入食道,深度为口腔至剑突得距离。
5、毒性体征得观察与LＤ５０计算
(１)毒性体征得观察:
染毒后注意观察小鼠中毒得发生、发展过程及死亡数与死亡时间
按表格记录动物体征及出现时间,记录死亡情况及时间,观察期为３0 min （2）ＬD５０得计算:
ａ、实验各组剂量得确定:设5组,每组雌雄动物各10只。
剂量组距 d 为:
ｄ为相邻两个剂量组剂量对数之差
利用lgLD０依次加d,取反对数,即可得出各组剂量。
b、LD5０得计算(见附件):
C、求半数致死量得9５%可信区间
四、实验过程
1、人员分工:本次实习同学分两个大组(A组与B组),分别在不同实验室。
每大组分5个小组,分别处理雌雄动物,每小组10只动物。
集体活动:１、2、3、4、5 组各1人,进行受试物配制、
各小组活动:
每小组1人(共4人),进行动物标记。
(１—1０号)
每小组1人(共４人),进行体重记录、(1—１0号)
每小组１人(共4人),进行灌胃。
(1－10号)
每小组１人(共4人),根据体重吸取受试物(０。
1ml/10g)
五、剂量设计及受试物配制表
见附件
六、实验结果
１、急性经口毒性试验原始记录(见附件)
2、LD50计算表(见附件)
3、结果计算(按照ppt中所给得剂量设计及受试物配制表计算)
＝(lｇ500—lg100)÷4=(０.6990－2)÷4＝０、1747
=0.１７47×=0.031６
＝２、1747-1/２×((0+0.35)+(0、3５+0、2)+(０.2+0。
65)+(0。
65+１))
=1。
８777
即:65、4３35～87。
0162ｍg/Kg
七、实验结论与分析
1、毒性物质敌敌畏为中等毒性,体重在18～２2ｇ之间得雄性健康成年IＣR小鼠(来源于首都医科大学实验动物部)经口急性染毒得为6５、43３5～８7。
0162ｍg/Ｋｇ、
2、毒性特征:小鼠在经口染毒后短时间内出现抽搐,躁动不安,麻痹,肌张力松弛,反应减弱,同时伴有呼吸加快,口吐白沫,鼻孔溢液,尿失禁,腹泻等症状,然后在１0分钟左右死亡。
3、本组小鼠为径口染毒得最低剂量,没有出现死亡小鼠,观察过程中,6号小鼠出现亢奋,8号小鼠出现腹泻症状、
4、经过上述症状,可以瞧出敌敌畏急性毒性包括中枢神经系统与躯体感觉与运动系统毒性,呼吸系统毒性,消化系统毒性,泌尿毒性、。